羊口疮病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测羊口疮病毒(ORFV)的方法,基于羊口疮病毒保守序列B2L基因合成一对用于建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的特异性引物,将ORFV B2L全长基因和pMD19-T质粒载体连接,构建重组阳性质粒,以构建的重组质粒DNA作为模板,建立ORFV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的ORFV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法线性关系良好,重复性好,扩增效率高,无引物二聚体和非特异性扩增,最低检测限为2.13×101copies/μL,比普通PCR高出1 000倍,该方法对绵羊羊痘病毒和山羊痘病毒的核酸cDNA不检出,特异性好;对180份山羊全血样本进行ORFV检测,结果得出常规PCR阳性检出率为2.8%(5/180),荧光定量PCR阳性检出率为4.4%(8/180)。试验表明,本次建立的ORFV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法特异性强、敏感度高、重复性好,适用于羊口疮病毒临床样本的检测。     

蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平实时定量PCR方法的建立

为了利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术对蒙古绵羊雌性生殖道β-防御素基因表达水平进行相对定量测定,建立蒙古绵羊β-防御素基因相对表达水平的实时荧光定量PCR方法,试验根据GenBank中羊β-防御素基因序列设计合成引物,进行实时荧光定量PCR,同时以β-Actin为内参基因对β-防御素基因进行均一化处理,利用荧光阈值(Ct值)计算β-防御素基因的相对表达量.结果表明:扩增产物为β-防御素;利用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术可以测定蒙古绵羊β-防御素基因表达水平相对含量.     

华支睾吸虫囊蚴SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

为了建立一种特异且敏感的华支睾吸虫囊蚴SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，试验针对华支睾吸虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基1(CSCOⅠ)基因设计特异性引物，筛选最佳引物浓度和退火温度，绘制标准曲线，优化扩增体系和程序建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法，并评价该方法的敏感性、特异性、重复性及符合性。结果表明：最佳引物浓度为750 nmol/L,最佳退火温度为57℃。标准曲线的斜率为-3.21,截距为35.23,相关系数(R²)为0.982 3。该方法的最低检出限为1×10² copies/μL;批间和批内变异系数分别为1.53%～2.59%和0.36%～0.76%,表现出良好的重复性；仅标准阳性质粒、华支睾吸虫囊蚴及肝片吸虫出现特异性扩增曲线，具有较好的特异性；与传统压片镜检法比较符合率为96%。说明试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异、稳定，为后续开展淡水鱼感染华支睾吸虫囊蚴的流行病学调查提供了技术支持。     

膜连蛋白A2基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立膜连蛋白A2(AnxA2)基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,根据GenBank中公布的AnxA2基因序列设计并合成引物,经过条件优化,建立了AnxA2SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。该方法线性关系较好,以质粒标准品构建的标准曲线相关系数R2为0.999;灵敏性好,比普通PCR灵敏100倍。应用建立的方法对随机选取的几种哺乳动物细胞进行检测。结果表明,建立的方法能成功检出不同细胞中AnxA2含量。表明本研究建立的AnxA2SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏性高,重复性好,可用于AnxA2的检测及定量分析。     

牛传染性鼻气管炎gE基因TaqMan-MGB与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法，本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物，分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，并对2种方法进行了综合比较。结果显示，TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×10¹ copies/μL和1.0×10² copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性；重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品，2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明，2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。     

H1亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种检测H1亚型禽流感病毒(AIV)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法.根据对GenBank中H1亚型AIV HA基因序列的分析,设计针对H1亚型AIV的HA基因特异性引物,并以H1亚型AIV的cDNA为模版,构建重组阳性质粒.采用梯度稀释重组标准品阳性质粒DNA的方法,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(real-time PCR)标准曲线.敏感性试验结果显示,扩增效率和标准误差分别为100.9％和0.011 7,熔解曲线呈单一熔解峰.在35个Ct值内该方法可检测到100个拷贝的标准品DNA;特异性试验结果显示,该方法对于其他亚型AIV和禽呼吸道病原体不能检出;重复性试验结果显示,组内变异系数小于1％.建立的Real-time PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于临床上H1亚型AIV的检测.     

PCV4 SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型（PCV4）的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×102~5.64×109 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×102 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测猪细小病毒方法的建立及初步应用

根据GenBank登录的猪细小病毒株NADL-2(NC001718)的VP2基因序列设计1对特异性引物,经PCR扩增出431bp的目的片段。回收产物与pMD18-T vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为标准模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,R2=0.997 6,产物Tm为82.3～82.9℃,检测灵敏度为72.1拷贝/μL,特异性和重复性良好。本试验所建立的检测PPV VP2基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,为该病毒的致病机制研究、临床早期诊断及定量分析PPV感染程度奠定了基础。     

猪SP-A基因荧光定量PCR检测方法的建立

SP-A(surfactant protein-A)mRNA的表达对肺的发育、成熟均起关键作用,并且与肺部疾病的发生相关。为了建立荧光定量PCR技术检测猪SP-A表达量的方法,根据猪SP-A基因的mRNA序列(EU622632)设计引物,从纯化模板、PCR程序设计等方面进行了优化,建立了基于SYBR Green I染料技术的Power SYBR(Green荧光定量PCR方法。结果表明,所建立的Power SYBR(Green荧光定量PCR方法检测猪SP-A基因具有特异性好、简便、可靠等特点,为猪SP-A基因定量分析奠定了基础。     

鸡传染性贫血病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)的实时荧光定量PCR检测方法,本试验通过CIAV基因组保守区域设计1对扩增片段大小为180bp的特异性引物,构建pGM-T-CIAV重组质粒,制备阳性标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示,CIAV的Ct阈值与标准品浓度在5.33×108至5.33×103拷贝/μL间呈良好的线性关系,相关系数R2=0.998,斜率为-3.443,产物Tm值在86℃左右。该方法与网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)J亚型、马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组均无交叉反应,敏感性为5.33拷贝/μL,比普通PCR高1 000倍,批内和批间重复试验变异系数均小于3%。结果表明,本试验建立的CIAV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可实现对鸡传染性贫血病的早期诊断及感染程度的定量分析的检测。