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模拟感染家蚕微粒子病的蚕卵、蚕蛾PCR检测的初步研究 总被引:2,自引:2,他引:2
在比较研究不同浓度家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)孢子与模拟染毒N .b孢子蚕卵、蚕蛾的模板DNA制备方法的基础上 ,选用MP1/MP2和V1F/ 5 30R两对引物进行PCR扩增检测。结果为 :碱性条件预处理N .b孢子后再抽提的DNA ,其得率略高于常规方法抽提的DNA ,但两者的模板质量相同 ;MP1/MP2和V1F/ 5 30R两对引物均可有效地检出N .b孢子DNA ,前者的检测灵敏度为 1μL 3× 10 6mL-1以上浓度的N .b孢子DNA ,后者为 1μL 3× 10 5mL-1以上浓度 ;对不同浓度N .b孢子DNA与蚕蛾DNA混合后进行PCR检测 ,V1F/ 5 30R引物的检测灵敏度为1μL 3× 10 6mL-1N .b孢子DNA。 相似文献
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家蚕微孢子虫单抗金银染色法检测技术的研究 总被引:5,自引:2,他引:3
使用新构建的抗家蚕微孢子虫(N.b)的单克隆抗体,结合免疫金银染色(IGSS),进行检测N.b。设计6种温度和5种时问,对N.b等9种微孢子虫检测,结果表明,该细胞株单抗直接IGSS法最佳工作条件:胶体金标记pH值6.2~6.5,金标抗体染色37℃、保湿30min,经显影后光镜观察,N.b孢子周边被染上棕褐色,其它类型孢子呈无色或浅褐色;实验还比较了抗原涂片后,不同物理、化学方法固定,结果甲醇固定效果较好。 相似文献
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柞蚕微孢子虫单克隆抗体的研制及诊断 总被引:3,自引:0,他引:3
研究报告了柞蚕微孢子虫Nosemaantheraeae(简称N .a)单克隆抗体制备及免疫胶体金银染色法 (IGSS)诊断的结果。用抗N .a的单抗结合间接免疫胶体金银染色法 (IGSS)对 6种微孢子虫进行检测 ,在光学显微镜下柞蚕微孢子呈现特异的褐色 ,能与包括家蚕微孢子虫在内的其它 5种微孢子虫加以区别。 相似文献
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家蚕微粒子孢子单克隆抗体的研制及其在检测上的初步应用 总被引:4,自引:2,他引:2
将家蚕微粒子Nosema bombycis孢子免疫的BALB/c小鼠的脾细胞和FO细胞融合,经克隆筛选获得6株能稳定分泌抗N.bombycis孢子表面抗原的单克隆抗体细胞株(Nb_(1-6))。其中Nb_(1-2)和Nb4分泌的抗体属于IgM,Nb_3,Nb_5和Nb_6分泌的分别为IgG_2b、IgG和IgG_3。特异性检查结果表明,除Nb_4和Nb_6对柞蚕微粒子孢子有交叉凝集反应外,其余均对家蚕N.bombycisJ孢子具特异性。杂交瘤细胞培养上清液对N.bombycis孢子的凝集效价以Nb_1为最高,达1:256,由此细胞株诱发的腹水效价高达1:5000。建立了以普通聚苯乙烯酶标板为载体,完整的N.bombycis孢子为抗原的LEISA测定方法,最低检测量为700个孢子。 相似文献
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粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)培养细胞对家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)的吞噬过程观察 总被引:1,自引:1,他引:0
观察微孢子虫在非天然宿主细胞系的生物行为过程,有助于探究微孢子虫的侵染特异性机制。选用鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni,Tn)细胞系为材料,接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)孢子后观察其吞噬过程。结果发现:经氢氧化钾发芽预处理的Nb孢子虽然可以在Tn培养细胞液中发芽,但未见发芽孢子的孢原质进入Tn培养细胞;在接种Nb孢子浓度为2.0×105mL-1以上时,观察到孢子通过内吞作用进入了Tn培养细胞,但未见孢子的增殖;随着时间的延长和进入Tn培养细胞的Nb孢子的增加,可引起Tn培养细胞的超微结构变化,并导致细胞的裂解。以上结果说明,虽未见Nb以发芽形式感染Tn培养细胞,但Nb能够被吞噬进入Tn培养细胞并破坏其结构。 相似文献
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家蚕微孢子虫孢子DNA的提取、克隆及部分DNA序列分析 总被引:3,自引:3,他引:0
报道家蚕微孢子虫(Nosemabombycis简称N.b)孢子DNA的提取、克隆及部分DNA序列测定的结果。采用SDS-蛋白酶K将孢子破碎,用苯酚一氯仿法提取孢子的DNA。将N.b孢子DNA与pTZ18R质粒重组,转化于大肠杆菌DH5,获得4个阳性克隆株:pTZ18RN.b1,插入片段为1kb;pTZ18RN.b2,为1.2kb;pTZ18RN.b3为1.8kb及pTZ18RN.b4为1.9kb,经Southern印迹杂交,证实插入的DNA片段为家蚕N.b孢子所特有。与MG1(Nosemasp.),蓖麻蚕微孢子虫、蓝萤叶甲微孢子虫及蚕卵的DNA均无同源性。用双脱氧链终止法测定4个克隆株插入片段的部分DNA的序列,经检索尚未发现同源性的基因序列。讨论了PCR技术诊断家蚕微孢子虫孢子与近缘种的问题。 相似文献
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从广西蚕区的野外昆虫菜粉蝶(Pieris rapae)、桑尺蠖(Hemerophila atrilineata)、斜纹夜蛾(Spodoptera litura)的体内收集到5株对家蚕有一定食下感染力的微孢子虫,通过生物学性状、分子系统发育研究,为其分类鉴定提供依据。来自野外昆虫的5株微孢子虫均具有Nosema属的生物学特性:显微镜下观察形状均呈长卵圆形,与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)有较明显差异;在生活史的各发育阶段均为双核,以二分裂方式增殖,最后形成双核成熟孢子;与Nb抗血清均产生阳性凝聚反应;超微结构观察均具双核,极丝圈数在12~14圈之间,极丝倾斜角与Nb有差异。根据5株野外昆虫微孢子虫与其它昆虫微孢子虫基于SSU rRNA基因序列构建的系统发育树,以及基于SSU rRNA和rRNA ITS基因序列进行的相似性和遗传距离分析,初步认为5株野外昆虫微孢子虫与家蚕微孢子虫同属异种。 相似文献
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解明家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)入侵宿主细胞的相关因素,有助于深入研究Nb对家蚕的侵染机制。利用激光共聚焦显微镜观察Nb孢子接种粉纹夜蛾(Trichoplusiani,Tn)培养细胞48h后孢子的分布状态和培养细胞的生长情况,并对接种Nb孢子后的Tn培养细胞培养物总蛋白进行SDS-PAGE分析,证实经0.2mol/LKOH预处理的Nb孢子可以被Tn培养细胞所吞噬。对Nb孢子孢壁蛋白的SDS-PAGE分析显示,Nb孢子经KOH预处理后,大小为80kD和12kD的孢壁蛋白带缺失或明显减弱,30kD的孢壁蛋白带丰度降低。推测KOH预处理使Nb孢子部分孢壁蛋白被分解(部分或完全)或使蛋白结构发生变化,由此影响了Nb孢子与Tn培养细胞的相互作用关系,有利于Tn培养细胞对Nb孢子的吞噬。 相似文献
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Michalczyk M Sokół R Szczerba-Turek A Bancerz-Kisiel A 《Polish journal of veterinary sciences》2011,14(3):385-391
The objective of this study was to compare the effectiveness of the multiplex PCR method and traditional light microscopy in identifying and discriminating the species of Nosema spp. spores in worker bees from winter hive debris in the Province of Warmia and Mazury (NE Poland). A total of 1000 beesdead after from the bottom of the hive from bee colonies were analyzed. Spores were identified with the use of a light microscope (400-600x magnification). Spores were assigned to species by the multiplex PCR method. The microscopic evaluation revealed the presence of Nosema spp. spores in 803 samples (80.3%). Nosema ceranae spores were observed in 353 positive samples (43.96%), Nosema apis spores were found in 300 samples (37.35%), while 150 samples (19.67%) showed signs of a mixed infection. A multiplex PCR analysis revealed that 806 samples were infested with Nosema spp., of which 206 were affected only by Nosema ceranae, 600 showed signs of mixed invasion, while no samples were infected solely by Nosema apis parasites. In two cases, the presence of spores detected under a light microscope was not confirmed by the PCR analysis. The results of the study indicate that Nosema ceranae is the predominant parasitic species found in post-winter worker bees from the bottom of the hive in the region of Warmia and Mazury. 相似文献
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家蚕肠球菌体外抑制微孢子发芽的动力学研究 总被引:1,自引:0,他引:1
研究表明,家蚕微孢子的浓度(y)与孢子悬浮液的吸光值(OD_(625))(x)之间的函数关系可用y=2.712×1O~6x来表示,即可用分光光度计法快速准确地测定孢子的发芽率。微孢子在不同处理液中发芽的动力学曲线显示:经磷酸缓冲液、培养基的透析液或培养基的20%~80%饱和废硫酸铵盐析蛋白质处理微孢子在8min之内快速发芽;而经肠球菌培养上清液的透析液或培养上清液的20%~80%饱和度硫酸铵盐析蛋白质处理的微孢子在30min内发芽十分缓慢,两者对孢子发芽的最终相对抑制率分别达到65.95%和70.08%;抑制微孢子发芽的活性物为肠球菌的外分泌物,其分子量在3.5kD以上,具有良好的热稳定性。研究结果初步揭示了肠球菌外分泌物质抑制家蚕微孢子发芽的动力学机制。 相似文献
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从家蚕体内分离得到一株新的病原性微孢子虫,编号为GXM1。光学显微镜下观察GXM1微孢子虫为长卵圆形,大小(1.85±0.15)μm×(4.19±0.18)μm,在生活史的各发育阶段均为双核,以二分裂方式增殖,发育速度缓慢,发育周期约8~10 d。GXM1微孢子虫与家蚕微孢子虫(Nb)的抗血清产生阳性凝聚反应。利用透射电子显微镜观察到GXM1微孢子虫的超微结构具双核,极丝11~12圈,极丝倾斜角约45°。以上生物学性状显示GXM1微孢子虫具有微孢子虫属(Nosema)的基本分类特征。依据GXM1微孢子虫与其它昆虫微孢子虫的SSU rRNA基因序列构建的系统发育树,以及序列相似性和遗传距离分析,进一步证实GXM1微孢子虫属于Nosema属。GXM1微孢子虫对蚁蚕的半数感染浓度(IC50)为6.06×105mL-1,对家蚕的胚种传染率可达23.28%,是一株具有较强致病性和危害性的家蚕病原性微孢子虫。 相似文献
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家蚕微孢子原虫(Nosema bombycis)在Antheraea eucalypti细胞中的增殖 总被引:3,自引:0,他引:3
家蚕微孢子原虫( Nose m a bo m bycis) 经 K O H 处理后,接种于 Antheraea eucalypti 细胞系,调查其生活史。 K O H 处理的孢子发芽率约为443 % 、 Antheraea eucalypti 细胞的初期感染率约为30 % ,接种36h 后,裂殖子数量急速增加,72h 达到最高峰。接种48h 后可观察到短极丝孢子发芽后形成的空孢壳和二次感染体。感染 Nosem a bo mbycis 48h 前的家蚕血淋巴对 Bm N 细胞无感染性,而感染72h 的血淋巴则表现出感染能力。 相似文献