phyA、phyB基因沉默对不同秋眠型苜蓿光受体基因表达量的影响

苜蓿秋眠性是苜蓿一种生长特性，是苜蓿应对环境变化的一种特殊休眠方式，和日照长度及光周期敏感度有关。本试验研究沉默光敏色素A、B基因对苜蓿光受体基因表达的影响，检测phyA、phyB基因沉默对不同秋眠型紫花苜蓿光受体基因phyA、phyB、CRY2B、FHY1表达的影响。结果表明：秋眠型紫花苜蓿phyA沉默的转基因植株T1、T2代phyA、FHY1的表达量下降（P <0.05）,phyB、CRY2B的表达量上升（P <0.05）；非秋眠型紫花苜蓿phyA沉默的转基因植株T1代phyA、FHY1的表达量差异不显著（P> 0.05），但phyB、CRY2B的表达量显著增加（P<0.05）；非秋眠型紫花苜蓿phyB沉默的转基因植株T1代phyA、FHY1的表达量显著增加（P <0.05），但phyB、CRY2B的表达量差异不显著（P> 0.05）。在光信号转导途径，phyA、FHY1基因表达趋同，phyB与蓝光受体CRY2B基因表达趋同，沉默光敏色素A、B对几个光受体基因表达量均产生影响，phyA、phyB、FHY1、CRY2B之间可能存在互作效应。     

两种策略分别克隆紫花苜蓿光敏色素A、B基因

短日照是苜蓿秋眠性的主要影响因子,故苜蓿秋眠被认为是一种光周期反应。光敏色素是光周期反应的主要受体,因而探究光敏色素与苜蓿秋眠性之间的关系可能是揭示苜蓿秋眠性机理的有效途径之一。紫花苜蓿光敏色素A、B基因尚未被克隆,本研究采用2种不同的试验策略,分别以mRNA和基因组DNA为起点,根据比较基因组学原理和生物信息学方法,利用RACE和染色体步移等手段,克隆得到了紫花苜蓿光敏色素A 全长和光敏色素B近全长基因序列,为进一步探讨两者在苜蓿生长发育,特别是苜蓿秋眠性的光周期调控机制中的作用奠定了基础, 并为克隆紫花苜蓿其他未知基因等研究提供思路和参考。     

紫花苜蓿光敏色素A基因片段的克隆及其RNA干扰载体的构建

苜蓿(Medicago sativa L.)的秋眠性是一种光周期效应。研究植物体内重要的光受体-光敏色素A(phyto-chromeA,phyA),可能揭示其调控苜蓿秋眠性的机理。为研究其与苜蓿秋眠性的关系,本研究根据RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术原理,以紫花苜蓿幼嫩叶片为材料,提取总RNA,选取基因cDNA序列同源性较低区域设计特异性引物,并引入相应的酶切位点,利用RT-PCR克隆phyA正、反向片段,经过3次亚克隆,构建了phyA的RNAi表达载体,制备了适合转染植物组织的农杆菌菌液,为获得缺失phyA植株创超了条件。     

苜蓿SKU5基因的表达调控及其在秋眠中的作用

为了探索SKU5基因在紫花苜蓿（Medicago sativa L.）中表达调控规律和在苜蓿秋眠中的作用,本研究拟检测春、夏、秋季和人工条件下不同温度、不同日照长度下秋眠型和非秋眠型苜蓿叶片中SKU5基因mRNA相对表达量,分析同一秋眠型苜蓿品种不同时期SKU5基因mRNA相对表达量差异和不同时期2种秋眠型苜蓿品种间SKU5基因mRNA相对表达量的差异,以及SKU5基因mRNA相对表达量与苜蓿株高、叶面积、日照长度、温度的相关性。结果表明：SKU5基因的表达受日照长度极显著负调控,受温度极显著正调控;2种苜蓿叶片中SKU5基因的表达受日照长度和温度的调控结果不一致;秋眠型苜蓿叶中SKU5基因mRNA相对表达量与株高、叶面积呈显著负相关。因此,随着日照长度的缩短,SKU5基因高表达很可能促进秋眠型苜蓿的秋眠。     

光周期与温度对紫花苜蓿phyA和phyB mRNA表达的影响

通过探讨不同温度和不同光周期对紫花苜蓿(Medicago sativa L.)phyA和phyB mRNA含量的影响,以期为揭示调控苜蓿秋眠性的分子机理提供科学依据。试验采用FQ-PCR SYBR-Green I方法,测定了每天8,12和16h光照处理条件下3种秋眠类型苜蓿WL-232(秋眠型,FD2)、ArcherⅡ(半秋眠型,FD5)、WL-525(非秋眠型,FD8)的phyA和phyB mRNA表达水平;采用半定量RT-PCR,测定了5℃,15℃,25℃和35℃条件下秋眠型苜蓿Vernal(FD2)的phyA和phyB mRNA表达水平。结果表明:苜蓿存在光周期效应,短日照条件下秋眠型苜蓿phyB mR-NA表达量最大,相同光照条件下不同秋眠型苜蓿的表达规律为秋眠型>半秋眠型>非秋眠型,且相对于phyA,在紫花苜蓿绿叶中phyB对光周期的变化反应更敏感。在不同温度条件下秋眠型苜蓿Vernal的phyA和phyB合成规律不一致,低温条件下,phyB表达量较高,phyA表达量较低;高温条件下,phyA表达量较高,phyB表达量较低。上述结果表明phyB在调控苜蓿秋眠中发挥了更重要的作用。     

覆雪对不同秋眠型紫花苜蓿生理特性及抗寒基因表达的影响

为明确田间覆雪对不同秋眠型紫花苜蓿生理特性及抗寒基因表达的影响,选择秋眠型紫花苜蓿肇东(1级)、半秋眠型紫花苜蓿Archer(5级)及非秋眠型紫花苜蓿WL903(9级),测定越冬期间苜蓿的越冬率、根部渗透调节物质(可溶性糖、脯氨酸)含量、抗氧化物酶(超氧化物歧化酶、过氧化物酶)活性以及抗寒相关基因(CAS15A、DREB1、NAC3)表达。结果表明:冬季积雪可提高不同秋眠级紫花苜蓿的越冬率。覆雪状态下紫花苜蓿主根可溶性糖和脯氨酸含量、以及超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性均高于不覆雪状态;紫花苜蓿DREB1基因的表达量在秋眠型苜蓿(肇东)中最高,CAS15A和NAC3基因的表达量在半秋眠型苜蓿(Archer)中最高。     

自然环境下不同秋眠型苜蓿PHYA和PHYBmRNA表达量的变化

为揭示光敏色素如何响应外界环境及作用机理,并探讨其与苜蓿（Medicago）秋眠性的关系,以田间自然生长条件下的不同秋眠类型紫花苜蓿标准对照品种Norseman（FD1）, Archer（FD5）和CUF101（FD9）为材料,应用RT-PCR测定在6月、8月、9月、11月采集的叶片PHYA和PHYB mRNA含量。结果表明：从6 月到11月,随着光照时间的逐渐缩短和温度的降低,3个不同秋眠类型紫花苜蓿品种PHYA和PHYB的mRNA含量均呈上升趋势,且PHYA mRNA含量比PHYB mRNA的含量高;除了6月份,其他月份均是随着紫花苜蓿秋眠性的提高,PHYA和PHYB mRNA表达呈上调趋势,且不同秋眠类型间的差距越来越大。据此推测PHYA和PHYB在苜蓿响应外界环境改变过程中起一定的作用,二者基因的转录受光周期与温度因子的调控,且随着光周期的缩短与温度的降低其mRNA量升高,PHYA和PHYB很可能参与了光周期与温度对紫花苜蓿秋眠性的调控。     

不同秋眠苜蓿生长性能观测试验

紫花苜蓿在南方栽培相对适应性差,这主要是由于紫花苜蓿的秋眠性.秋眠级别是美国对苜蓿耐寒性和生产力评价以及商业化生产的第一评定指标,并由此对苜蓿进行种植区划.而贵州对不同秋眠苜蓿的生长性能研究甚少,开展此项研究可为紫花苜蓿的引种工作提供一定的科学依据.     

抗冻蛋白基因AFP表达载体构建及转化紫花苜蓿初报

以胡萝卜基因组DNA为模板,用PCR方法扩增目的基因,连接到PGEM-T Easy Vector载体上,经XbalⅠ和SacⅠ双酶切,将目的片段连接到PBI121工程质粒上,通过农杆菌介导法转化和田苜蓿,为提高紫花苜蓿的抗冻性奠定基础.结果表明,成功克隆出抗冻蛋白基因AFP,并构建成AFP植物表达载体.获得了具有卡那霉素抗性的苜蓿愈伤组织,和田苜蓿愈伤组织的最佳Kan筛选浓度为60 mg/L.经PCR技术鉴定,AFP抗冻蛋白基因已整合到苜蓿基因组中.     

光敏色素A参与苜蓿秋眠调控分子机制的研究进展

苜蓿的秋眠性是指苜蓿在夏末秋初，由于日照时间变短、温度下降所表现出来的植株生长速率下降、茎枝匍匐的一种生长特性，是苜蓿应对环境变化的一种特殊休眠方式。过去多集中于秋冬季节不同秋眠型苜蓿的可溶性糖来研究苜蓿的秋眠性，但苜蓿秋眠性的调控机理尚不清楚。本文对苜蓿秋眠性、光敏色素A（phy A）参与苜蓿秋眠调控、phy A信号转导机制等方面进行了综述与分析，以期从分子水平利用秋眠性来预测新品种的秋眠级别，为培育抗寒性强、秋眠性弱的苜蓿品种，改进现有优良品种的秋眠级等提供科学依据。 [关键词] 苜蓿|秋眠性|光敏色素A|信号转导     

光周期对不同秋眠型苜蓿SOD、POD活性的影响

短日照是导致苜蓿(Medicago sativa L.)秋眠的主要环境因子,同时也可能是苜蓿生长的一种逆境。本文研究了光周期对不同秋眠型苜蓿超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的活性的影响,以及两种抗氧化物酶活性与苜蓿秋眠性的关系,为进一步研究秋眠性的生理机制奠定基础。结果表明:无论是秋眠型苜蓿Vernal,半秋眠型苜蓿CW502,还是非秋眠型苜蓿CUF101,其叶片中SOD和POD的活性均呈现出8h光照最高,12h次之,16h最低的趋势,暗示SOD、POD的活性与长日照苜蓿的光周期有关,短日照可提高SOD、POD的活性;在同一光周期下,不同秋眠类型苜蓿品种之间并未在SOD活性上表现出规律性,而POD活性则有随着秋眠性增强而增强的趋势;在同一苜蓿品种中POD活性多随生长期延长而升高。     

不同秋眠类型苜蓿品种生产性能与持久性分析

通过对58份不同秋眠类型苜蓿品种再生性、持久性和产草量在呼和浩特的测定分析,结果表明:1)在全部参试材料与秋眠类型组中,苜蓿秋眠级和再生性正相关并达到极显著、显著水平;而在半秋眠类型组、非秋眠类型组中,苜蓿的再生性和秋眠级相关性很小。2)在全部参试材料、半秋眠类型组、非秋眠类型组中,首蓿的持久性与秋眠级负相关,但是在秋眠类型组中,首蓿秋眠级和持久性相关性很小。3)在全部参试材料、半秋眠类型组、非秋眠类型组中,苜蓿的产草量和秋眠级负相关;在秋眠类型组中,苜蓿的产草量和秋眠级正相关但不显著。     

苜蓿秋眠型与其超氧化物歧化酶和过氧化物酶关系的研究

为进一步研究苜蓿Medicago sativa秋眠性的生理机制,提高苜蓿的抗寒性和生产性能,研究了短日照（8 h光照/16 h黑暗）条件下,不同秋眠型对苜蓿超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性的影响。结果表明：苜蓿SOD、POD的活性随着秋眠性的增强而升高,呈现秋眠型苜蓿Vernal最高,半秋眠型苜蓿CW502次之,非秋眠型苜蓿CUF101最低的趋势;3种不同秋眠型苜蓿的SOD、POD活性均随着生长期的延长而升高。     

不同秋眠级数苜蓿品种生物量特性的研究

对不同苜蓿品种的茎、叶及总生物量生长动态的研究表明,在一个生育期内,苜蓿的茎、叶及总生物量的动态变化符合逻辑斯蒂曲线。在该试验条件下,不同秋眠级数苜蓿品种的生物量积累潜力不同,中秋眠级数的苜蓿品种生物量积累的潜力最大,其次为低秋眠级数的苜蓿品种,高秋眠级数的苜蓿品种生物量积累的潜力最小;不同秋眠级数苜蓿品种对环境的敏感程度不同,高秋眠级数的苜蓿品种对环境的敏感程度大于低秋眠级数的苜蓿品种。     

CO2浓度升高对不同秋眠类型苜蓿生长发育的影响

为了分析3种秋眠类型苜蓿(Medicago sativa)(秋眠型苜蓿Maverick、半秋眠型苜蓿ABI700和极非秋眠型苜蓿UC-1465)在不同CO_2浓度下的生长发育情况,本研究运用人工气候箱和开顶式气室动态观测了3种秋眠类型苜蓿的种子发芽特性、生长发育和产量大小。主要结果:1)550、700μmol·mol-1 CO_2浓度处理能显著提高3种秋眠类型苜蓿种子的发芽率、发芽势和发芽指数(P0.05),缩短平均发芽天数(P0.05)。其中550μmol·mol~(-1)浓度处理下苜蓿种子的发芽率、发芽势最高。2)高CO_2浓度促进3种秋眠类型苜蓿生育期提前3~6d,且CO_2浓度越高生育期越提前。3)高CO_2浓度能显著促进3种秋眠类型苜蓿株高、叶面积和单株干重增加(P0.05)。高CO_2浓度处理后UC-1465的单株鲜重比Maverick高19.33%~21.76%,比ABI700高12.74%~13.11%;单株干重比Maverick高14.85%~26.77%,比ABI700高12.31%~14.58%,高CO_2浓度处理后极非秋眠型苜蓿UC-1465生长优势进一步提高。4)CO_2浓度对苜蓿茎粗无显著影响(P0.05),但促进秋眠型苜蓿Maverick、半秋眠型苜蓿ABI700茎粗增大。上述结果表明,在一定浓度范围内,苜蓿种子的发芽率、发芽指数、发芽势、株高、叶面积、生物量等对CO_2的响应存在浓度效应。可以预测,未来大气CO_2浓度升高的对苜蓿生长有一定的促进作用,具有一定的应用潜力。     

晚秋温度对苜蓿地上部游离脯氨酸、可溶性糖和POD活性的影响

通过对9个不同苜蓿Medicago sativa品种地上部游离脯氨酸、可溶性糖和POD活性的研究,揭示晚秋温度变化对上述指标变化的影响,结果表明：9月10日-10月10日,随着温度的降低,3种不同秋眠类型的苜蓿地上部游离脯氨酸含量都呈上升趋势,其中高度秋眠类型苜蓿的变化幅度最大;不同秋眠类型苜蓿地上部可溶性糖变化趋势有所不同,低度和高度秋眠类型苜蓿变化幅度比较剧烈,说明在贮藏类营养物质方面,低度和高度秋眠类型苜蓿更为敏感,二者变化趋势恰好相反,中度秋眠类型苜蓿介于二者之间;不同秋眠类型苜蓿地上部过氧化物酶（POD）活性都经历逐步上升的趋势,中度和高度秋眠类型苜蓿POD活性变幅相对于低度秋眠类型大,说明中度和高度秋眠类型苜蓿地上部对于气温的变化更敏感。     

新疆石河子地区不同秋眠级紫花苜蓿生产性能的综合评价

为了探究不同秋眠级紫花苜蓿(Medicago sativa L.)生产性能和越冬能力的差异,本研究以国内外26个不同秋眠级紫花苜蓿品种为试验材料,对紫花苜蓿生长性状、营养品质、越冬率及其综合评价进行研究。结果表明：紫花苜蓿的单株生物量、株高、茎粗、粗蛋白含量随着秋眠级的升高呈先增加后降低的趋势,而茎叶比、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量随秋眠级的升高呈先降低后增加的趋势,越冬率则随着秋眠级的升高呈逐渐下降的趋势。主成分分析综合评价得分由高到低依次为秋眠级4级>3级>2级>5级>6级>8级>7级>9级>10级,聚类分析表明秋眠级4级和3级紫花苜蓿为综合指标最优的一类。因此,秋眠级4级的紫花苜蓿最接近理想品种,其次为秋眠级3级,上述2个秋眠级紫花苜蓿均适合在新疆石河子地区种植。     

紫花苜蓿MsLEA4-4基因的克隆、表达分析及遗传转化

胚胎晚期富集蛋白(LEA)广泛参与植物对多种逆境胁迫的反应。本研究利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆了一个LEA4类基因的开放阅读框(ORF),命名为MsLEA4-4。该基因编码512个氨基酸,结构分析显示MsLEA4-4包含5个重复的由11个氨基酸TAQAAKEKTQQ组成的序列特征。利用实时荧光定量PCR检测了MsLEA4-4在不同逆境下的表达量,结果显示,该基因受干旱、NaCl、Cu²⁺、Zn²⁺和外源ABA诱导表达上调,其中NaCl胁迫2 h、Cu²⁺和Zn²⁺胁迫8 h,MsLEA4-4基因表达量最高;冷胁迫和干旱胁迫下,该基因的表达量随处理时间的延长呈逐渐上升趋势,表明该基因可能参与了紫花苜蓿的抗逆性调控。构建植物超表达载体pCAMBIA3301-MsLEA4-4,采用农杆菌介导法侵染拟南芥花序,通过草铵膦(PPT)筛选和分子检测,7株抗性苗呈阳性,表明目的基因已成功导入拟南芥基因组中。本研究为进一步探索MsLEA4-4基因在紫花苜蓿抗逆性调控中的作用奠定了基础。     

苜蓿秋眠性调控机理的初步研究

苜蓿(Medicago sativa)秋眠性是苜蓿的一种生长特性,是苜蓿应对环境变化的一种特殊休眠方式,不仅和日照长度及光周期敏感度有关,它也是昼夜规律循环、光照、温度等多种因素及休眠相关基因调控共同作用的结果。国内外最新试验研究发现,植物的休眠受多种植物激素、光敏色素及其相关基因的调控。苜蓿中的植物激素、光敏色素在对苜蓿秋眠的调控中发挥着一定的作用,本研究对苜蓿秋眠性和光周期与光敏色素、植物激素的关系进行了介绍,并对休眠的机理进行了探讨。