蜜蜂白垩病PCR快速检测方法的建立及初步应用

根据Genebank网站公布的蜜蜂球囊菌ITSl.5.8s,ITS2 rDNA保守序列(U68313)设计出一对特异性引物ASCU和ASCD,可特异性的扩增蜜蜂球囊菌ITSI,5.8srRNA,ITS2序列上大小为471 bp的片段.优化了PCR最佳反应条件和体系;特异性试验结果表明与蜜蜂幼虫芽孢杆菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂败血杆菌无交叉反应,具有良好的特异性.敏感性试验结果表明敏感性可达7CFU/mL的蜜蜂球囊菌.通过将定量的蜜蜂球囊菌添加到蜂蜜、花粉、蜂胶和蜂王浆等蜂产品中进行模拟检疫,结果显示所建立的PCR检测方法适用于上述蜂产品中蜜蜂球囊菌的检疫.该方法与病原菌分离培养等传统检疫方法相比较,具有快速、灵敏、特异等优点,可用于蜜蜂及蜂产品中白垩病的进出口检疫及快速诊断.     

多杀性巴氏杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种多杀性巴氏杆菌(Pm)快速敏感的检测方法,本实验根据Pm70株kmt1基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了该菌的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并优化了检测反应条件。本实验建立的荧光定量PCR方法可以特异性检测Pm,而对鸭疫里默氏杆菌、支气管败血波氏杆菌等菌株检测结果均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。该方法对C48-1株标准品的检测灵敏度为1.75×10~1拷贝/μL,优于常规PCR检测方法(1.75×10~3拷贝/μL) 100倍;组内和组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性。对20份疑似感染的临床病料样品(鸡肝脏、牛肺脏)进行增菌培养和分离鉴定,结果分离到8株多杀性巴氏杆菌;以建立的荧光定量PCR方法与常规PCR方法对增菌培养液进行检测,阳性率分别为40%(8/20)和25%(5/20),且荧光定量PCR方法与常规细菌分离鉴定的符合率为100%。对C48-1株感染致死的20份小鼠肝脏和脾脏组织研磨液进行检测,阳性率均为100%。本研究建立的方法能够快速、敏感的检测Pm,对于其临床和实验室的快速诊断具有重要意义。     

分子技术在蜜蜂白垩病病原鉴定和诊断上的应用

蜜蜂白垩病是一种由球囊菌属（Ascosphaera）的真菌寄生而引起蜜蜂幼虫死亡的传染性疾病，对蜂群的群势发展影响极大，近几年又呈现出大面积爆发的趋势。但目前对于该病的诊断和病原鉴定多依赖于典型症状，方法极不可靠。本文介绍了可用于分子鉴定和诊断的的研究基础，探讨利用球囊菌属的各病原rDNA的ITS1—5．8S-ITS2序列资料，分别设计出高特异性引物，用PCR技术扩增出可用于鉴定病原物种的分子标记，从而构建一套快速、准确诊断该病的分子技术。     

蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

为建立蜜蜂幼虫芽孢杆菌(P.larvae)荧光定量PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中幼虫芽孢杆菌16S r RNA基因保守序列设计特异性引物和探针,经反应体系及条件优化,建立了检测P.larvae Taq Man荧光定量PCR方法。结果表明:该方法与其它病原无交叉反应;最低可检出1.3×10拷贝/μL的阳性质粒,比普通PCR灵敏度高100倍;重复试验显示该方法的批内和批间变异系数均小于3%。应用该方法对50份实验室模拟样品和100份临床样品进行了检测,与预期结果一致。本研究建立的方法可用于美洲幼虫腐臭病(AFB)的早期快速检测及P.larvae定量分析。     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

根据沙门菌保守的fimY基因序列设计合成了引物和TaqMan探针，建立了快速检测沙门菌的实时荧光定量方法，并对反应条件进行了优化，组装成快速检测试剂盒。通过对临床样品的检测，该试剂盒的检测灵敏度达4.5CFU（25μL反应体系），比常规PCR高100倍，而且稳定性良好，至少可以冷冻保存9个月。结果表明，所建立的沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点，适于大量样品的检测。     

布氏杆菌和结核杆菌二重实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

本试验旨在利用二重实时荧光定量PCR技术建立鉴别诊断布氏杆菌和结核杆菌的方法。通过筛选布氏杆菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和结核杆菌cfp10基因的最佳引物组合,建立二重实时定量PCR鉴别诊断方法,对该方法进行稳定性、特异性和敏感性试验,并对临床样品及模拟样品进行检测。经筛选布氏杆菌的omp25基因与结核杆菌cfp10基因引物组合最佳,该二重实时荧光定量PCR方法中布氏杆菌Tm值为88～89℃,结核杆菌Tm值为90～91℃,对其他供试的菌株则为阴性;该方法对布氏杆菌的DNA最低检出量为20拷贝.μL-1,结核杆菌为50拷贝.μL-1,两病原都存在时为100拷贝.μL-1,比常规PCR高100倍。利用所建立的二重荧光定量PCR方法及常规PCR,对24份结核痰样、11份布氏杆菌基因粗提物及30份模拟奶样进行检测,符合率为100%。本试验建立的方法可用于同时检测布氏杆菌和结核杆菌,并且具有良好的特异性、敏感性和稳定性。     

Taq Man探针实时荧光PCR方法检测黑蜂王台病毒的方法建立和应用

为了建立实时荧光PCR方法以检测蜜蜂黑蜂王台病毒,试验依据Taq Man荧光标记探针技术原理,针对蜜蜂黑蜂王台病毒编码衣壳蛋白的保守序列区域,设计出1对特异性引物和1条探针,建立了一种快速检测黑蜂王台病毒(BQCV)的荧光PCR方法,对2005年从12省收集到的18种蜜蜂病料进行检测,确定各地区感染BQCV情况。结果表明:该方法对蜜蜂黑蜂王台病毒有较好的特异性,与其他蜜蜂病毒之间均无交叉反应;检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL阳性质粒,可对低病毒含量的样品进行准确检测;变异系数为1.3%;应用该方法对2005年从12省收集到的18种蜜蜂病料进行检测,4 h内即可报告检测结果。说明该方法具有快速、灵敏、特异及重复性好等优点,适用于蜜蜂中黑蜂王台病毒的快速检疫。     

炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测技术的建立和应用

为快速和准确检测炭疽杆菌,本研究以炭疽杆菌染色体上的BA5345基因和pXO1质粒上的PA基因为靶基因设计特异性引物和探针,建立了炭疽杆菌双重荧光定量PCR检测方法,对其反应的特异性、敏感性和重复性进行了分析,并与常规PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示,所建立方法特异性强,与蜡样芽胞杆菌群中其他芽胞杆菌无交叉反应;对BA5345基因和PA基因的最低检测限分别为8.0和7.8拷贝·μL~(-1),标准曲线相关系数大于0.99,组内和组间CV均小于1.5%。对35份污染皮毛样品检测显示BA5345基因和PA基因的检出率分别为80.0%和82.9%,与常规PCR检测方法相比,敏感性更高。本研究为炭疽杆菌的检测和流行病学调查提供了一种快速、准确的检测方法。     

4种肠道致病菌的多重荧光定量PCR快速检测方法的建立

根据沙门菌的invA基因、弗氏枸橼酸杆菌的ldh基因、奇异变形杆菌的ureR基因和迟缓爱德华菌的fimA基因的保守序列,分别设计合成4对特异性引物和4个Taqman探针,通过对PCR反应体系的优化,并对该方法的特异性、敏感性进行评估,建立了一种能同时检测沙门菌、弗氏枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌、迟缓爱德华菌的四重荧光定量PCR快速检测方法。该方法可特异性的检测到4种目标菌株的单一模版及混合模板,未发现不同成分间的交叉反应,最低检出限均为103cfu/mL;对22种非目标病原菌进行检测均为阴性。本研究建立的四重荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强,可用于上述4种致病菌的同时快速检测。     

解淀粉芽孢杆菌实时荧光定量PCR测定方法的建立及其在豆粕发酵中的应用

本试验旨在通过快速定量不同发酵时期下发酵豆粕中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的数量,以解决豆粕发酵过程品质监控的瓶颈难题,建立解淀粉芽孢杆菌的实时荧光定量PCR方法。根据解淀粉芽孢杆菌DNA解旋酶A亚基(gyrA)基因及16S核糖体RNA(16S rRNA)基因的保守区设计出3对引物,利用常规PCR筛选出1对特异性引物,并以该引物的扩增产物构建的重组质粒作为标准品,建立实时荧光定量PCR方法,并对该方法进行特异性、灵敏性、重复性检验,核酸水平抗干扰验证及豆粕对检测敏感度的干扰验证,最后对发酵的豆粕样品进行定量检测。结果表明:1)以gyrA基因设计的引物构建的质粒标准品建立的实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性;2)该方法检测解淀粉芽孢杆菌核酸和菌液的最低检测限分别为102 copies/μL和103 CFU/mL;3)该方法组内变异系数在0.76%~3.27%,组间变异系数在0.34%~1.88%,均低于5%,说明重复性良好;4)含有与不含副干酪乳杆菌核酸的解淀粉芽孢杆菌的Ct值无显著差异(P>0.05),说明该方法不受检样中其他微生物的核酸干扰;5)该方法对豆粕中解淀粉芽孢杆菌的检测限为104 CFU/mL,比纯菌液最低检测敏感度(103 CFU/mL)降低了1个数量级(但不影响该方法的实际检测应用)。解淀粉芽孢杆菌在不同发酵时期发酵豆粕样品中定量检测结果表明,发酵0 d解淀粉芽孢杆菌的数量为9.33×10^5 copies/g,发酵至5 d接种菌数量为4.16×10^8 copies/g。由此可见,本试验建立的解淀粉芽孢杆菌实时荧光定量PCR方法特异性强,灵敏度高,抗干扰能力强,可快速定量发酵豆粕中的解淀粉芽孢杆菌的数量。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。     

Analysis and Evaluation of Nutrient Composition of Muscles of Two Kinds of Mallard

This experiment was aimed to study the nutritional content and value of the muscles of two mallards (White feather mallard and mallard),and provide basic data and theoretical basis for the development and utilization of mallard meat products.60 White feathered mallards and mallards (30 for each breed,half of male and female) were chosen,and the composition and content of pectoral muscle crude protein,crude fat,cholesterol,amino acids,fatty acids,trace elements and vitamins were determined according to national standards and the nutritional values of muscle were evaluated.The results showed that the content of crude protein in muscle of White feather mallard was significantly lower than that of mallard (P<0.05).17 kinds of amino acids with contents higher than 0.01% were detected in the muscles of the two kinds of mallards,among which the contents of threonine,histidine,serine and proline in the muscles of the White feather mallard were significantly higher than those of mallard (P<0.05).The contents of lysine,glutamate and arginine were significantly lower than those of mallard (P<0.05).13 kinds of fatty acids with contents higher than 0.01% were detected,and the contents of stearic acid and oleic acid were significantly lower than those of the mallard.9 mineral elements (sodium,magnesium,potassium,calcium,manganese,iron,copper,zinc and selenium) in two kinds of mallards were detected,and there was no significant difference between the two kinds of mallards (P>0.05).8 kinds of vitamins were detected,and the content of vitamin B₁ in muscle of White feather mallard was significantly higher than that of mallard (P<0.05),but the contents of vitamin D and vitamin E were significantly lower than that of mallard (P<0.05).The ratio of amino acids in muscle of two kinds of mallards was close to the ideal model recommended by WHO,which was rich in mineral elements and vitamins for human body,and had a broad prospect of development and utilization.     

两种绿头鸭肌肉营养成分分析及评价

本试验旨在研究两种绿头鸭（白羽绿头鸭和绿头鸭）肌肉营养组成和价值,为绿头鸭肉产品的开发利用提供基础数据和理论依据。选择白羽绿头鸭和绿头鸭60只（每个品种各30只,公母各半）,依照国家标准测定胸肌粗蛋白质、粗脂肪、胆固醇含量及氨基酸、脂肪酸、微量元素和维生素的组成和含量,并对胸肌进行氨基酸评价及脂肪酸营养价值评价。结果显示,白羽绿头鸭肌肉粗蛋白质含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;两种绿头鸭肌肉中均检测到17种含量大于0.01%的氨基酸,其中白羽绿头鸭肌肉苏氨酸、组氨酸、丝氨酸和脯氨酸含量显著高于绿头鸭（P<0.05）,赖氨酸、谷氨酸和精氨酸含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;检测到13种含量均大于0.01%的脂肪酸,其中白羽绿头鸭硬脂酸和油酸含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;检测到9种矿物质元素（钠、镁、钾、钙、锰、铁、铜、锌和硒）,两种绿头鸭差异不显著（P>0.05）;检测到8种维生素,白羽绿头鸭肌肉维生素B₁含量显著高于绿头鸭（P<0.05）,维生素D和维生素E含量显著低于绿头鸭（P<0.05）。两种绿头鸭肌肉氨基酸比例接近世卫组织推荐的理想模式,富含人体所需的矿物质元素和维生素,具有广阔的开发利用前景。     

三种圈养雉类的行为比较研究

2008年7月23日～8月5日和8月7～13日,采用目标动物取样法分别研究了4只蓝鹇(2♂2♀)、3只白鹇(1♂2♀)和5只白腹锦鸡(2♂3♀)的各种行为的发生频率进行了研究。结果发现3种雉类的各种行为类型都相似,但不同雉类间各种行为发生频次有差异。白腹锦鸡、蓝鹇和白鹇的休息行为分别在8:00、9:00和10:00达到日高峰,分别为12.05次/h、28.39次/h和14次/h。蓝鹇、白鹇、白腹锦鸡运动相关行为分别在7:00、8:00、9:00出现峰值,为19.29次/h、21.76次/h、24.90次/h;10:00蓝鹇、白鹇、白腹锦鸡的运动相关行为发生频次都出现了白昼的第一个谷值,分别为6.71次/h、9.29次/h、15.19次/h。蓝鹇、白鹇、白腹锦鸡的梳理行为9:00出现谷值分别为7.64次/h、8.05次/h、11.67次/h,10:00出现峰值分别为17.25次/h、21.19次/h、21.0次/h。3种雉鸡的采食行为的日节律相似。     

不同类型黑麦草营养价值评估

文章旨在通过体内外试验评估不同类型黑麦草的营养价值。试验选择平均体重为（66.87±2.34）kg的绵羊12头,随机分成3组,每组4个重复,每个重复1头。3组绵羊分别饲喂新鲜、青贮和晒干黑麦草。经过14?d的饲养试验后收集粪便和牧草样品进行后续分析。结果：晒干黑麦草的干物质、有机物和无氮浸出物含量均表现最高（P＜0.05）。新鲜黑麦草粗蛋白质和半纤维素含量较青贮黑麦草分别显著提高42.10%和10.82%（P＜0.05）。青贮黑麦草粗脂肪、粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量显著高于其他两种类型的黑麦草（P＜0.05）。新鲜、青贮和晒干黑麦草的粗蛋白质、粗脂肪和粗纤维表观消化率无显著差异（P＞0.05）。晒干黑麦草干物质表观消化率较新鲜和青贮黑麦草显著提高6.34%和6.21%（P＜0.05）,同时晒干黑麦草有机物表观消化率较新鲜黑麦草显著提高6.65%（P＜0.05）,无氮浸出物表观消化率较青贮黑麦草显著提高15.44%（P＜0.05）。当体外代谢能值以MJ/kg有机物表示时,新鲜和青贮黑麦草代谢能值较晒干黑麦草分别显著提高21.34%和22.41%（P＜0.05）,而当体外代谢能值以MJ/kg干物质表示时,新鲜黑麦草能值最高,青贮黑麦草能值次之,晒干黑麦草能值最低（P＜0.05）。结论：新鲜、晒干和青贮黑麦草在不同营养成分上各有优势,但3种牧草主要营养物质的表观消化率和代谢能值无显著差异。因此,无论是新鲜、晒干还是青贮黑麦草都可以作为反刍动物粗饲料的良好来源。 [关键词]黑麦草;青贮;营养价值;消化     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

Comparison of four techniques of arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint of the horse

Reasons for performing study: Clinical experiences indicate that centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint is often unsuccessful. Objective: To determine the accuracy of 2 published and 2 unpublished techniques of centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint. Hypothesis: It was hypothesised that a drug can be administered into the lateral compartment of the femorotibial joint via a diverticulum of this joint that surrounds the medial aspect of the long digital extensor tendon and that this technique is more accurate than described techniques of centesis of this compartment. Methods: Twenty‐four stifles of 12 horses were divided equally into 4 groups and a radiocontrast medium injected into the lateral compartment of the femorotibial joint of each group using a hypodermic needle inserted: 1) caudal to the lateral patellar ligament and proximal to the tibial plateau, 2) caudal to the long digital extensor tendon and proximal to the tibial plateau, 3) between the long digital extensor tendon and bone of the extensor groove of the tibia or 4) directly through the long digital extensor tendon until it contacted bone. Twelve veterinary students who had no experience using any of these techniques performed the injections. Accuracy of each technique was determined by examining radiographs obtained after injecting the contrast medium. Results: The most successful technique for arthrocentesis was by inserting a needle through the long digital extensor tendon. This approach was successful in all attempted cases, whilst other techniques had lower rates of success. Conclusions: The lateral compartment of the femorotibial joint can be accessed accurately by inserting a needle through the long digital extensor tendon as it lies within the extensor groove. Other techniques may not be as accurate for clinicians inexperienced in arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint.