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相似文献
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1.
流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
应用RT-PCR方法扩增了禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)1.7kb的HA基因,将其克隆到pUC19的BamHI位点,筛选到阳性重组子 pUCH5。然后将 HA基因亚克隆到杆状病毒转移载体 pBlueBacHisB,筛选到重组转移载体pBacH5。经过序列分析证明阅读框架正确后,在脂质体转染试剂介导下,pBacH5与线性化的杆状病毒 DNA(Bac-N-Blue DNA)共转染Sf9昆虫细胞。重组杆状病毒经三轮蚀斑纯化,获得纯化的重组杆状病毒rBacH5。提取重组杆状病毒DNA经PCR扩增证明目的基因片段插入到杆状病毒基因组中。间接免疫荧光染色试验、血凝试验和 Western blot试验结果表明 HA基因在重组杆状病毒感染的Sf9细胞表面获得表达。重组杆状病毒表达的HA蛋白能够凝集公鸡红细胞,血凝价1280-2560HAU/ml。HA蛋白在杆状病毒表达系统的成功表达,为禽流感亚单位疫苗的研制奠定了基础。  相似文献   

2.
将猪繁殖与呼吸综合征症病毒CH-al株囊膜糖蛋白(GP5)一向克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中,与太毒线性DNA(Bac-N-Blue^TMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后,获得重组杆状病毒rBac=GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后,应用间接免疫荧光试验、SDS-PAGE和Western blot检测表明,GP5基因在杆癍病毒系统中获得了高效表达,表达产物因糖基  相似文献   

3.
采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,以自行设计的H7和Н5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因特异的两对引物,分别扩增了禽流感病毒A/AfricanStarling/983/79(H7N1)株和G株(广东鹅体分离株,H5N1)约1.7kb的HA全基因cDNA。将所扩增的两个基因cDNA未端经T4DNA聚合酶修饰后分别插入pUC18和pBluescript质粒中,得到了两个基因的重组质粒。本研究为国内禽流感病毒分子生物学研究奠定了基础  相似文献   

4.
对RT-PCR扩增的禽流感病毒A/Chicken/Xinjiang/1/96(H14N5)分离株核蛋白基因进行了序列分析。结果表明:所克隆的基因包含了全部核蛋白阅读框架,编码区为1494个核革酸,比较性研究表明,该毒株与A/Mallard/Astraknah(Gurjev)/263/82(H14N5)有很高的同源性,而与人流感病毒株有较大,显示出明显的禽流感病毒特征。  相似文献   

5.
RT-PCR快速诊断禽流感   总被引:18,自引:0,他引:18  
根据禽流感病毒NP基因的序列分析结果,设计了一对NP基因特异的引物。采用该对引物,不经病毒分离,直接从禽流感病毒感染鸡的气管、泄殖腔棉拭子和组织样品中提取核酸, RT~PCR可以扩增出 326bp的 NP基因片段。采用该技术对14个亚型禽流感病毒标准参考株,4个亚型12株国内分离野毒株,RT-PCR检测的结果都呈阳性;对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒以及减蛋综合症病毒,RT-PCR扩增结果都呈阴性。禽流感病毒 A/Goose/Guangdong(H5N1)和 A/African Starling/England(H7N1)实验感染鸡样品 RT-PCR检测与鸡胚病毒分离阳性率分别为34/42、32/42; 24/55、24/55, 二者符合率大于95%。 RT-PCR最少可检测到10pg的病毒核酸。对山东某地发病鸡场样品进行RT-PCR检测,只用6个小时就可得出准确的诊断结果,证明RT-PCR检测方法敏感特异,可用于禽流感的快速诊断。  相似文献   

6.
禽流感病毒分离株A/Chicken/Xinjiang/1/96(H14N5)NP基因序列分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
对RTPCR扩增的禽流感病毒A/Chicken/Xinjiang/1/96(H14N5)分离株核蛋白基因进行了序列分析。结果表明:所克隆的基因包含了全部核蛋白阅读框架,编码区为1494个核苷酸。比较性研究表明,该毒株与A/Malard/Astrakhan(Gurjev)/263/82(H14N5)有很高的同源性,而与人流感病毒株有较大,显示出明显的禽流感病毒特征。  相似文献   

7.
根据反义RNA作用原理,以禽流感病毒(AIV)H14N5 cDNA全长及5’端235个bp为目的基因,反向插入反转录病毒载体 pLXSN中,命名为 pLXSN-NP及 pLXSN-NP,用脂质体包裹重组质粒转染包装细胞 PA317,G418筛选抗性克性,扩增单个克隆后提取包装细胞上清的病毒RNA(vRNA),以巢式PCR方法检测,以及用包装细胞上清(重组病毒)感染滴定细胞系NIH3T3,表明已筛选出产毒的的克隆细胞质,得到重组逆转录病毒,为反义RNA抑制禽流感病毒复制的实验研究奠定了物质基础。  相似文献   

8.
中国农业大学动物医学院吴清民、高齐瑜等将禽流感病毒H9N2亚型毒株核蛋白(NP)基因3’端较为保守的,约350 bp的编编序列通过限制性内切酶HaeⅢ切割、分离后,用随机引物法制备 Dlgoxigenin -11-duTP标记探针。测定该探针的浓度为100μg/mL。特异性试验发现该探针只能与实验室构建的、含有NP基因的重组载体PGEM-TE-NP和pBacPAk-NP以及A到流感病毒H9N9型、N3N2亚型以及H9N3亚型毒株基因组RNA结合出现特异性的颜色反应,而与实验室常用的载休pGEM-T…  相似文献   

9.
对猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N)作为ELISA抗原进行了研究,将编码PRRSVN蛋白的基因0RF7cDNA插入杆状病毒表达载体pBlueBacHis2A,通过同源重组获得了重组杆状病毒ORF7-AcMNPV,感染昆虫细胞SF9表达了N蛋白,占细胞总蛋白的7.07%,纯化后作为抗原建立了间接ELISA,与IDEXX公司的ELISA诊断试剂盒有96%的符合率,与IFA有100%的符合率。试验证实:PRRSVN蛋白在昆虫细胞中得到高效表达且是检测PRRSV抗体的良好抗原。  相似文献   

10.
将禽流感病毒H9N2 亚型毒株核蛋白(NP)基因3′端较为保守的、约350bp 的编码序列通过限制性内切酶HaeⅢ切割、分离后,用随机引物法制备Digoxigenin11dUTP标记探针。测定该探针的浓度为100μg/m l。特异性试验发现该探针只能与实验室构建的、含有NP基因的重组载体pGEMTENP和pBacPAKNP以及A 型流感病毒H9N2亚型、H3N2 亚型以及H9N3 亚型毒株基因组RNA 结合出现特异性的颜色反应,而与实验室常用的载体pGEMT easy、pBacPAKHis 3、pTARGET 和pGEMEX2 以及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和传染性喉气管炎病毒基因组不发生反应。应用该探针检测含NP基因的重组载体和重组病毒证明该探针是有效的,可用于含禽流感病毒样品或材料的检测。  相似文献   

11.
从小反刍兽疫病毒全长cDNA中对血凝素蛋白H基因进行特异扩增,回收PCR产物分别连接于T载体酶切及测序分析后,将其亚克隆至真核表达转移载体pFastBacHT,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒。重组质粒转染sf9细胞后连续传3~4代,分别收获细胞上清及沉淀用于SDS-PAGE及Western blot对重组H蛋白的检测,用抗His蛋白单抗在细胞中检测到H标签蛋白,单抗在细胞及上清中检测到大小为46 ku的融合蛋白。  相似文献   

12.
猪流感病毒核蛋白基因的原核表达及其在诊断中的初步应用   总被引:11,自引:3,他引:11  
根据GenBank中A/Swine/Hong Kong/126/82(H3N2)株猪流感病毒(SIV)NP基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR扩增了我国SIV分离株A/Swine/Heilongjiang/3/2000(H3N2)的核蛋白(NP)基因.将扩增所得NP基因克隆于pMD18-T载体,酶切鉴定后对其序列分析表明NP基因与香港分离株同源性高达93.8%,然后定向亚克隆NP基因于原核表达载体pET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有NP基因的重组质粒命名为pET-NP.用pET-NP转化受体菌BL21,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品.经SDS-PAGE电泳分析证实NP基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG诱导下,6 h其表达量达到高峰,经Western blot分析证实表达的重组核蛋白具有反应活性,大小约为60kD.用表达产物作琼脂扩散试验,结果表明表达产物与SIV抗血清可形成清晰的反应沉淀线,而与其它9种猪病原阳性血清不发生反应.正常菌体蛋白与SIV阳性血清也不发生反应.通过对40份送检血清样品的检测结果显示其与HI试验的相符率高达95%以上.试验证明利用原核表达系统制备的重组核蛋白作为诊断用抗原,不仅制备过程简单而且所建立的琼扩诊断方法特异、快速、简便,其灵敏度也能满足现地的使用要求.目前正在进行现地的中试试验.  相似文献   

13.
利用PT-PCR方法扩增鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DB株的核蛋白基因,并对其序列进行了测定,DB株IBV的核蛋白基因长度为1230bp,编码蛋白由409个氨基酸残基组成。与已发表的参考毒株进行核苷酸同源性比较,发现DB株与澳大利亚群毒株的亲缘关系最为密切。同时构建了杆状病毒重组转移载体pBlue-DB-N,将其与线性化的杆状病毒DNA共转染Sf9昆虫细胞,经过3轮蚀斑纯化和聚合酶链式反应(PCR)鉴定,获得重组杆状病毒rBac-DB-N。SDS-PAGE分析和Western blot检测的结果表明DB株IBV核蛋白基因基因在重组杆状病毒感染原Sf9昆虫细胞内获得表达,融合蛋白最大表达量占细胞蛋白总量的19.4%左右。  相似文献   

14.
SUN Peng 《中国畜牧兽医》2017,44(6):1840-1846
This experiment was conducted to study the protein expression of F gene of Newcastle disease virus (NDV) type Ⅶ by baculovirus expression system.The F gene was amplified by RT-PCR and cloned into pFastBac HT A plasmid, and then the recombinant plasmid was transformed into DH10Bac competent cells to get the positive recombinant bacmid.After 72 h transfection of Sf9 cell with recombinant bacmid, the expression of interest protein was detected by indirect immunofluorescence assay (IFA), SDS-PAGE analysis and Western blotting. Serum antibody titers of immunized SPF chickens were determined by ELISA and the protective properties were determined by protection test. The results showed that F gene was expressed in Sf9 cells infected with the recombinant baculovirus. The expressed protein could induce high titer specific antibody against NDV. The protective rate of recombinant F protein group was 90%, which was significantly higher than that of the negative control group. These results laid a foundation for study on NDV subunit vaccine.  相似文献   

15.
将非典型犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)的核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)基因克隆到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建含N基因的重组供体质粒pFastBac-N,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经筛选获得含N基因的重组Bacmid DNA(rBacmid-N),脂质体法转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒vBacmid-N。用vBacmid-N感染昆虫细胞Sf9,免疫印迹(Western blot)分析,在62kDa处出现一条特异蛋白条带,与重组N蛋白的理论值相符合;间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescent assay,IFA)检测,vBacmid-N感染的昆虫细胞sf9出现特异绿色荧光。以纯化的重组N蛋白为抗原建立CDV抗体间接ELISA检测方法,犬CDV阳性血清A450大于0.40,而犬CDV阴性血清A450小于0.05,显示了良好的抗原特异性与稳定性。  相似文献   

16.
从pMD18-THA阳性质粒扩增了H9N2亚型禽流感病毒的HA2基因,将扩增到的HA2基因克隆至昆虫杆状病毒转移栽体pBlueBacHis2A中。将其与杆状病毒共转染于Sf9昆虫细胞,经蚀斑筛选纯化重组杆状病毒,用其感染Sf9昆虫细胞,并优化表达条件。SDS-PAGE和Western-blotting分析表明,表达产物的分子质量约为27ku。Dot-ELISA分析表明,表达的HA2融合蛋白可与鸡抗HgN2亚型血清发生特异性反应,而与H5和H7亚型抗血清间无交叉反应。  相似文献   

17.
将鸡传染性法氏囊病病毒超强毒Gx株vp2基因克隆到载体pFastBac HTA中,构建重组转座载体pFVP2,然后将其转化DH10Bac感受态大肠杆菌,将vp2基因整合到Bacmid穿梭载体中,获得重组穿梭载体BacmidVP2;通过脂质体转染将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacVP2。用Western blot和间接免疫荧光试验分析表明IBDV VP2蛋白在Sf9昆虫细胞获得正确表达,所表达的重组VP2蛋白分子量约50 Ku。以rBacVP2感染Sf9细胞裂解物免疫3周龄SPF鸡,在免疫后7 d可检测到ELISA抗体;免疫后14 d可检测到琼脂免疫扩散抗体。攻毒试验表明,初次免疫后14 d对IBDV超强毒株的攻击保护率为75%,2次免疫后14 d对其的攻击保护率为100%。  相似文献   

18.
【目的】对华南地区分离到的1株H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)流行株NP蛋白进行原核表达,制备H9N2亚型AIV NP蛋白多克隆抗体。【方法】将1株H9N2亚型AIV的NP基因克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建NP蛋白原核表达质粒。将重组质粒同时转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白。通过考马斯亮蓝染色和Western blotting分析并比较NP蛋白在两种表达菌中的表达量,进一步优化诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度等条件,提高蛋白的表达效率。采用镍柱亲和层析法对NP蛋白进行纯化,用BCA法测定蛋白浓度。以纯化的NP蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,通过Western blotting和间接免疫荧光对所制备的多克隆抗体进行鉴定,通过间接ELISA测定抗体效价。【结果】试验成功构建pET-32a-H9N2-NP原核表达质粒并表达重组NP蛋白。考马斯亮蓝染色和Western blotting结果均表明,重组NP蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达水平远高于大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,其大小约73 ku。诱导条件优化结果显示,重组NP蛋白在37 ℃、IPTG终浓度为1 mmol/L诱导7 h时的表达量最大,且通过镍柱纯化后得到纯度较高的重组蛋白。Western blotting和间接免疫荧光结果均表明,所制备的多克隆抗体能高效地与H9N2亚型AIV发生特异性结合。间接ELISA测得多克隆抗体的效价为1∶409 600。【结论】本研究制备的兔抗NP蛋白多克隆抗体效价较高,表明NP蛋白具有良好的免疫原性,为今后NP蛋白单克隆抗体的制备和ELISA检测方法的建立奠定了基础。  相似文献   

19.
为了研发小反刍兽疫病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原物质,参照GenBank公布的小反刍兽疫疫苗株Nigeria75/1的全基因组序列(GenBank登录号:X74443),人工合成表达核蛋白的N基因开放阅读框序列,通过PCR扩增、经引物设计引入的EcoRⅠ和KpnⅠ特异性酶切位点,将N基因克隆于昆虫杆状病毒表...  相似文献   

20.
为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-p72。再将其转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。Western blot和夹心法ELISA分析表明ASFV p72基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达,重组p72蛋白可以被特异性抗ASFV血清、p72单克隆抗体识别,表明该蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性。为进一步研究p72蛋白的结构、功能和免疫学特性奠定基础。  相似文献   

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