家蚕丝氨酸蛋白酶BmHP14基因的克隆与表达模式分析

家蚕受到外源微生物侵染或损伤时,前酚氧化酶原级联反应中的起始丝氨酸蛋白酶会激活下游信号通路,最终产生黑色素。采用RACE技术,获得了家蚕前酚氧化酶原级联反应起始丝氨酸蛋白酶——血淋巴蛋白酶编码基因的全长cDNA序列,命名为BmHP14(GenBank登录号:JQ954757)。BmHP14 cDNA全长2 508 bp,开放阅读框为2 013 bp,编码670个氨基酸,预测蛋白质分子质量71 kD,等电点5.09,N端17个氨基酸预测为信号肽序列。多重序列比对显示BmHP14与烟草天蛾HP14的相似度很高,达到57%;分子进化树中二者也聚为一支。RT-PCR分析表明,BmHP14在家蚕5龄第3天幼虫脂肪体、马氏管、精巢、卵巢、表皮、血细胞、头部均有表达,其中以脂肪体中的表达水平最高。以黑胸败血芽孢杆菌、大肠杆菌、球孢白僵菌注射侵染家蚕5龄第3天幼虫,Real-time PCR检测显示在受到病菌侵染后,幼虫脂肪体中的BmHP14表达上调。Westernblotting检测结果显示,BmHP14在家蚕体液中以前体和成熟体的形式共同存在。研究结果提示,BmHP14是家蚕前酚氧化酶原级联反应信号通路中的关键酶。     

家蚕miR-0047对丝胶蛋白基因BmSer-1表达的调控作用研究

对家蚕中部丝腺小RNA高通量测序获得若干新miRNA,生物信息学分析发现Bmo-miR-0047可能对家蚕丝胶蛋白基因Bm Ser-1有调控作用。设计特异性茎环引物,利用半定量RT-PCR检测分析家蚕5龄3 d幼虫丝腺(包括前、中、后部丝腺)、头部、脂肪体、表皮、中肠、马氏管、精巢/卵巢、血淋巴细胞和气管等12个器官组织中Bmo-miR-0047的表达情况。结果显示,中部丝腺中Bmo-miR-0047的相对表达量明显高于其他组织,说明在家蚕5龄幼虫期Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因的表达调控存在时空特异性。为了进一步分析Bmo-miR-0047对Bm Ser-1基因表达的调控作用,构建重组表达载体pc DNA3.0(ie1-egfp-pri-miR-0047-SV40)和p GL3(A3-luc-Bm Ser-1 3'UTR-SV40),并以海肾荧光素酶报告质粒pRL-CMV为内参,利用家蚕卵巢培养细胞Bm N进行共转染。转染后检测发现实验组Bm N细胞中的荧光素酶活性与对照组相比显著减弱,表明Bmo-miR-0047在体外培养细胞中对Bm Ser-1基因的表达具有负调控作用。     

家蚕细胞周期素家族基因的克隆及结构特征与表达分析

细胞周期素(cyclin)是推进细胞周期进程最主要的调控因子之一,并与个体发育及肿瘤形成等有关。为研究细胞周期素家族基因在家蚕组织中的表达情况,利用家蚕基因组数据库信息设计引物克隆了家蚕细胞周期素家族的5个基因,对基因序列结构的分析结果表明,cyclinA、cyclinB、cyclinB3基因分别有7个外显子,cyclinE基因有8个外显子,cyclinL1基因只有1个外显子;cyclinA及cyclinE基因存在较多的剪切方式,cyclinA主要包含大小为2 141和2 173 bp的2种转录本,其变化在第7外显子,cyclinE则含有1 422、1 290及1 194 bp等大小不同的序列,变化集中于第5～7外显子,而cyclinB、cyclinB3及cyclinL1基因则相对稳定。克隆的家蚕细胞周期素家族基因的组织表达存在差异:cyclinA基因只在精巢中表达,cyclinB3基因只在精巢和卵巢中有明显的表达,cyclinE基因在丝腺、脑、脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢及血液8种组织都有表达,cyclinB和cy-clinL1基因在除丝腺或血液外的其他7种组织检测到表达。研究结果为进一步探究不同细胞周期素在昆虫蜕皮、变态等生理过程中的功能提供了参考。     

野桑蚕羧酸酯酶基因(BmmCarE-2)的克隆及表达分析

羧酸酯酶参与昆虫对有机磷和氨基甲酸酯等杀虫剂抗性的产生。通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了一个野桑蚕羧酸酯酶全长基因(BmmCarE-2)。序列分析表明该基因包含1个1 623 bp的开放读码框,有57 bp的cDNA5′端非翻译区序列(5′UTR)和79 bp的cDNA3′端非翻译区序列(3′UTR),编码540个氨基酸,GenBank登录号为EU328351。序列比对分析表明BmmCarE-2与家蚕羧酸酯酶基因BmCarE-2(GenBank登录号:DQ311250)的氨基酸序列相似性最高,达98.9%。利用半定量RT-PCR进行组织表达分析表明,BmmCarE-2在野桑蚕幼虫的头部和脂肪体表达量较高,在丝腺和中肠稍低,而在血液中的表达量最低。     

家蚕亲环蛋白A基因(BmCyPA)的克隆与表达分析

亲环蛋白(CyP)能与免疫抑制剂环孢霉素A(CsA)结合而作为CsA的胞内受体。在已构建的家蚕蛹cDNA文库中获得了家蚕亲环蛋白A(BmCyPA)基因的cDNA序列。利用生物信息学方法对此序列的开放阅读框(ORF)和序列同源性等进行分析,并以家蚕蛹总RNA反转录的cDNA为材料克隆了BmCyPA,通过原核表达目的蛋白后,将纯化的BmCyPA融合蛋白免疫新西兰兔得到抗血清,Western blotting检测目的蛋白在蚕体中得到表达。利用荧光定量PCR方法检测家蚕5龄幼虫各组织中BmCyPA mRNA的转录水平,由高到低依次为脂肪体、丝腺、中肠、马氏管、表皮、头部、气门、卵巢;Western blotting检测BmCyPA在5龄幼虫各组织中的表达水平,由高到低依次为脂肪体、气门、表皮、马氏管、中肠、丝腺、头部和卵巢。亚细胞定位显示Bm-CyPA在细胞质与细胞核中均有分布。推测BmCyPA与家蚕的生长发育以及促进蛋白质折叠和介导免疫应答等有密切联系。     

细胞周期素家族基因在家蚕4龄幼虫蜕皮过程中的转录特征

细胞周期蛋白(cyclin)是真核生物细胞有丝分裂的重要调节蛋白,家蚕具有5种类型细胞周期蛋白基因。以4龄将眠蚕、4龄眠蚕和5龄起蚕为材料,采用定量PCR方法分析5种细胞周期蛋白基因在4龄幼虫蜕皮过程的组织表达特征为:5种类型cyclin基因在生殖腺中都高表达,其中cyclinE在眠中表达量最高,其它4种类型cyclin基因在将眠时表达量最高,证实4龄眠期是家蚕生殖腺细胞发生有丝分裂的重要时期;5种类型cyclin基因在马氏管中都有表达,其中cyclinA和cyclinB3在4龄将眠蚕的马氏管中存在表达高峰,推测和马氏管内表皮更新相关;除cyclinL1在眠蚕丝腺的表达量很低外,cyclinA、cyclinB、cyclinB3和cyclinE在眠蚕丝腺中都存在表达高峰,可能和丝腺的内表皮更新相关;cyclinA、cyclinB、cyclinB3在脂肪体中的表达量较高,且在将眠时或眠中存在表达高峰,推测和脂肪体中能量物质的积累相关;5种类型cyclin基因在脑、血液和中肠的表达量都很低,且蜕皮前后的变化规律不明显。研究结果提示:在家蚕4龄幼虫蜕皮过程中,cyclin基因的转录特征不仅和来源于外胚层组织的表皮更新相关,还和生殖腺的发育及脂肪体中能量物质的积累存在相关性。     

家蚕细胞周期素E基因在5龄幼虫组织表达的剪切变体和表达谱特征

细胞周期素E(cyclinE)是调控细胞周期从G1期进入S期的关键因子。利用家蚕基因组数据库信息设计引物,克隆家蚕cyclinE在5龄幼虫不同组织表达的cDNA序列,获得该基因的6种不同剪切变体,这6种剪切变体前4个外显子和最后一个外显子都相同,变化主要集中在第5~7外显子处。同源性比对显示,不同物种来源的cyclinE周期蛋白盒区域具有较高的保守性,有35个氨基酸的共同保守序列,该区域可能也是家蚕cyclinE的特异识别并结合细胞周期素依赖蛋白激酶的功能区域。利用实时定量PCR分析显示,cyclinE在家蚕5龄第3天幼虫的中肠、脂肪体、丝腺、脑、马氏管、精巢、卵巢、血液等8种组织、器官中均有表达,并且在脂肪体中的表达相对较高,推测cyclinE基因在家蚕脂肪体细胞分裂过程中发挥重要作用。     

家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6A8的克隆及序列与表达分析

昆虫细胞色素P450第6亚家族(CYP6)氧化酶在对异源有毒物质的代谢中具有重要作用。采用生物信息学方法获得与果蝇CYP6亚家族基因cyp6A8同源的家蚕cyp6A8基因序列,预测该基因的开放阅读框(ORF)为1572bp,编码523个氨基酸,推定的蛋白分子质量为61.52kD,等电点为8.17。以家蚕5龄第3天幼虫头部cDNA为模板,用设计的特异引物PCR扩增出一条约1500bp的条带,大小与家蚕cyp6A8基因的ORF预测值接近,命名为Bmcyp6A8基因(GenBank登录号:GQ241737)。同源性分析结果:Bmcyp6A8基因与野桑蚕cyp6AE8基因的相似性为93%;与棉铃虫cyp6AE12基因的相似性为57%;与人cyp3A43基因的相似性为48%。芯片数据分析显示Bmcyp6A8基因在家蚕5龄第3天幼虫的头部、表皮与中部丝腺前部高量表达,与家蚕CYP6亚家族的其它横向同源基因不同的是,只有该基因在中部丝腺前部表达,推测其具有功能特异性。     

家蚕变态期酚氧化酶原基因PPO1的表达谱分析

酚氧化酶在昆虫的变态发育和免疫防御机制中起着非常重要的作用。利用GenBank上登录的家蚕酚氧化酶原基因PPO1的cDNA序列设计正反向特异引物,通过半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测了家蚕变态期(从5龄第3天到化蛾)雌、雄个体酚氧化酶原基因PPO1的转录活性。家蚕雌性变态期的PPO1基因仅在5龄第4天和上蔟第0、12、24、36、48、60小时及第3、4、5、6、8、10天有表达,其中上蔟第48小时和上蔟第3天的表达量最高;而在雄性家蚕变态期,该基因仅在5龄第4、5、6天及上蔟第36、48小时与第3、5、9、10天和蛾期有表达,其中上蔟第5天的表达量最高。家蚕PPO1基因的转录表达具有时空特异性,推测其在家蚕雌、雄个体变态发育的不同时期中执行不同的功能。     

不同家蚕品种与野桑蚕大龄期幼虫血淋巴和体壁中的多酚氧化酶活性检测分析

多酚氧化酶(PPO)在昆虫的变态发育和免疫防御中有重要作用。选择菁松、黑缟和大造3个家蚕品种及来自桑园的野桑蚕作供试昆虫,以其担负免疫功能的血淋巴和作为免疫屏障的体壁组织为材料,测定与分析家蚕、野桑蚕幼虫大龄期及化蛹前血淋巴和体壁中的PPO活性变化。3个家蚕品种幼虫血淋巴中的PPO活性由高到低依次为菁松、黑缟、大造,体壁中的PPO活性由高到低依次为大造、黑缟、菁松。野桑蚕幼虫不论是血淋巴还是体壁,其PPO活性均低于家蚕,其中血淋巴的PPO活性显著低于家蚕。家蚕幼虫血淋巴的PPO活性在整个5龄期都较高,体壁的PPO活性则是在5龄中后期和上蔟期较高。野桑蚕幼虫血淋巴的PPO活性在5龄中期较高,体壁的PPO活性则是在5龄末期较高。另外发现2个供试家蚕品种幼虫血淋巴和体壁间的PPO活性变化呈完全相反的情况:菁松的幼虫是血淋巴中的PPO活性较高,体壁中的PPO活性较低;大造的幼虫是血淋巴中的PPO活性较低,而体壁中的PPO活性较高。上述结果提示:家蚕、野桑蚕幼虫的PPO活性变化具有明显的发育时期和组织特异性,且家蚕的PPO活性高于野桑蚕,家蚕品种间的PPO活性的组织差异性也不尽相同。这些结果为研究家蚕蜕皮变态过程中的体壁形成和先天免疫功能等提供了新的信息。     

杀虫剂溴氰菊酯对野桑蚕和家蚕的毒力比较

基于了解野桑蚕(Bombyxmandarina)和家蚕(Bombyxmori)对农用杀虫剂溴氰菊酯的抗药性差异,采用点滴法和浸叶法测定了溴氰菊酯对野桑蚕和家蚕的毒力,结果其毒力基本一致。野桑蚕和家蚕对溴氰菊酯的敏感度均较高,LD50在0.027~0.429 ng/头之间,但吴江野桑蚕、启东野桑蚕和苏大野桑蚕的抗药性较相对敏感的家蚕品种大造、菁松、皓月强10.11~15.89倍,较家蚕品种L11强4.37倍。     

中国野桑蚕和日本野桑蚕的RAPD研究

用RAPD PCR技术初步研究了中国野桑蚕与日本福冈野桑蚕之间的DNA多态性。结果表明 ,不同地域中国野桑蚕个体之间及其与日本福冈野桑蚕个体之间均呈现出丰富的DNA多态性。中国野桑蚕同家蚕共有带率达 3 5 5 % ,同日本福冈野桑蚕为 4 5 1% ,而日本福冈野桑蚕同家蚕为 3 2 % ;中国野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为0 5 2 ,日本野桑蚕与家蚕的平均遗传距离为 0 6 3,与中国野桑蚕的为 0 5 8,而且与中国沈阳地区野桑蚕之间的遗传距离最近 ,为 0 4 8,以此创建了它们的系统进化树。     

野桑蚕和家蚕的环境适应性比较研究

野桑蚕和家蚕对不同组分人工饲料的食性比较研究表明 ,野桑蚕不取食无桑叶粉的人工饲料 ,4 8h不出现疏毛现象 ,其食性较家蚕单一。以完成虫态的积温研究二者对气象环境的适应性 ,发现野桑蚕对气象环境的适应性较家蚕强 ,野桑蚕完成不同虫态所需的有效积温较稳定。对野桑蚕和家蚕添食农药和紫外辐照处理 ,结果表明野桑蚕对不良的环境的耐受性较家蚕强 :添食相同浓度的农药 ,家蚕全部中毒死亡 ,而野桑蚕却部分存活 ,且正常化蛹 ;紫外线辐照可使野桑蚕提前老熟营茧     

基于mtDNA ND1基因的家蚕进化分析

对中国青州野桑蚕mtDNA中ND1基因进行了克隆和序列分析。结果显示,野桑蚕ND1基因全长为933bp,编码310个氨基酸残基,A+T含量较高,达78.7%;同源性分析显示,不同来源的家蚕和野蚕ND1基因在核苷酸水平和氨基酸水平具有很高的相似性;以ND1基因的核苷酸序列及氨基酸残基序列进行了家蚕及野桑蚕的分子进化分析,进一步证明家蚕起源于中国野桑蚕。用mtDNA的ND1基因的核苷酸序列Blast家蚕的基因组序列,发现家蚕基因组中存在与ND1基因部分区域同源的序列,表明家蚕基因组中存在起源于线粒体的假基因。     

中国野桑蚕滞育激素基因的克隆与序列分析

根据家蚕DH PBAN基因序列设计特异引物 ,以中国野桑蚕基因组DNA为模板进行PCR扩增 ,获得了1 5 85kb的目的片段 ,将其克隆进pMD18 T载体 ,测序和同源性比较结果表明 :该片段由 3个外显子、2个内含子组成 ,2个内含子均为典型的GT AG结构 :该片段编码中国野桑蚕滞育激素 (DH)及DH引导肽 ;中国野桑蚕DH及引导肽与家蚕及日本野桑蚕的DH及引导肽氨基酸序列完全相同 ,其基因cDNA序列的同源性分别为 99 3%、97 2 %。研究结果进一步显示了中国野桑蚕与家蚕之间的近缘关系。     

家蚕、野桑蚕线粒体Cyt b基因片段序列分析及分子进化研究

以家蚕中系一化地理品种延吉、印度多化品种迈索尔、欧系一化品种法 4 0 8油和中国镇江地区野桑蚕为材料 ,采用PCR技术扩增了其线粒体 (mitochondrialDNA ,mtDNA)细胞色素b(cytochromeb ,Cytb)基因 ,测定其 5′端5 91bp的核苷酸序列 ,并从GenBank中调取中系家蚕品种C10 8、夏芳 ,日系家蚕品种青熟 ,韩国家蚕品种Backokjam和日本野桑蚕的相应序列 ,进行同源性比较 ,发现日系家蚕品种青熟 ,印度家蚕品种迈索尔 ,欧系家蚕品种法 4 0 8油 ,韩国家蚕品种Backokjam和中系家蚕品种C10 8、延吉序列间的同源性最高 ,相互间均为 10 0 % ;日本野桑蚕与各家蚕品种序列间的同源性约 94 %～ 95 % ;中国野桑蚕与各家蚕品种序列间同源性约 98%～ 99%。分子进化树分析显示日本野桑蚕和各家蚕品种相应序列的分歧时间远远早于中国野桑蚕与各家蚕品种序列的分歧时间 ,这是在分子水平上证实家蚕起源于中国野桑蚕的证据之一。     

野桑蚕和不同家蚕品系幼虫体内1-脱氧野尻霉素含量测定

采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)-紫外检测法测定了野桑蚕和不同品系家蚕体内的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量,并调查了家蚕5龄幼虫不同组织不同生长时期1-DNJ含量的变化。野桑蚕与家蚕、家蚕不同品系间的1-DNJ含量存在极显著差异:野桑蚕全蚕粉中1-DNJ含量最高,质量分数平均为0.427 8%;家蚕以黄血蚕最低,平均0.220 5%。家蚕5龄幼虫不同组织的1-DNJ含量也存在明显差异:家蚕血干粉中的1-DNJ含量最高,质量分数达0.848 7%;其次是中肠、体壁和脂肪体组织,分别为0.512 2%、0.472 2%、0.308 5%;而在丝腺中几乎检测不出1-DNJ。家蚕5龄幼虫体内1-DNJ含量随发育时期呈明显变化,5龄第4天含量最高,达0.329%,第5天以后迅速下降。     

野桑蚕线粒体ND5基因及其两端侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

应用PCR技术,对中国山东青州野桑蚕mtDNA的ND5基因及其两端侧翼区域进行了克隆和序列分析。结果表明,在所测定的2．2kb左右的片段中,含有ND5基因的完整序列及Phe-tRNA(UUC)、Ser-tRNA(AGC)、Glu- tRNA(GAA)、His-tRNA(CAC)等4个tRNA基因,该片段的基因组结构与家蚕及其它地域来源野桑蚕的基因组结构基本一致,显示蚕类线粒体基因排列的保守性。ND5结构基因在不同家蚕及野桑蚕之间的比对分析表明,它们在核苷酸水平、氨基酸水平的同源性很高,相似性达96%以上。4个tRNA基因的碱基错配率较高,TψC环缺乏相对保守的T-ψ-C-Pu-A序列,各臂的碱基配对数、各环碱基数目变化较大。以ND5基因的核苷酸序列及氨基酸残基序列进行了家蚕及野桑蚕的分子进化分析,进一步证明家蚕起源于中国野桑蚕。     

家蚕、野桑蚕海藻糖酶基因启动子的特性及其滞育激素的转录调节

以pGEM 3Z为载体 ,分别构建了家蚕 (Bombyxmori)和野桑蚕 (Bombyxmandarina)海藻糖酶基因启动子控制的荧光素酶基因报告质粒 ,利用昆虫细胞瞬时表达系统进行启动子特性分析 ,并就家蚕滞育激素对海藻糖酶基因启动子转录活性的调节作用进行了研究。结果表明 :家蚕和野桑蚕海藻糖酶基因启动子在家蚕Bm5细胞、Sf2 1细胞中都有转录活性 ,但是活性都很低 ;家蚕滞育激素在体外条件下对家蚕海藻糖酶基因启动子活性的调节有明显的剂量效应 ,13～ 33nmol/L时有明显的增强作用 ,由此推测来自家蚕卵巢的Bm5细胞可能存在与滞育激素作用的受体。     

驯化影响下的家蚕3种抗菌肽基因的进化模式

抗菌肽作为昆虫的先天性免疫效应因子在昆虫物种进化过程中起着至关重要的作用。测定了家蚕(Bombyx mori)和野桑蚕(Bombyxmandarina)群体的3种不同类型的抗菌肽基因DefA、CecE和MorB3的序列,通过序列核苷酸多态性分析、中性检验、溯祖模拟分析和连锁不平衡分析,发现这3种抗菌肽基因呈现不同的进化模式:DefA属于驯化过程中人工选择的靶基因;CecE是经历了驯化瓶颈效应的中性基因;MorB3的进化受遗传漂变影响。尽管进化模式不同,但家蚕的3种抗菌肽基因连锁不平衡程度均高于野桑蚕,反映家蚕经历了瓶颈效应,群体数量减小导致基因重组率降低。这些结果为理解家蚕不同抗菌肽的进化和功能提供了重要信息。