温氏附红细胞体部分16S rRNA基因的序列测定和分析

从确诊为附红细胞体感染的黄牛无菌采集血样，抽提附红细胞体基因组DNA，用实验设计的能扩增多种动物血营养菌部分16SrRNA基因的通用引物进行PCR扩增，结果扩增出大小约为370bp的DNA片段。PCR产物序列测定和系统进化分析显示，实验获得的核苷酸序列为温氏附红细胞体的16SrRNA基因，与国外报道的温氏附红细胞体的同源性为97％。反映出不同地理株的温氏附红细胞体存在一定的遗传差异，为牛附红细胞体病的诊断和分子流行病学研究提供科学依据。     

温氏附红细胞体16S rRNA基因的序列测定和分析

从自然感染附红细胞体的湖北黄牛无菌采集血液,分离附红细胞体并提取病原基因组,用血营养菌的16SrRNA基因的通用引物进行PCR扩增,得到长约1.5kb的扩增片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行测序和分析.结果表明该片段全长为1 471 bp（GenBank收录号为AY946266）,同源性分析表明该序列与Neimark公布的温氏附红细胞体（AF016546）的16S rRNA基因序列同源性达到98.7%,证实该病原为温氏附红细胞体,从分子生物学水平证实了温氏附红细胞体在湖北省的存在.将该序列与5种支原体、14种血营养菌及边缘无浆体等的相应序列进行比较,建立系统发育树,结果表明温氏附红细胞体同边缘无浆体的关系较远,而与肺炎支原体组的亲缘关系较近.     

牛附红细胞体16SrRNA基因的克隆测序及分析

无菌采集自然感染附红细胞体的牛血液,提取全血基因组,用血营养菌16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增,得到长约1 500 bp的扩增片段,将其克隆到pMD18-T载体后进行测序和分析.结果,所克隆的牛附红细胞体基因片段大小为1 454 bp,GenBank登录号为FJ375309(丰都株).序列比对结果显示,牛附红细胞体丰都株与武汉株(AY946266)最高,达99.7%,与支原体科代表种同源性为60.7%～76.2%,而与立克次氏体科的立克次氏体和无形体科的无形体同源性仅为51.4%～56.4%,表明牛附红细胞体应归为支原体科,附红细胞体属,而不应属于立克次氏体目,无浆体科.对国内外牛温氏附红细胞体的亲缘关系分析表明,牛温氏附红细胞体无明显的地域性差别趋势.     

猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用

基于猪附红细胞体广东株16S rRNA基因的序列特点，设计合成种特异性引物，建立了猪附红细胞体PCR检测方法。该方法能特异性扩增523bp的猪附红细胞体16SrRNA基因片段，而对猪丹毒杆菌G4T10株、猪链球菌STl71株、多杀性巴氏杆菌E0630株、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、鸡毒支原体和猫血巴尔通氏体CA株的基因组DNA没有扩增带出现。对猪附红细胞体基因组DNA的最小检测量为160pg。通过对38份临床样品的检测，8份为猪附红细胞体感染阳性，其余为阴性。结果表明，建立的PCR检测方法具有极高的敏感性和特异性，可用于急性猪附红细胞体病和临床健康带菌猪的诊断。     

奶牛附红细胞体16S rRNA基因的克隆、测序及系统发育进化树的建立

为了从分子水平上证实奶牛附红细胞体的存在及研究其分类学地位,利用原核生物16S rRNA基因通用引物对分离纯化的疑似奶牛附红细胞体进行16S rRNA基因的PCR扩增及克隆测序。结果扩增出长约1.5 kb的目的片段,测序结果表明:目的片段长度为1 439 bp,其核苷酸序列与国外已发表的牛温氏附红细胞体(E.wenyoni)的16SrRNA基因片段同源性高达97.1%,暂称为中国广西株(E.wenyoniCGX)。系统发育进化树显示:E.wenyoni和其他血营养菌在系统进化关系上组成了一个大的进化分支,与支原体科、支原体属的病原最接近(75%),而与立克次体科的病原较远(55%)。分析结果支持了Nei mark等和Messick等提出的将这类血营养菌划归支原体科、支原体属的建议。     

猪附红细胞体MSG1基因的克隆及序列分析

为研究猪附红细胞体MSG1基因的遗传变异特点,从上海地区3个屠宰场采集自然感染附红细胞体的猪血液,提取基因组DNA,根据GenBank已经发表的猪附红细胞体MSG1基因序列(登录号AM407404.1),设计引物进行PCR扩增,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析.结果共获得了82条猪附红细胞体MSG1基因序列,序列长度为1 011 bp,共编码336个氨基酸.同源性分析显示与GenBank中已经发表的猪附红细胞体MSG1基因核苷酸序列相似性为96.5％～98.3％,氨基酸的相似性为97.9％～99.1％0.MSG1基因核苷酸序列的系统进化分析表明,上海地区猪附红细胞体分离株与GenBank登录的德国54/96分离株序列的亲缘关系较远.     

猪附红细胞体检测方法研究进展

猪附红细胞体病是由猪附红细胞体寄生在猪红细胞表面而引起的感染性疾病,以高热和急性黄疸性贫血为典型临床症状.有关该病原的分类地位国内外一直不统一.<伯吉氏细菌鉴定手册>第八版将其归属于立克次氏体目无形体科附红细胞体属.依据对各种附红细胞体16S rRNA基因序列的系统进化分析结果,Neimark等[1-2]认为附红细胞体16S rRNA基因序列与支原体属生物16S rRNA基因序列的亲缘关系较近,提议将其划入支原体属.目前,绝大多数英文学术论文已将附红细胞体属归为支原体属.我国学者对流行于国内的病原的遗传学和分子生物学特征尚未进行系统研究,因而仍然沿用附红细胞体的命名.     

猪附红细胞体病诊断方法研究进展

附红细胞体病(eperythrozoonsis)是由附红细胞体(eperythrozoon)感染动物机体后,寄生于宿主红细胞表面、血浆及骨髓等处引起的一种以发热、黄疸、贫血为主要临床特征的人畜共患传染病(Kreier等,1976).附红细胞体在<伯杰细菌鉴定手册>中列为立克次体目,无浆体科,附红细胞体属(Gwaltney等,1995).近几年对猪附红细胞体病原基因进行序列分析研究认为,猪附红细胞体应更名为猪嗜血性支原体或猪支原体.     

猪源附红细胞体rnpB基因的克隆与序列比较

为了解猪源附红细胞体(Mycoplasma spp.)RNA酶P RNA(RNase P RNA,rnpB)基因序列变异状况,将实验室保存的经16S rRNA基因序列分析鉴定的53份猪源附红细胞体阳性DNA样品用于rnpB基因的扩增,扩增产物克隆至pMD18-T载体并进行序列测定。将获得的序列与GenBank登录的猪附红细胞体(Mycoplasma suis)德国分离株rnpB基因序列(登录号:EF523602)进行分析和比对,利用MEGA5.0软件构建系统发育树,并与16S rRNA判定结果进行比较。结果共得到42条猪附红细胞体rnpB基因和11条小附红细胞体(M.parvum)rnpB基因序列。猪附红细胞体上海分离株rnpB基因与GenBank登录的猪附红细胞体德国分离株rnpB基因之间的核苷酸序列相似性为98.1%~100.0%;小附红细胞体上海分离株rnpB基因与猪附红细胞体德国分离株rnpB基因序列的相似性为91.0%,与猪附红细胞体上海分离株rnpB基因序列相似性为90.0%~91.0%。系统进化分析显示猪附红细胞体rnpB基因与小附红细胞体rnpB基因分布在不同聚簇上,与16S rRNA基因序列鉴定结果一致。     

利用半套式PCR扩增16S rRNA基因检测牛和猪附红细胞体

根据GenBank收录的猪和牛附红细胞体16SrRNA基因序列设计1对通用引物，在其上游引物内侧叉设计1条分别针对猪和牛附红细胞体的特异性引物。以这4条引物对出现附红细胞体痛典型症状及疑似症状的猪和牛的血样DNA进行半套式-PCR扩增。结果显示，该反应阳性率为58．3％，低于临床解剖和镜检结果。对谈基因的序列测定结果进行分析，表明不同动物附红细胞体的16SrRNA基因同源性在80％以上。从谈基因来看，附红细胞体与立克次氏体没有同源性，而与肺炎支原体和穿透支原体亲垮关系较近。     

Development and evaluation of a polymerase chain reaction assay using the 16S rRNA gene for detection of Eperythrozoon suis infection.

The 16S ribosomal RNA (rRNA) gene of Eperythrozoon suis was amplified using gene-specific primers developed from GenBank sequence accession U88565. The gene was subsequently cloned and sequenced. Based on these sequence data, 3 sets of E. suis-specific primers were designed. These primers selectively amplified 1394, 690, and 839 base-pair (bp) fragments of the 16S rRNA gene from DNA of E. suis extracted from the blood of an experimentally infected pig during a parasitemic episode. No polymerase chain reaction (PCR) products were amplified from purified DNA of Haemobartonella felis, Mycoplasma genitalium, or Bartonella bacilliformis using 2 of these primer sets. When the primer set amplifying the 690-bp fragment was used, faint bands were observed with H. felis as the target DNA. No PCR products were amplified from DNA that had been extracted from the blood of a noninfected pig or using PCR reagents without target DNA. The detection limits for E. suis by competitive quantitative PCR were estimated to range from 57 and 800 organisms/assay. This is the first report of the utility of PCR-facilitated diagnosis and quantitation of E. suis based on the 16S rRNA gene. The PCR method developed will be useful in monitoring the progression and significance of E. suis in the disease process in the pig.     

Two genetic clusters in swine hemoplasmas revealed by analyses of the 16S rRNA and RNase P RNA genes

Only two hemoplasma species, Eperythrozoon parvum and Mycoplasma suis, have been recognized in pigs. Here we demonstrate the genetic variations among six hemoplasma strains detected from pigs, by analyzing the 16S rRNA and RNase P RNA (rnpB) genes, and propose a novel hemoplasma taxon that has not been described previously. Phylogenetic trees based on the nucleotide sequence of the 16S rRNA gene indicated that these six hemoplasmas were divided into two clusters representing M. suis and a novel taxon. We further examined the primary and secondary structures of the nucleotide sequences of the rnpB gene of the novel taxon, and found it distinct from that of M. suis. In conclusion, we unveiled a genetic cluster distinct from M. suis, suggesting a new swine hemoplasma species or E. parvum. Our findings also suggest that this novel cluster should be included in the genus Mycoplasma.     

奶牛附红细胞体的分类鉴定及诊断方法的建立

为了从分子水平上确定奶牛附红细胞体（E．wenyoni）的分类学地位及建立奶牛附红细胞体感染诊断方法。本研究通过利用原核生物16S rRNA基因通用引物，对分离得到的奶牛附红细胞体（广西株，E．wenyoni-GX）进行16SrRNA基因的克隆及测序。并建立系统发育进化树；同时根据测序结果设计诊断引物，建立奶牛附红细胞体感染的PCR诊断方法。结果扩增出长约1．5kbp的奶牛附红细胞体的16SrRNA基因片段；特异性试验和敏感性试验表明。所建立的PCR方法与常见支原体、细菌及原虫元交叉反应，能检测奶牛附红细胞体最低DNA量为0．145fg。通过试验结果分析，建议将奶牛附红细胞体这类血营养菌划归入支原体科、支原体属；同时，所建立的PCR诊断方法是特异、敏感、快速的，可应用于临床检测。     

猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法的建立及应用

根据GenBank上发表的猪附红细胞体16S rRNA基因序列(登录号U88565)设计合成2对引物,建立了猪附红细胞体单管巢式PCR诊断方法,经酶切分析、单管巢式PCR进一步鉴定后进行序列测定,并与血涂片染色镜检、常规PCR进行了比较。结果:扩增的猪附红细胞体基因序列与GenBank中发表的猪附红细胞体基因序列(U88565)同源性为96%;特异性试验表明,设计的引物不能扩增弓形虫、链球菌、大肠杆菌、葡萄球菌及羊附红细胞体等病原体;敏感性试验表明,单管巢式PCR诊断方法最低能够检测出0.116 fg的标准模板DNA。通过对75份血液样本的检测表明,建立的单管巢式PCR方法明显优于血涂片染色镜检法及常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性。本试验建立的单管巢式PCR诊断方法具有特异、敏感、实用等优点,为猪附红细胞体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术。     

猫血巴尔通体研究概况

猫血巴尔通体是引起猫发生传染性贫血的病原之一,在分类学上归属于立克次体目、无形体科.最近有很多新的研究指出这类病原体应归属于支原体目,"血巴尔通体"和"附红细胞体"也应该合称为"血营养性支原体"(Hemotrophic mycoplasmas).猫血巴尔通体作为血营养性支原体的重要代表,己经被广泛深入地研究,文章对其病原学、流行病学、发病机制、防治等方面的研究成果进行回顾与总结,以期对本病有进一步认识,对其他血营养性支原体的研究提供参考.     

Exploratory study of Mycoplasma suis (Eperythrozoon suis) on four commercial pig farms in southern Brazil

Mycoplasma suis (Eperythrozoon suis) was detected by PCR and Southern blot in 186 pigs (121 sows, 61 piglets and four boars) on four farms in southern Brazil. DNA was extracted from blood samples and a 16S rRNA gene fragment of M suis was amplified by PCR; Southern blot analysis was then performed on all the samples. Twenty-two of the sows (18.2 per cent) were positive by PCR, and 40 (33.1 per cent) were positive by Southern blot; only one piglet and one boar were positive. The packed cell volume and total plasma protein of the pigs and their PCR and Southern blot results were not significantly different on the four farms, but higher proportions of the pigs were positive by Southern blot than by PCR (P<0.05). The packed cell volume and total plasma protein concentrations of the M suis positive and negative sows were not significantly different.     

猪附红细胞体PCR诊断方法的建立及应用

根据基因库中已登录的猪附红细胞体新的基因组DNA序列设计引物,从疑似猪附红细胞体(Mycoplasma suis)感染猪全血样品基因组DNA中扩增出了预期长度666 bp的目的DNA片段,通过对24份临床疑似病例样品的PCR扩增及其他病原微生物基因组DNA的特异性扩增试验,建立了E.suis的PCR诊断方法;进一步对PCR产物克隆、测序分析表明,与国外已报道的AJ504999株相关区域核苷酸、氨基酸序列同源性分别为98.19%和96.85%,表明我国分离株与国外株基因组存在差异。