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相似文献
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1.
本试验旨在对临床分离的猪源大肠埃希氏菌耐药基因进行初步定位。采用常规细菌分离培养、16S rRNA PCR扩增和序列测定方法从江西省3个规模化猪场送检的子宫脓液中分离鉴定病原菌,并通过质粒提取、转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞及药敏试验对临床分离株的耐药基因进行初步定位。结果显示,分离鉴定到3株大肠埃希氏菌,其中JX-22分离株仅对氧氟沙星、大观霉素敏感,JX-26分离株仅对链霉素、氧氟沙星等4种药物敏感,JX-28分离株仅对氧氟沙星等3种药物敏感,均为多重耐药菌;3株大肠埃希氏菌均可纯化到分子质量大小不一的质粒。分离株、质粒转化菌及大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞药敏试验对比结果显示,3株大肠埃希氏菌的耐链霉素、林可霉素、甲硝唑、氨苄西林、阿莫西林、大观霉素、丁胺卡那基因,JX-22和JX-26分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐头孢曲松基因,JX-28分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟、诺氟沙星基因均定位于细菌质粒上;JX-28分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐诺氟沙星基因和JX-26分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟基因均定位于其染色体上;3株分离株均无氧氟沙星耐药基因。本试验初步确定3株多重耐药猪源大肠埃希氏菌的大部分耐药基因定位于质粒上,为进一步研究猪源大肠埃希氏菌的耐药机理和有效控制措施奠定基础。  相似文献   

2.
氟苯尼考粉对鸡金黄色葡萄球菌病的疗效试验   总被引:5,自引:0,他引:5  
氟苯尼考(Florphenicol,又名氟甲砜霉素,是一种新型兽医专用氯霉素类抗菌药物,其抗菌谱广,吸收好,安全,对敏感菌所致的禽畜细菌性疾病治疗效果显著。氟苯尼考对耐氯霉素及甲砜霉素的细菌仍然敏感,如金黄色葡萄球菌,大肠埃希氏菌、多杀性巴氏杆菌、奇异变形杆菌、胸膜肺炎放线杆菌与伤寒沙门氏菌等,而且氟苯尼考无氯霉素的再生障碍性贫血的不良反应,  相似文献   

3.
本试验旨在对临床分离的猪源大肠埃希氏菌耐药基因进行初步定位。采用常规细菌分离培养、16S rRNA PCR扩增和序列测定方法从江西省3个规模化猪场送检的子宫脓液中分离鉴定病原菌,并通过质粒提取、转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞及药敏试验对临床分离株的耐药基因进行初步定位。结果显示,分离鉴定到3株大肠埃希氏菌,其中JX-22分离株仅对氧氟沙星、大观霉素敏感,JX-26分离株仅对链霉素、氧氟沙星等4种药物敏感,JX-28分离株仅对氧氟沙星等3种药物敏感,均为多重耐药菌;3株大肠埃希氏菌均可纯化到分子质量大小不一的质粒。分离株、质粒转化菌及大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞药敏试验对比结果显示,3株大肠埃希氏菌的耐链霉素、林可霉素、甲硝唑、氨苄西林、阿莫西林、大观霉素、丁胺卡那基因,JX-22和JX-26分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐头孢曲松基因,JX-28分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟、诺氟沙星基因均定位于细菌质粒上;JX-28分离株的耐多西环素、氟苯尼考和复方新诺明基因,JX-22分离株的耐诺氟沙星基因和JX-26分离株的耐头孢曲松、头孢噻肟基因均定位于其染色体上;3株分离株均无氧氟沙星耐药基因。本试验初步确定3株多重耐药猪源大肠埃希氏菌的大部分耐药基因定位于质粒上,为进一步研究猪源大肠埃希氏菌的耐药机理和有效控制措施奠定基础。  相似文献   

4.
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌"菌影"的制备   总被引:5,自引:2,他引:3  
本试验通过PCR扩增噬菌体PhiX174 的裂解基因E,将该基因连接到含有入PL/PR-cI857启动阻遏系统的pBV220 栽体中,从而使裂解基因E和启动阻遏系统入PL/PR-cI857串联成为温度敏感的裂解盒,构建重组质粒pBV-E.再将含有E基因的裂解盒插入到App-E.coli穿梭载体pGZRS-18中,构建胸膜肺炎放线杆菌打孔质粒.采用电击穿孔法将其转入胸膜肺炎放线杆菌中,含有打孔质粒的胸膜肺炎放线杆菌在28℃条件下生长到对数生长期,升温42℃诱导E基因的表达,制备了胸膜肺炎放线杆菌菌影.电镜观察菌影形态完整,内容物全部被释放到胞外.本试验为进一步研究菌影这一新型菌苗及佐剂奠定了基础.  相似文献   

5.
用碱裂解法提取分离的10株鸡源大肠埃希氏菌的质粒。结果:多数大肠埃希氏菌株含有大质粒,分子量为50 ̄230kb。这些大质粒可能含有毒力相关基因,与细菌的耐药性,大肠埃氏菌素的产生及质粒的传递功能等有关。  相似文献   

6.
研究大肠埃希菌耐药性和耐药基因和十二烷基硫酸钠(SDS)对大肠埃希菌耐药质粒消除作用。以大肠埃希菌临床分离株为试验菌株,采用K-B药敏纸片法对6种抗菌药物进行药物敏感性检测,并对大肠埃希菌耐药质粒TEM1型耐药基因进行PCR检测,采用SDS消除大肠埃希菌临床分离菌株的耐药质粒,采用琼脂糖凝胶电泳检测质粒条带,药敏试验检测大肠埃希菌耐药质粒消除前后的药物敏感性。结果表明,大肠埃希菌对庆大霉素敏感,对大观霉素中敏,对氨苄西林、阿莫西林、头孢拉定、环丙沙星耐药;大肠埃希菌耐药质粒检测出TEM1型耐药基因;试验菌株经7.5g/L的SDS处理至第3代时,质粒条带有明显的减少,TEM1型耐药基因消失,并且恢复了对β内酰胺类抗生素的敏感性,说明耐药质粒已经成功消除。  相似文献   

7.
根据已有的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP) dsbE基因序列,合成了一对特异性引物,从3株APP分离菌(BZ1株,BZ2株和BZ3株)均扩增出预期342 bp的DNA片段.分别将扩增的目的基因连接到pMD18-T载体中,构建重组质粒,转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,提取质粒并进行序列分析.结果表明BZ1株dsbE基因与所有14种血清型APP参考株dsbE基因的同源性达98%~100%,BZ2株dsbE基因与所有14种血清型APP参考株dsbE基因的同源性达98%~99%,BZ3株dsbE基因与所有14种血清型APP参考株dsbE基因同源性达97%~98%,证明3株分离菌均为APP.  相似文献   

8.
以胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型标准菌株基因组为模板,用PCR扩增ApxⅠ BD基因的特异性片段;对PCR产物纯化回收后与载体pMD18-T进行连接、转化,经酶切和序列分析鉴定后亚克隆到原核表达载体pET28a中,构建重组表达质粒pETIBD;转入大肠埃希氏菌BL21中,以IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE电泳。结果,从APP中克隆的ApxⅠ BDDNA序列与已发表序列的同源性为100%,长1447bp,编码482个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约54ku,与预期的大小相符。结果表明,含有ApxⅠBD基因特异性片段的重组表达载体pETⅠBD已成功构建。  相似文献   

9.
参照文献报道的传染性胸膜肺炎放线杆菌的特异基因合成5对特异引物,建立传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型分型的菌落多重PCR方法,结果为10株传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型参考菌株均扩增出了相应的预期片段,而支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌的扩增均为阴性。利用此多重PCR方法对41株传染性胸膜肺炎放线杆菌分离菌株进行血清型分型,结果所有菌株均扩增出了相应的特异片段,其中6株为1型,5株为7型,1株为5型,29株为9型。  相似文献   

10.
应用PCR方法从包含伪狂犬病病毒(PRV)Fa株糖蛋白gD基因的重组质粒pB13中扩增出糖蛋白gD基因去信号肽片段,将其克隆到大肠埃希氏菌表达载体pThiohisA中。测序结果表明,糖蛋白gD基因去信号肽片段长1155bp,与PRVFa株糖蛋白gD基因完全一致。经1mmol/L IPTG诱导后,重组质粒pThiohisA-gD在大肠埃希氏 菌XL1-blue、Top10、DE3和DH5a中均得到表达,其中在宿主菌XL 1-blue中表达量最高。Western-blotting结果显示,大肠埃希氏菌XL1-blue表达的糖蛋白gD具有免疫原性。  相似文献   

11.
以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)血清1型SC-A株基因组DNA为模板,用PCR扩增外膜脂蛋白(OML)基因特异片段,并克隆于pMD18-T中,经酶切及核苷酸序列分析鉴定后,亚克隆于原核表达载体pET-32 a(+),成功构建了重组表达载体pET-mOML。以此转化大肠埃希氏菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定,表达的融合蛋白(TRX-mOML)分子质量约为60 ku,表达产物主要以包涵体形式存在,采取非变性电泳方法对蛋白进行纯化,经ELISA检测,重组OML免疫小鼠可产生较高水平的抗OML抗体,这表明重组OML有较好的免疫原性。  相似文献   

12.
以胸膜肺炎放线杆菌1型参考菌株App-259株基因组DNA为模板,PCR扩增apxIA全基因,构建表达重组质粒apxIA-c2X,并将其转化至大肠杆菌TB1,SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物.结果表明:成功构建了apxIA-C2x表达质粒,重组菌在15℃经0.2mmol/L IPTG诱导16 h获...  相似文献   

13.
以猪胸膜肺炎放线杆菌血清型7型国内分离株25-4株基因组DNA为模板,PCR扩增其apfA特异性基因片段,PCR产物经纯化后与载体pMD18-T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达质粒pGEX-apfA,转化到感受态大肠杆菌DE3中,以IPTG进行诱导,进行SDS-PAGE电泳。结果表明,25-4株apfA基因与基因库中标准7型apfA基因的同源性达到98%,所表达的融合蛋白相对分子质量约为42000,与预测值相符。apfA特异性基因片段的成功克隆和表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病致病机理的研究及新型疫苗的研制打下了基础。  相似文献   

14.
以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清7型国内分离株25_4株基因组DNA为模板,PCR方法扩增apxIVA特异片段,PCR产物经纯化后与载体PMD18_T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pGEX_6P_1中,构建成重组表达质粒pGEX_apxIVA,转入到大肠杆菌BL21中,以IPTG进行诱导,进行SDS_PAGE电泳。结果表明,25_4株apxIVAgene与基因库中标准7型apxIVAgene同源性达97%,所表达的融合蛋白相对分子量为44kD,与实际预测相符。apxIVA毒素特异片段的成功表达为猪胸膜肺炎放线杆菌病的诊断打下基础。  相似文献   

15.
Actinobacillus pleuropneumoniae causes pleuropneumonia in swine. This bacterium secretes proteases that degrade porcine hemoglobin and IgA in vitro. To further characterize A. pleuropneumoniae proteases, we constructed a genomic library expressed in Escherichia coli DH5alpha, and selected a clone that showed proteolytic activity. The recombinant plasmid carries an 800-base pair A. pleuropneumoniae gene sequence that.codes for a 24-kDa polypeptide. A 350-base pair PstI fragment from the sequence hybridized at high stringency with DNA from 12 serotypes of A. pleuropneumoniae, but not with DNA from Actinobacillus suis, Haemophilus parasuis, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida A or D, or E. coli DH5alpha, thus showing specificity for A. pleuropneumoniae. The expressed polypeptide was recognized as an antigen by convalescent-phase pig sera. Furthermore, a polyclonal antiserum developed against the purified polypeptide recognized an A. pleuropneumoniae oligomeric protein in both crude-extract and cell-free culture media. This recombinant polypeptide cleaved azocoll, gelatin, and actin. Inhibition of the proteolytic activity by diethylpyrocarbonate suggests that this polypeptide is a zinc metalloprotease.  相似文献   

16.
参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1型菌株,设计1对特异性引物,PCR扩增转铁结合蛋白B(tbpB)全基因,克隆到pMD19-T Simple载体中,经测序比较,与参考序列的核苷酸同源性达99.72%。试验将tbpB基因定向克隆到pET-32a( )中,转化BL21(DE3),经诱导后,SDS-PAGE结果显示转铁结合蛋白B得到表达,Western blot检测呈阳性。  相似文献   

17.
以大肠杆菌pMB1复制类型质粒pUC18为模板,PCR扩增了700bp的含质粒复制起始点和复制蛋白序列的DNA片段,克隆到质粒pBluskm的多克隆位点,得到含大肠杆菌质粒复制基因的中间载体pE3;以革兰氏阳性菌质粒pGDV1为模板,PCR扩增了含革兰氏阳性菌质粒正负链复制区域的2·5kb片段,并与pE3载体上的大肠杆菌复制子和复制蛋白连接构建了3·2kb的大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pGJ103。电转化pGJ103质粒至枯草杆菌DB104和1A747,均能稳定地复制。以pGJ103为骨架,克隆了不同大小的生物素基因片段,均能正确稳定地复制,证明载体有良好的承载能力。将2kb的热稳定性β-半乳糖苷酶基因(bga)克隆至pGJ103构建了载体启动子检测载体pGJ199。用pGJ199质粒载体作为启动子检测载体,对革兰氏阳性菌启动子片段P59进行了转录活性检测。并以该载体为启动子探测工具,通过鸟枪法得到了大量启动子片段。  相似文献   

18.
以人型结核分枝杆菌 H37RV株基因组 DNA为模板 ,应用 PCR法对 ESAT- 6和 CFP10基因进行扩增 ,产物经纯化后与载体 PMD18- T连接、转化及酶切鉴定 ,亚克隆到原核表达载体 PGEX- 6 P- 1,构建原核重组表达质粒 ,转化入大肠杆菌 BL2 1中 ,以 1mmol/L IPTG诱导 ,进行 SDS- PAGE电泳。结果表明 ,ESAT- 6和 CFP10基因表达的融合蛋白相对分子质量分别为 32 0 0 0和 36 0 0 0 ,与实测相符。重组结核杆菌分泌蛋白 ESAT- 6和 CFP10的成功表达为结核病诊断及重组疫苗的构建打下了基础  相似文献   

19.
貂源犬瘟热病毒f基因酵母表达载体的构建和鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
根据GenBank中登录的犬瘟热病毒f基因序列设计一对引物,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的f基因,将其插入到克隆载体pMD18-T中,经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切鉴定后纯化回收,与经同样的酶酶切消化后并纯化回收的载体pPICZaA连接并转化E.coliDH5α,在含Zeocin的低盐LB固体培养基上筛选阳性转化子,阳性克隆菌经PCR法鉴定、酶切分析和测序鉴定表明目的基因插入位置、方向和阅读框正确。证明pPICZaA-f酵母表达载体构建成功。  相似文献   

20.
猪胸膜肺炎放线杆菌PCR诊断方法的建立与应用   总被引:5,自引:3,他引:5  
根据胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ基因设计1对引物,扩增特异的650bp棱酸片段,建立了应用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌的方法。特异性试验结果表明,12个血清型的放线杆菌参考菌株均能扩增出650bp特异性的核酸片段,而大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、伤寒沙门氏菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,PCR的最低检出限量为500个放线杆菌。利用建立的PCR检测方法对22株从山东省不同地区分离的疑似胸膜肺炎放线杆菌菌株进行检测.结果14株为阳性。对感染猪病变组织的检测结果表明,病变部位不同,胸膜肺炎放线杆菌的检出率不同,其中以扁桃体的检出率最高。  相似文献   

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