猪IFN-β的克隆与原核表达

根据已发表的AY687281基因序列,设计1对特异性引物,采用PCR方法从长白猪白细胞基因组中扩增到猪β干扰素基因,将PCR产物克隆到pMD18-T载体,进行序列测定。序列分析表明,获得的猪β干扰素基因全长561bp,编码186个氨基酸,与GenBank中AY687281基因序列同源性达99.2%,在28、34、128位核苷酸发生了点突变,由G变为A,由C变为G,由A变为G,由C变为T,导致10、12、43位氨基酸由A变为T,L变为V,E变为G,而在177位点核苷酸的突变没有改变氨基酸。将该基因克隆到pEGX-4T-1表达载体中,转化宿主菌Rosetta,对猪β干扰素进行原核表达。重组表达菌经IPTG诱导后,得到高效表达,所表达蛋白约为43 000,占总蛋白的39.3%,表达产物主要为包涵体。纯化后的包涵体具有抗病毒的生物学活性,能抑制口蹄疫病毒（FMDV）增殖。     

猪β干扰素成熟蛋白编码基因的克隆及其在大肠埃希菌中的表达与纯化

从猪肝脏中提取基因组DNA,利用PCR法直接扩增了猪β干扰素成熟蛋白编码基因。将PCR产物亚克隆至pGEM-7Zf( )载体,转化入大肠埃希菌TG1,筛选出阳性菌株后进行测序。序列分析结果表明,克隆片段含编码猪β干扰素成熟蛋白质的495个核苷酸,与GenBank上(登录号:S41178)的序列同源性达到100%。在此基础上,构建了猪β干扰素原核表达载体pQE30/poIFN-β并转化入大肠埃希菌M15。该工程菌在37℃经0.03mmol/LIPTG诱导4h后,进行SDS-PAGE电泳,结果在分子质量约20ku的位置出现了明显的目的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在。经凝胶分析软件Bandscan分析,表达产物约占菌体总蛋白的18%。包涵体用6mol/L盐酸胍溶解,经过Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白,为下一步对猪β干扰素进行复性及活性研究打下了基础。     

猪白细胞介素-4基因的克隆与表达

利用RT-PCR技术,从被刺激诱导的PBMC中克隆IL-4基因,序列分析表明:克隆的猪IL-4基因序列与GenBank上登录的IL-4基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99%和97.8%.然后用表达型引物从T载体上扩增IL-4基因,双酶切PCR产物后与表达载体pGEX连接,构建重组表达质粒pGEX-IL-4,用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达出38 ku融合蛋白,占菌体总蛋白的30%以上,并且以包涵体的形式存在,这为猪重组IL-4规模化生产和疫苗佐剂的研制奠定了基础.     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

巴氏杆菌磺胺耐药基因SulⅡ的克隆及其表达

根据巴氏杆菌磺胺耐药基因Sul Ⅱ序列设计引物，以临床分离的禽源巴氏杆菌磺胺耐药菌株为模板，扩增出禽源巴氏杆菌Sul Ⅱ的全长基因序列。经T载体克隆和核苷酸序列测定，克隆的Sul Ⅱ基因与文献报道的同源性为98．9%，有9个碱基的差异，但所编码的氨基酸没有改变。将Sul Ⅱ基因按正向的阅读框架与表达戴体pET-28c( )连接，重组质粒经酶切鉴定正确后，经IPTG诱导，SDS-PAGE检测，融合蛋白的表达产物占菌体总蛋白的11％，蛋白表达形式为包涵体表达。     

口蹄疫病毒诱导的牛α－干扰素基因cDNA的克隆及序列分析

参照已发表的牛α-干扰素基因cDNA序列设计了1对引物，用感染口蹄疫病毒的牛外周血为材料，提取总RNA。经RT-PCR，获得与预期大小相符的DNA片段。所获得的PCR产物长度是604bp，与参考序列的同源性是99．7％。第23位～91位的69个碱基为信号肽序列，编码23个氨基酸。与参考序列比较，第43位的碱基由C变为A，即由TTC→TTA，对应的氨基酸由苯丙氨酸(F)变为亮氨酸(L)。第45位的碱基由G变为C，即由CGA→CCA，对应的氨基酸由精氨酸(R)变为脯氨酸(P)。第92～589位的498个碱基为牛α-干扰素成熟蛋白基因序列，编码166个氨基酸，与参考序列完全相同，即同源性为100％。第590～592位的碱基为TGA终止子。整个牛α-干扰素前体蛋白基因共570个碱基。编码189个氨基酸。     

猪γ-干扰素双顺反子表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

提取经 Con A诱导培养的猪外周血白细胞总 RNA,RT- PCR扩增出猪 IFN- γ基因并克隆到 p GEM- T- easy载体 ,测序结果表明 ,扩增片段为含有信号肽的猪 IFN-γ完整基因。亚克隆猪 IFN-γ成熟蛋白编码基因 ,并对其 5′段前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。通过引入 SD序列 ,成功构建了猪 IFN- γ原核双顺反子表达载体 p L CS-po IFN2 G,并实现了猪 IFN-γ在大肠杆菌中的高表达 ,约占菌体总蛋白的 5 6 .5 %。表达产物以包涵体形式存在 ,用含 7mol/L 盐酸胍的变性液溶解及含 0 .5 mol/L盐酸胍复性液复性处理 ,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后 ,细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪 IFN-γ具有较高干扰素活性     

三种猪Ⅰ型干扰素基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的三种猪Ⅰ型干扰素（porcine interferon,pIFN）基因序列,设计了3对特异性引物。运用RT—PCR技术从长白猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到了三种猪干扰素基因,并将其克隆至pGEM-T Easy载体上。序列测定结果显示,获得的猪干扰素α1基因序列全长570bp,编码189个氨基酸,获得的猪干扰素α2基因序列全长540bp,编码179个氨基酸,获得的猪干扰素β基因序列全长563bp,编码186个氨基酸。三种猪Ⅰ型干扰素基因与已知猪Ⅰ型干扰素核苷酸序列和氨基酸序列的相似性最高可达99％～100％。     

鸭肥胖基因的分子克隆、序列分析及原核表达

根据人、小鼠、猪等动物的肥胖基因编码区序列的保守性设计1对引物，利用RT-PCR技术扩增出鸭肥胖基因的cDNA编码序列，将PCR产物插入pGEM-T载体，经：PCR和双酶切鉴定正确后进行序列测定，分析表明该cDNA序列由438个核苷酸组成，编码146个氨基酸组成的多肽，鸭与人、猪、小鼠、大鼠的核苷酸相似性分别为83％、84％、98％、94％；氨基酸的相似性分别为86％、83％、99％、96％。为了研究鸭肥胖基因体外表达的特点，构建了原核表达载体pET-28a-Ya，在大肠杆菌中进行了诱导表达。结果表明，鸭肥胖基因在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达，融合蛋白分子量约为20ku，其中16ku为鸭肥胖基因表达的蛋白质，经薄层扫描分析，目的蛋白约占菌体总蛋白的30％。鸭肥胖基因的克隆和表达研究，为进一步研究鸭leptin的功能与应用奠定了基础。     

成华猪γ-干扰素基因分子克隆与序列分析

为研究猪γ—干扰素在抗御传染性疾病和肿瘤生物治疗中的免疫增强作用，本实验以ConA刺激成华猪外周血淋巴细胞提取激活淋细胞的mRNA，设计合成特异的引物序列，应用反转录—聚合酶链式反应(RT—PCR)扩增和克隆成华猪IFN—γ基因并进行序列5ll定。成华猪IFN—γcDNA约长500bp，从第68位核苷酸开始编码其信号肽，到569位核苷酸为终止子。IFN—γ基因的开放框架(ORF)由498bp构成，编码166个氨基酸。成华猪IFN—γ与猪IFN—γ基因核苷酸间同源性为98％，在261—269存在点突变，在氨基酸水平完全一致。IFN—γ氨基酸与鼠同源性为30％，与人同源性为40％。