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相似文献
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1.
根据已发表的牛传染性敢管炎病毒(IBRV)TK基因和gB基因序列,应用Oligo4.1程序设计两对引物PTK1和PTK2及PB1和PB2,分别对已构建的TK基因缺失(TK)IBRV以及IBRVLA株、洛精、美精、BarthaNu/67株、B7株、云南-1和云南-2分离株进行了PCR扩增,结果显示7株IBRVDNA用引物PTK1和PTK2扩增产生457bp的特异性片段,而TKIBRV只出现110bp  相似文献   

2.
以人工合成的针对血清I号马立克氏病病毒(MDV1)A抗原基因(gA)部分序列的两端寡聚核苷酸为聚合酶链反应(PCR)的引物,分别对马立克氏病病毒血清I型(京-1株,MD11/75C株);2型(SB-1株);3型(火鸡疱疹病毒的FC126株)毒株和GA株BamHI B片段的PACY184克隆重组质粒DNA进行基因扩增反应及其敏感性试验。结果表明,该引物不仅对MDV1具有较强的特异性,而且由此引物引导  相似文献   

3.
RT-PCR检测禽传染性支气管炎病毒   总被引:2,自引:0,他引:2  
用2对已发表的引物和1对自行设计的引物对同一禽传染性支气管炎病毒(IBV)H120株进行RT-PCR,分别获得了S1基因上与引物设计相一致的1720、228、602bp的扩增片段。用自行设计的引物对7个毒株(H120、H52、M41、Conn、Gray、T、Holte)和5个分离株(宜毒、上毒、云毒、HK、118)的含毒尿囊液或纯化病毒进行RT-PCR,结果除Holte株和2个分离株(宜毒、云毒)外,其余均成功地扩增出600bp的片段。用1.7、0.2、0.6kb3对引物对6个IBV毒株和6个分离株的含毒尿囊液在相同和不同条件下进行RT-PCR,结果3对引物分别扩增出3、5、9株IBV,同时可将不同血清型的12个IBV株分成6种基因型。将IBV分离株HK与标准株M41经PCR扩增、HaeⅢ和Hind酶切、RFLP分析,表明属同一马萨诸塞血清型。3株IBV(H120,HK,M41)在鸡胚中繁殖,PCR最早检出的时间为20~24h。RT-PCR提供了直接从尿囊液和感染鸡组织中快速检测病毒的新方法。  相似文献   

4.
猪繁殖—呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH—1a株基因型鉴定   总被引:29,自引:4,他引:25  
根据猪繁殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)美洲型毒株和欧洲型毒株的基因组序列设计合成了2对引物,即1008PS/1009PR和1010PLS/1011PLR。我国分离的CH-1a株用这2对引物均能扩增出与预期大小相符的RT-PCR产物,分别与美洲型代表株(VR-2332)的RT-PCR产物大小相当。特异性试验表明,这2对引物均不能扩增其他常见的繁殖障碍相关病毒的RNA或DNA以及未感染的MARC-145细胞RNA。间接免疫荧光试验也证明,CH-1a株与PRRSV核衣壳蛋白特异性单克隆抗体以及美洲型毒株抗血清均呈阳性反应。因此初步证实CH-1a株为美洲型PRRSV。  相似文献   

5.
禽流感RT-PCR诊断法的建立   总被引:5,自引:0,他引:5  
根据禽流感病毒(AIV)A/Chicken/Breslin/1902(H7N7)株的血凝素(HA)基因参考序列设计合成一对H7HA特异引物,并应用SDS-蛋白酶K法提取病毒RNA,建立了逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测AIVRNA的方法。应用此法对鸡胚培养的AIV尿囊液、SPF感染鸡粪便进行了检测,并与琼脂扩散试验和电镜技术作了对比。特异性试验以新城疫病毒(NDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、减蛋综合征病毒(EDS-76V)等的感染鸡胚尿囊液作为对照。结果表明,AIV尿囊液RT-PCR全部阳性,SPF感染鸡粪便87份,RT-PCR检出69份阳性,样品处理浓缩后琼脂扩散检出11份,电镜检测了23份样品,仅检出2份阳性。非特异性对照样品经RT-PCR检测全部阴性。将AIV感染鸡胚尿囊液作10倍系列连续稀释,可检出稀释度为10-2的病毒尿囊液。RT-PCR最早检出时间为感染后第3天,而琼扩和电镜均是7天。该法具有高度的特异性和灵敏性,且节约时间(只需8小时左右),可从分子水平上对AIV进行早期快速诊断和流行病学调查  相似文献   

6.
番鸭细小病毒与鹅细小病毒的PCR鉴别诊断   总被引:7,自引:0,他引:7  
通过比较基因bank中番鸭细小病毒(MDPV)和鹅细小病毒(GPV)的全基因序列,针对两种病毒非结构蛋白基因序列的相同区段,分别设计了两对PCR引物LHMP/LHMP2和LHGP1/LHGP2,用这两对引物分别对MDPV和GPV进行检测,其结果引物LHMP1/LHMP2只特异性地扩增MDPV,而引物LHGP1/LHGP2也只特异性地扩增GPV,并且两对引物均扩增出约720bp的长度序列。  相似文献   

7.
传染性法氏囊病RT-PCR诊断方法研究   总被引:3,自引:0,他引:3  
本文在研究传染性法氏囊病病毒的A片断cDNA结构的基础上,用Primer  Design引物设计软件,在VP_5和VP_2的重叠基因区设计了一对引物,使用该引物对6种IBDV的标准毒株,10例自然发病病鸡组织标本,8例IBDV J_1C_7F_3种毒株攻毒病理法氏囊组织标本,进行了RT-PCR检测均得到了阳性的扩增结果。2种参考鸡病病毒和8例健康鸡的法氏囊组织在同样条件下进行扩增均为阴性结果。本法具有扩增方法简单,对各种病毒株的适应性广,特异性高,检测成本较低的特点。  相似文献   

8.
禽流感RT—PCR诊断法的建立   总被引:34,自引:1,他引:33  
根据禽流感病毒(AIV)A/Chicken/Breslin/1902(H7N7)株的血凝素(HA)基因参考序列设计合成一对H7HA特异引物,并应用SDS-蛋白酶K法提取病毒RNA,建立了逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测AIVRNA的方法,应用此法对鸡胚培养AIV尿囊液,SPF感染鸡粪便进行了检测,并与琼脂扩莠试验和电镜技术作了对比,特异性试验以新城疫病毒(NDV),传染性氏囊病病毒(IBD  相似文献   

9.
参照澳大利亚鸡传染性法氏囊病病毒( I B D V)00273 毒株基因组序列设计的 1 对引物,位于 V P2 高可变区两端,通过 R T P C R,扩增了 5 个 I B D V 山东分离株 V P2 基因的 607~1 080 位核苷酸片段(aa203~306)。 P C R 产物经纯化后,分别用 Dra Ⅰ、 Sac Ⅰ、 Ssp Ⅰ、 Pst Ⅰ和 Sau3 A I共 5 种限制性内切酶( R E)进行消化处理,结果 5 个分离株均为 Dra Ⅰ(- )、 Sac Ⅰ(- )和 Sau 3 A I(+ ), L C2 和 T A 株为 Ssp Ⅰ(+ ), L C1 和 J N 株为 Ssp Ⅰ(- ), L C1 和 L C2 株为 Pst Ⅰ(+ ), J N、 L L 和 T A 株为 Pst Ⅰ(- );5 个分离株的酶切图谱与美国变异株迥异,而 T A 株与日本超强毒株 9011 相类似。5 个分离株与现用疫苗株对比,至少在 V P2 可变区内存在着一定的差异,这可能是 I B D V 接种免疫鸡群仍然暴发 I B D 的原因之一。  相似文献   

10.
根据已发表的52/70株传染性腔上囊病病毒(IBDV)基因组序列,设计并合成了一对物异扩增IBDV VP2基因的引物。以超强毒IBDV(vvIBDV)致弱株GZ20基因组为模板利用技术扩增出了1.5kb的cDNA产物,将VP2基因克隆于pUC119质粒上,得到重组pUC119质粒。并对VP2基因全序列测定,序列分析和聚类分析表明,该致弱株与无毒疫苗株PBG98和弱毒株CU-1非常相似,而与经典强毒  相似文献   

11.
为满足同时对IBRV和AKAV进行快速诊断的需要,根据牛疱疹病毒1型(BHV 1)gB基因序列和赤羽病病毒(AKAV)的S基因序列,设计了2对针对这2种病毒的特异引物,并建立了多重PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明:该方法能同时扩增得到2条与试验设计相符的311 bp(I BRV)和392 bp(AKAV)特异性条带;IBRV的灵敏度为0.13 pg/25μL,AKAV的灵敏度为1.04 pg/25μL。本试验方法的建立对于加强进出口牛IBRV和AKAV的检验检疫具有十分重要的意义。  相似文献   

12.
奶牛传染性鼻气管炎病毒gG基因PCR检测方法的建立   总被引:2,自引:1,他引:1  
本试验旨在建立一种PCR技术,既能快速检测牛传染性鼻气管炎病毒,又能区分同属病毒牛疱疹病毒5型和伪狂犬病病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒gG基因的特异性引物,建立PCR方法,对牛传染性鼻气管炎病毒参考毒株和阳性样本进行扩增,结果均能扩增出一条463 bp的特异性条带;对同属的牛疱疹病毒5型进行扩增,获得651 bp和431 bp两条带;对同属伪狂犬病病毒进行扩增,获得493 bp的条带;而非相关病毒(如猪呼吸与繁殖综合征病毒等),不能扩增出条带。对牛传染性鼻气管炎病毒的检测灵敏度为2×10-3 PFU/mL。鉴于该方法具有良好的灵敏度和特异性,将在牛疱疹病毒感染诊断和标记疫苗免疫后的鉴别诊断方面具有良好的应用前景。  相似文献   

13.
建立一种PCR技术,既能快速检测疱疹病毒1型成员牛传染性鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitisvirus,IBRV),又能区分牛疱疹病毒5型和伪狂犬病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒的gD基因序列,应用primer 5.0软件设计了gD PCR引物,建立PCR方法,反应条件是:94℃预变性5min,94℃1min,58℃1min,72℃1min,30个循环,72℃7min,4℃5min。该方法能从IBRV阳性样本和参考毒株中扩增出372bp的目的片段,而从同属的牛疱疹病毒5型中扩增出440bp和206bp两条目的片段,从同属的伪狂犬病毒中扩增出303bp的目的片段,但不能从非疱疹病毒属成员猪呼吸与繁殖综合征病毒中扩增出目的条带。该PCR检测IBRV的灵敏度可达1PFU/mL以上。鉴于其灵敏度高、特异性好,可望在牛疱疹病毒感染快速鉴别检测方面发挥重要作用。  相似文献   

14.
根据GenBank中牛腺病毒7型(BAdV-7)的蛋白酶基因序列,设计一对特异性的引物,扩增该序列中775 bp的片段,建立了BAdV-7的PCR检测方法.以Fukuroi株BAdV-7 DNA为模板进行特异性和敏感性试验,结果显示,该方法检测BAdV-7 DNA最小检测量为1ng;与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛轮状病毒(BRV)、牛呼吸道舍胞体病毒(BRSV)和鸡产蛋下降综合征病毒(EDSV)无交叉反应.方法为BAdV-7感染的临床诊断和流行病学调查奠定了基础.  相似文献   

15.
1株牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
在对进口种用奶牛隔离检疫期间,从1头IBRV中和抗体阳性奶牛中分离出1株病毒。该分离株表现类似于IBRV特征的细胞病变,细胞圆缩,聚集成葡萄串样群落,在单层细胞上形成空洞。用特异性抗IBRV阳性血清与其进行中和试验,发现IBRV标准阳性血清对分离株的中和抗体滴度为27,与IBRV标准株的中和抗体滴度相差不到1个滴度。用OIEV推荐的IBR特异性引物对分离病毒进行PCR扩增,获得与设计基因片段大小一致的特异性条带,表明分离到的病毒为IBRV。  相似文献   

16.
本研究针对牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)高度保守的gC基因设计单标记并具有自身荧光淬灭功能的LUX^TM引物,建立L刚新型实时荧光PCR方法用于快速检测IBRV。该方法对四株IBRV细胞培养物的检测均呈典型阳性反应,而对其它动物疱疹病毒以及健康牛组织DNA和细胞对照的检测结果为阴性,检测时间包括核酸提取仅需1h~2h。试验表明,LUX^TM荧光PCR法对IBRV细胞增殖病毒液的检测敏感性可达0.04TCID50,比病毒分离敏感性至少提高10倍;对10倍系列稀释的纯化IBRV核酸样品,L刚荧光PCR的检测敏感性比常规PCR可提高10^3倍。将病毒液添加到健康牛精液和血液样品中,该荧光PCR可检测到牛冻存精液中40TCID50牛抗凝全血、血清和临床精液中0.04TCID50的病毒,说明对临床样品的检测有效。本研究所建立的LUXTM荧光PCR方法快速敏感,适合应用于活牛及其遗传物质的进出口检疫、养牛业疾病防控等领域对IBRV的快速检测。  相似文献   

17.
构建pET32a重组表达载体,转化到BL21(DE3),诱导表达牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白。用已发表的IBRV的gD基因序列设计一对特异性引物,通过PCR方法扩增一条766bp的目的基因gD,将gD基因克隆到原核表达载体pet32a,得到重组表达载体pet32-gD,转化到BL21(DE)中,通过IPTG诱导获得融合蛋白。重组表达蛋白经纯化后,免疫印迹分析。结论证明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。  相似文献   

18.
为了快速检测牛传染性鼻气管炎,采用SDS-蛋白酶K法,提取病毒模板DNA。根据IBRV gB基因序列设计了1对特异引物,在其上下游引物的内侧又分别设计了1对引物,以这4条引物对IBRV模板进行扩增。结果成功扩增出预期目的片段,建立了巢式PCR检测方法。敏感性、特异性等检测试验结果表明该方法能特异检测IBR病毒。本方法具有快速、灵敏、特异的优点,适用于在牛及其遗传物质的进出口检疫中进行牛传染性鼻气管炎快速病原鉴定。  相似文献   

19.
牛病毒性腹泻二温式PCR检测方法的建立   总被引:1,自引:0,他引:1  
根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的5’端非编码区设计了1对可以扩增244bp BVDV某段基因序列的特异性引物,优化建立了BVD的二温式PCR快速检测方法。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法只对BVDV模板进行扩增,而对其他对照病毒的检测均为阴性;最低能检测到1pg牛病毒性腹泻病毒RNA。本研究所建立的BVD二温式PCR方法是一种快速、特异、敏感的检测方法。  相似文献   

20.
牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用   总被引:2,自引:1,他引:1  
为建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒病原的方法,本研究根据GenBank上登录的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测BVDV的一步法RT-PCR方法。该方法对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛副流感病毒3型的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,将为BVDV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。  相似文献   

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