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相似文献
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1.
为探讨建立基于Mo Hsp70C末端蛋白检测绵羊肺炎支原体(Mo)感染或疫苗免疫抗体有效方法的可能性。本研究对Mo Hsp70C末端蛋白基因进行原核表达,采用亲和层析技术对表达产物进行蛋白纯化,Western blot和琼脂扩散试验检测纯化效果和抗原反应性。基于纯化目的蛋白构建检测Mo血清抗体的间接ELISA方法。结果显示:成功表达并纯化出Mo Hsp70C末端蛋白,大小约27 000,琼脂扩散试验表明纯化的目的蛋白具有良好的抗原反应性。基于纯化的Mo Hsp70C末端蛋白,成功构建间接ELISA方法,其最佳体系蛋白质量浓度为10mg/L、血清稀释度1∶5;抗原包被条件37℃1h、室温12h、封闭液5%脱脂奶粉、封闭时间1.5h;临界值为0.588。间接ELISA方法性能评价显示本研究所建立的ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和可重复性,可用于临床样本检测,为Mo疫苗免疫和疫病诊断提供可行手段。  相似文献   

2.
《中国兽医学报》2014,(12):1906-1911
P32蛋白是羊痘病毒株中特异性很强的免疫原性结构蛋白,本研究利用原核表达系统对山羊痘病毒P32基因进行表达,并应用该蛋白建立了检测山羊痘病毒血清抗体检测方法。将P32基因克隆至pGEX-6P-1表达载体,经抗性筛选,测序鉴定获得重组阳性克隆,成功构建了羊痘病毒重组pGEX-P32表达载体。经IPTG诱导表达,可稳定、高效地表达P32融合蛋白。融合蛋白纯化后SDS-PAGE结果表明,以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导,8h后表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,相对分子质量约56 000,表达产量约占菌体总蛋白的28%。Western-blotting检测表明,表达的融合蛋白能与羊痘阳性血清发生特异性反应,说明表达获得的产物具有良好的反应原性。用表达的融合蛋白建立了检测羊痘血清抗体的ELISA方法,经方阵滴定,确定抗原最佳包被质量浓度为每孔0.4mg/L,最佳血清稀释度为1∶20。符合率试验表明ELISA方法和琼脂扩散试验的阳性符合率为83.44%,并且所建立的方法具有很好的特异性、重复性和敏感性,这为应用该融合蛋白制备山羊痘病毒免疫血清学诊断试剂和疫苗研究奠定了基础。  相似文献   

3.
为表达山羊痘病毒P32蛋白并研究其免疫原性,构建了含有P32基因的重组表达质粒p ET-P32,诱导表达和纯化了P32蛋白;分别运用SDS-PAGE和Western blot,对该蛋白进行了分析和生物活性鉴定;用分析鉴定后的P32蛋白免疫BALB/c小鼠,然后采集小鼠血清,用间接ELISA进行抗体检测;用小鼠脾淋巴细胞增殖试验,检测该蛋白对机体的细胞免疫活性。结果显示:表达纯化的含有GST标签的P32重组蛋白,大小约39k Da;Western blot显示P32重组蛋白具有较好的特异性;间接ELISA抗体检测和小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明P32重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验结果为深入研究P32蛋白的生物学功能以及对山羊痘的诊断与防治奠定了基础。  相似文献   

4.
为了建立山羊痘病毒(GPV)抗体快速检测方法,本研究通过人工合成密码子优化的GPV p32基因,并在大肠杆菌中进行截短表达(p32-opti).表达的重组p32-opti蛋白主要以包涵体形式存在,Western blot分析表明,p32-opti与GPV标准阳性血清具有良好的抗原性.以纯化的重组p32-opti蛋白作为ELISA包被抗原,建立间接ELISA抗体检测方法.该方法检测小反刍兽疫、蓝舌病和口蹄疫阳性血清均无交叉反应;与中和试验(VNT)比较,两者的符合率为95.7%;ELISA批内和批间重复性试验显示,OD值的变异系数小于10%.上述结果表明.该ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性.对来自黑龙江、内蒙古和新疆自治区的390份山羊和绵羊血清进行检测,抗体阳性率为80.2%,表明这些地区的山羊和绵羊群普遍存在羊痘病毒抗体.本研究建立的间接ELISA方法可用于GPV感染的流行病学调查以及疫苗接种动物的抗体水平监测.  相似文献   

5.
[目的] 建立基于丝状支原体山羊亚种(Mmc)膜脂蛋白LPPA的间接ELISA方法。[方法] 扩增Mmc LPPA基因并将其克隆至pCold-Ⅰ载体,构建重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,测序鉴定正确后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经IPTG诱导表达后纯化得到Mmc LPPA重组蛋白,采用SDS-PAGE验证该重组蛋白是否表达,并采用Western blotting和传统经典的琼脂扩散血清学试验分析其与Mmc阳性血清的反应原性。以该重组蛋白为包被抗原,建立Mmc重组LPPA蛋白的间接ELISA抗体检测方法,对该方法进行反应条件优化后开展特异性、重复性试验,并将其初步应用于184份山羊血清样本。[结果] 通过PCR扩增得到Mmc LPPA基因,成功构建了重组质粒pCold-Ⅰ-LPPA,经诱导表达后得到Mmc LPPA重组蛋白,SDS-PAGE结果显示,获得了大小约23 ku的LPPA重组融合蛋白;琼脂扩散及Western blotting试验证明该蛋白反应原性良好。ELISA方法反应条件优化结果显示,LPPA抗原蛋白的包被浓度为2.0 μg/100 μL,血清稀释度为1:300,3% BSA封闭1 h为最佳反应条件,临界值为2.738。本试验建立的间接ELISA方法批内和批间变异系数均<10%,证明该方法具有良好的重复性;对绵羊肺炎支原体(Mo)、蓝舌病病毒(BTV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口蹄疫病毒(FMDV)、弓形虫及山羊痘病毒(GPV)标准阳性血清的检测均为阴性,表明该方法特异性较强;184份临床血清临床应用结果显示,该方法与正向间接血凝诊断试剂盒检测结果阳性符合率为93.33%,阴性符合率为75.23%,两者相对符合率为82.61%。[结论] 本研究成功建立了Mmc LPPA蛋白间接ELISA抗体检测方法,为临床Mmc血清抗体水平的监测及Mmc血清流行病学调查奠定了基础。  相似文献   

6.
为筛选建立小反刍兽疫病毒N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法的抗原原料,本研究通过优化大肠杆菌密码子、优化蛋白表达与纯化条件等方法,分别在pET-30a与pET-32a两个不同原核表达载体中成功获得了可溶性的小反刍兽疫核衣壳蛋白(N)。分别对重组大肠埃希氏菌pET-30a-(N)-BL21(DE3)株与pET-32a-(N)-BL21(DE3)株种子批的P7代与P20代进行蛋白诱导表达与抗原提取纯化,共获得6批小反刍兽疫病毒pET-30a-(N)蛋白与pET-32a-(N)蛋白,并对蛋白的浓度、纯度、抗原性和特异性进行检验。结果表明两个纯化后的重组抗原与羊小反刍兽疫病毒阳性血清有明显反应,具有较好的反应性,而与羊痘病毒阳性血清、羊口蹄疫病毒阳性血清、山羊关节炎/脑炎病毒阳性血清等特异性血清均无交叉反应,具有较好的特异性。本研究结果为今后以N蛋白为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法,竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA抗体检测方法打下了坚实的基础。  相似文献   

7.
本研究旨在表达山羊痘病毒p32蛋白、制备p32蛋白单克隆抗体。通过PCR克隆p32基因,连接到pMD18-T并测序;酶切、连接后将p32基因克隆到pET28a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,在IPTG诱导下成功表达p32蛋白;利用亲和层析法纯化p32蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后制备p32蛋白单克隆抗体,获得22株识别重组蛋白的单抗,通过间接免疫荧光鉴定,其中3株能识别病毒的p32蛋白。山羊痘病毒p32蛋白的表达和单克隆抗体的制备为山羊痘病毒抗原、抗体检测提供了生物材料。  相似文献   

8.
本研究对猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)N蛋白的编码基因进行克隆和原核表达,并在纯化重组N蛋白的基础上,建立了FIPV抗体间接ELISA检测方法。研究结果显示,该重组纯化的N蛋白具有良好的抗原反应性,可用于FIPV阳性血清的筛查,为我国出入境检疫部门监控FIPV疫情提供技术支撑。  相似文献   

9.
为表达山羊痘病毒ORF112蛋白并研究其免疫原性,构建了含有ORF112基因的重组表达质粒pET-ORF112;诱导表达和纯化了ORF112蛋白,SDS-PAGE和Western blot对该蛋白进行了分析和生物活性鉴定,并用分析鉴定后的ORF112蛋白免疫接种Balb/c小鼠,采集小鼠血清用间接ELISA进行了抗体检测。结果显示,表达和纯化了含有GST标签的GST-ORF112蛋白,大小约23ku,Western blot显示ORF112蛋白具有较好的特异性,间接ELISA抗体检测表明ORF112蛋白具有良好的免疫原性,为深入研究ORF112蛋白的生物学功能及对山羊痘的诊断与防控奠定了基础。  相似文献   

10.
为探索敏感性高、特异性强、高通量、操作简便的羊痘病毒(CaPV)检测方法,将编码CaPV P32抗原的核苷酸序列优化为适合在Sf9细胞中表达的偏好密码子,去除氨基酸序列跨膜区,优化蛋白表达条件,利用昆虫杆状病毒表达系统成功表达出了重组CaPV P32蛋白,建立了检测CaPV血清抗体的间接ELISA方法。建立的间接ELISA方法对相关的羊类病毒血清抗体无交叉反应,敏感性可达1:1 024,组内和组间变异系数均低于10%。利用建立的间接ELISA方法,对480份临床血清样品进行抗体检测并与血清中和试验进行比对,发现两种方法的敏感性符合率为98.18%,特异性符合率为93.33%,总符合率为96.67%。本研究建立的CaPV P32血清抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可进一步开发为商品试剂盒,用于现场高通量检测,具有较好的市场应用前景。  相似文献   

11.
猪肺炎支原体P216基因片段的表达及黏附活性研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
本研究旨在研究猪肺炎支原体P216蛋白的黏附活性并初步建立猪肺炎支原体蛋白黏附模型。根据软件分析和文献报道从P216全基因中选取亲水性、抗原性、黏附性较好的目的片段,利用PCR从Mhp NJ株扩增P216基因片段,克隆到表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET-32a(+)/P216,经IPTG诱导获得重组蛋白,通过Western blot和间接免疫荧光试验检测重组蛋白的免疫原性及黏附活性。结果表明,PCR扩增的目的基因大小为l 636bp;SDS-PAGE检测重组蛋白相对分子质量为80.1ku;Western blot检测表明重组蛋白能与Mhp阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验表明该蛋白对猪肺炎支原体黏附SJPL细胞产生占位抑制作用。结果提示,P216蛋白具有良好的黏附活性,能黏附SJPL细胞,从而为猪肺炎支原体其他黏附因子的研究奠定基础。  相似文献   

12.
获得高纯度具有生物学活性的重组布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,并进行抗原性的分析。将用PCR扩增出的布鲁菌Omp10、Omp25基因片段分别克隆到原核表达载体pET-32α中,构建pET-32α-Omp10/Omp25原核表达质粒。将其转入大肠杆菌BL21(DE3)PlysS中,用IPTG诱导表达,经HisTrap HP亲和层析柱分离纯化,分别用Western-blot和间接ELISA检测产物的抗原性。基因测序及酶切鉴定证明pET-32α-Omp10/Omp25原核表达载体构建成功。SDS-PAGE表明,Omp10、Omp25融合蛋白均以包涵体的形式在大肠杆菌中高效表达。经过包涵体的变性、复性及亲和层析纯化,成功获得了大小分别为34 000和44 000的融合蛋白,与预测的相对蛋白分子质量一致。Western和间接ELISA试验证明纯化的Omp10、Omp25融合蛋白能被免疫的牛布鲁菌阳性血清所识别。结果表明,成功获得了布鲁菌Omp10、Omp25融合蛋白,且均具有一定的免疫原性,通过血清学反应证实,Omp10、Omp25蛋白为布鲁菌病临床诊断试剂盒的研制奠定了基础。  相似文献   

13.
牛传染性鼻气管炎病毒gE基因的截短克隆与表达   总被引:6,自引:0,他引:6  
以牛传染性鼻气管炎病毒Baaha Nu/67株的DNA作为模板,用PCR扩增gE基N并克隆至pGEM-T Easy裁体,再以此质粒作为模板将gE基因分成6个片段,分别插入原核表达载体pET32a并在大肠杆菌中进行了表达。蛋白电泳结果表明6个片段中有2个片段以可溶形式表达,1个片段以包涵体形式表达,另外3个片段没有表达。采用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下对两个可溶性片段进行了纯化。经免疫印迹试验,间接ELISA和交叉试验证明,两个纯化的重组蛋白均与牛传染性鼻气管炎阳性血清样品发生反应,而与牛传染性鼻气管炎阴性血清无任何反应,显示其具有良好的抗原性和特异性,可用于牛传染性鼻气管炎gE-ELISA诊断方法的建立。  相似文献   

14.
在对南非Ⅱ型口蹄疫病毒抗原分析基础上,将已经筛选出的6条抗原性良好的多肽采用柔性linker拼接,人工合成相应核苷酸后连入T载体中。将酶切回收的串联基因(VP1-VP3)克隆于表达载体pGEX-6P-1中,获得重组质粒pGEX-VP1-VP3。该质粒转化于感受态细胞BL21(DE3) plysS中,经IPTG诱导后进行了可溶性分析和Western blotting分析,且对融合蛋白柱上酶切纯化后进行了抗原性分析。重组质粒pGEX-VP1-VP3的PCR和测序结果表明,VP1-VP3串联基因已成功插入pGEX-6p-1载体中;pGEX-VP1-VP3融合蛋白分子质量约为38.3 ku,并以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,该融合蛋白与南非Ⅱ型FMDV阳性血清能发生特异性反应;酶切纯化后蛋白间接ELISA鉴定结果表明,表达的VP1-VP3蛋白具有良好的免疫原性与反应原性。串联多肽的成功表达,将为南非型口蹄疫血清学检测方法建立奠定基础。  相似文献   

15.
鹅细小病毒单克隆抗体的制备与鉴定   总被引:2,自引:2,他引:0  
为制备鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),利用浓缩的GPV免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆后获得一株抗GPV单克隆抗体杂交瘤细胞株4B4。经鉴定,其McAb的重链为IgG1亚型,轻链为κ链。ELISA和Western blotting试验结果表明,获得的4B4株McAb可特异性的识别GPV和GPV-VP3蛋白,表明4B4株McAb识别的表位可能位于GPV VP3蛋白的保守区域。为进一步鉴定GPV的表位和GPV诊断试剂的研究奠定了基础。  相似文献   

16.
【目的】 建立基于绵羊肺炎支原体表面脂蛋白P60的间接ELISA方法。【方法】 利用生物信息学软件对P60蛋白进行抗原性分析,筛选出抗原性最佳的区域,扩增目的基因后构建重组表达载体并进行基因测序,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导抗原性最佳蛋白表达并进行诱导时间优化;利用SDS-PAGE分析该蛋白分子质量大小及其表达形式。以重组蛋白作为抗原,绵羊肺炎支原体阳性血清作为抗体,通过Western blotting方法分析其反应原性。以重组蛋白为包被抗原,建立抗原性最佳蛋白的间接ELISA抗体检测方法,用该方法对20份阴性血清进行检测,计算阴阳临界值;检测该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份绵羊临床血清样本进行检测。【结果】 经DNAStar分析,P60蛋白第58-928位氨基酸区域的平均抗原指数在0.8~1.7之间,亲水指数为0~2.0,证明该区域(P6058aa-928aa)抗原性和亲水性较强;通过PCR扩增得到P6058aa-928aa基因,并构建重组表达载体,通过基因测序证明该重组表达载体与预期结果一致。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导浓度为1 mmol/L,诱导10 h时蛋白表达量较高,蛋白分子质量为42 ku,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达;Western blotting结果表明,构建的重组蛋白具有良好的反应原性。对ELISA各条件进行优化结果显示:抗原包被浓度为0.5 μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶100,最佳孵育时间为1.5 h,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4 000,判定阴阳性血清的临界值为0.36。对口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、牛支原体(Mb)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)的标准阳性血清的检测均为阴性,证明该方法特异性较强;敏感性试验结果表明,血清稀释度为1∶2 048时仍为阳性;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均<10%,证明该方法具有较好的重复性。利用所建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份羊血清检测结果表明,二者的阳性符合率为81.6%,阴性符合率为92.6%,总符合率为88.0%。【结论】 本研究建立的间接ELISA方法可用于临床样本的检测,为绵羊肺炎支原体的疫苗免疫效果评价和疾病诊断提供了较为可靠的方法。  相似文献   

17.
本研究旨在了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)S2蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒及亚单位疫苗的研究奠定基础。试验通过反转录PCR的方法扩增PEDV CH/GX/2015/750A株S2基因部分片段(S2A),将其克隆后插入原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-S2A。将原核表达质粒转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达重组蛋白,Ni柱亲和层析法纯化重组蛋白,Western blotting检测重组蛋白S2A的反应原性。纯化复性的重组蛋白S2A免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测获得的多克隆抗体效价,间接免疫荧光法验证制备的多克隆抗体的特异性。结果显示,重组S2A蛋白在IPTG终浓度为0.2 mmol/L时,37 ℃诱导表达3 h可获得最高表达量,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blotting结果显示,纯化复性后的重组蛋白S2A能够与PEDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体效价可达1:32 000,间接免疫荧光结果表明,制备的多克隆抗体能够特异性识别和结合PEDV。结果表明,PEDV S2A蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断试剂盒或亚单位疫苗的候选抗原。  相似文献   

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