2014-2015年河南省猪瘟野毒E2、E0基因变异分析

为了解河南省猪瘟病毒近2年的分子特征及变异情况,本试验使RT-PCR方法从猪瘟病料中获得了5株猪瘟病毒的E2基因全序列和其中10株E0基因全序列,并对猪瘟病毒阳性样品的E2和E0基因进行测序及变异分析。结果显示:扩增的河南省5株猪瘟病毒的E2基因,其中4株猪瘟病毒E2基因与石门株E2基因相比存在14个氨基酸的变化,1株和石门株E2基因存在4个氨基酸变化。与Shimen株相比,河南省猪瘟病毒的E2基因有1个糖基化位点的突变。扩增的10株猪瘟病毒的E0基因,发现河南省的猪瘟病毒之间E0基因同源性高,且其E0基因从密码子程度上一直在向远离经典毒株Shimen株和疫苗株HCLV的方向发展。对E2基因和E0基因进行进化分析发现河南省猪瘟病毒承受净化选择压力。以E2基因为基础进行分型,发现河南省共同存在猪瘟病毒1.1型和2.1b型;提示河南省猪瘟病毒变异种类更加多样化。     

猪瘟病毒四川分离株E2基因的分子克隆、原核表达及免疫学活性分析

分子克隆猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)四川分离株E2基因,并对其进行原核表达及免疫学活性分析。PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取总RNA,运用RT-PCR扩增E2基因,定向克隆构建原核重组表达载体,转化E.coli Rosetta-gami-TM(DE3)plysS,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达,Western blotting分析表达蛋白的免疫学活性。试验结果表明,成功克隆了E2基因,共1119 bp,包含有编码E2蛋白的完整序列,编码373个氨基酸;成功构建了CS-FVE2基因完整阅读框、主要抗原区原核表达载体pET-E2(pe)、pET-mE2(pe);蛋白质电泳结果显示,成功表达出约45.32、28.49 ku两目的蛋白,而且表达的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白均能被CSFV阳性血清所识别,具有良好的免疫学反应活性。因此,本试验成功获得CSFV四川分离株E2基因,表达出具有生物学活性的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白。     

猪瘟病毒E0蛋白的表达与抗原性研究

本研究采用PCR技术,扩增猪瘟病毒E0蛋白191～227氨基酸基因片段,将其克隆到表达载体pET-30C质粒中,获得重组质粒30C-E0-1725。经酶切、PCR、序列分析,证明插入的目的基因有正确的编码框架。Westernblot试验表明,利用大肠杆菌表达的目的蛋白,能与CSFV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原特异性。     

猪瘟病毒云南毒株的分离鉴定及E2基因的原核表达

从云南10个地州15个大型猪场采集到的21份样品中分离得到5株猪瘟病毒。经测序鉴定昆明、玉溪、曲靖地区分离株的核苷酸序列99.99%同源,大理和宝山地区的核苷酸序列99.99%同源,5株分离毒均属于基因二群。5株分离毒在PK-15细胞上的平均毒价约为2×106TCD50/mL,应用荧光抗体染色可以检测到CSFV。通过RT-PCR扩增猪瘟病毒约1 200 bp的E2蛋白全部抗原编码区序列,并将其分别克隆到pMD18-T载体中。序列分析结果表明,5株分离株的E2基因片段为1173bp,与猪瘟病毒Shimen株的核苷酸同源性为82.5%和84.3%,与C-株的核苷酸同源性分别为83.3%和85.4%。将E2基因插入原核表达载体pET-41a(+),转化进BL21(DE3)内进行表达,经IPTG诱导,E2蛋白能在菌体内高效表达,表达量达26.5%,蛋白分子质量约为41kD。本研究为猪瘟诊断抗原及基因工程疫苗的研制打下基础。     

表达多个外源基因的重组伪狂犬病病毒的构建及其细胞培养特性研究

将SV40启动子控制下的LacZ报告基因表达盒与分别在CMV启动子控制下的含有猪瘟病毒（CS-FV）E2基因及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因的表达盒插入到伪狂犬病病毒（PRV）Bartha-K61株TK基因中，通过蓝斑筛选获得了一株插入CSFVE2、PRRSVGP5与LacZ基因的重组伪狂犬病病毒，命名为rPRV-E2-GP5。经Western blot、间接免疫荧光试验证实E2、GP5基因在重组病毒感染细胞中获得了表达。重组病毒感染Vero、PK-15、IBRS2和CEF细胞后的增殖滴度和致细胞病变特征与亲本病毒比较，无显著差异。本试验结果表明在PRV基因组中可以插入多个外源基因，为进一步研究多价基因工程载体疫苗奠定了基础。     

猪瘟病毒石门株E2蛋白在杆状病毒系统中的表达

以杆状病毒Bac-to-Bac表达系统表达猪瘟病毒(CSFV)石门株的E2蛋白,将CSFV石门株的E2囊膜糖蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得重组转移质粒pFastBacHTA-E2。转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒后转染Sf9昆虫细胞,获得重组病毒。传毒3代后对表达蛋白进行Western blot和间接免疫荧光试验检测。结果显示,E2蛋白获得高效表达,能被抗E2蛋白的单克隆抗体2B10和6×His-单克隆抗体特异性识别,表明CSFV石门株E2囊膜糖蛋白在Sf9昆虫细胞中得到成功表达,具有良好的抗原反应性。     

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白的BHK细胞系的构建

猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。     

猪瘟野毒混合毒实验室感染的研究

本研究以本所近年来所分离的高、中、低三株不同毒力（HeNXH3.98、JL1.94和FJFQ1.99）的猪瘟野毒混合毒对敏感猪进行实验室感染试验，利用HCFA、RT－PCR及序列测定进行检测和分析，结果2头试验猪均在感染后2周发病死亡，表现典型的猪瘟临床症状；序列测定及分析结果表明感染后1周及2周2头实验感染猪所分离的病毒E2基因主要抗原编码区序列完全一致，核苷酸及氨基酸同源性均为1005；与感染毒株序列比较，2头试验感染猪所分离的病毒E2基因主要抗原编码区序列与JL1.94株序列完全一致，核苷酸及 在酸同源性均为100％，且基因分群在同一群；而与HeNXH3.98和FJFQ1.99株序列则有一定的差异，且不在同一基因群或基因亚群，说明在多个猪瘟病毒存在的情况下，敏感猪存在对猪间病毒的优势选择。本试验的条件下3株不同和的猪瘟野毒混合感染以中等毒力毒株JL1.94为优势毒株。     

猪瘟病毒T细胞表位与猪细小病毒VP2融合基因在重组杆状病毒中的表达

将猪细小病毒分离株LJL12 VP2基因和猪瘟病毒多肽基因E290克隆至真核表达载体pMel Ba-cA,将该重组质粒与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞,并对表达产物进行分析,构建了表达猪瘟病毒T细胞表位和猪细小病毒VP2融合蛋白的重组杆状病毒。结果显示,获得了含VP2基因和E290基因的重组质粒pM-VP2-E290,昆虫细胞sf9的表达产物经SDS-PAGE、Western-blot检测后确定所表达的蛋白质分子质量大小约为67 ku,且具有天然蛋白的抗原特性。免疫电镜观察可见表达产物形成的病毒样颗粒。证实,成功构建了同时含有PPV VP2基因和CSFV特异性T细胞表位基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达。     

猪瘟病毒E2重组蛋白纯化和复性条件的研究

对猪瘟病毒(CSFV)C株、LT株E2基因主要抗原区在pGEX系列表达载体中原核表达的融合蛋白进行了变性、复性和纯化回收试验。用建立的变性、复性和纯化方法，获得了可溶性的纯化蛋白E2，其纯度达70％，回收率为10％。对复性纯化的E2蛋白进行了免疫活性检测，结果表明，其比未纯化蛋白的免疫活性高20倍左右。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化E.coli BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。     

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。     

猪乙型脑炎病毒囊膜E蛋白间接ELISA诊断方法的建立与初步应用

本研究利用纯化的原核表达乙型脑炎囊膜E蛋白作为包被抗原,建立了乙型脑炎间接ELISA诊断方法。对检测的各种条件进行了优化,优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2μg/mL,抗原最佳包被条件为37℃包被2 h,血清的最适稀释度为1∶160,酶标抗体最适稀释度为1∶5000,最佳封闭条件为1%BSA,阴阳性临界值判定标准为D492 nm=0.254。该方法不与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒阳性血清反应,其D492 nm0.254,说明该方法具有良好的特异性。采用该方法对150份疑似乙型脑炎血清样品进行检测,结果显示,与某猪乙型脑炎试剂盒相比符合率为90.77%,表明建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,因此,本研究成功建立了能特异性检测抗乙型脑炎血清抗体的ELISA检测方法。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及其原核表达

为研究猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点,试验参照猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计、合成了1对引物,应用RT-PCR方法扩增出长为786 bp的基因片段,命名为zE2,将zE2基因克隆到原核表达质粒pET 32a中,经酶切鉴定后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达,大肠杆菌菌体裂解产物再经SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:该基因片段得到较高表达,融合蛋白的分子质量约为48 ku,主要以包涵体形式存在,且具有一定的免疫学活性。     

非洲猪瘟病毒K205R蛋白基因原核表达的研究

本研究合成非洲猪瘟的K205R基因,将K205R基因克隆至pET-30c(+)质粒,构建重组原核表达质粒pET30C-K205R。该重组质粒的阅读框架正确,表达的融合蛋白的N端和C端均带6×组氨酸。pET30C-K205R-BL21菌株经培养和诱导表达后,可生产K205R可溶性蛋白,K205R可溶性蛋白可用Ni柱纯化。纯化表达K205R蛋白的ELISA试验证明,表达的K205R蛋白与猪阳性非洲猪瘟血清具有较好的特异性反应。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

采用RT-PCR方法扩增猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠埃希菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白得到成功表达。利用纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。ELISA抗原最适包被浓度为0.5μg/mL(0.05μg/孔),最佳封闭液为5g/L BSA,待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000,最适作用时间为45min,室温显色10min。用该方法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别<5%和<8%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用△E2-ELISA对350份血清样品进行检测,阳性率为77.71%,高于IDEXX试剂盒检测阳性率(67.14%),与IDEXX试剂盒阳性符合率91.06%,阴性符合率50%,总符合率77.43%。表明本试验建立的间接ELISA方法适于临床CSFV血清抗体的检测。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及反应原性分析

研究猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白的抗原性,为开发PCV2的检测方法奠定基础。以PCV2CAU0673毒株的DNA为模板,扩增获得702bp的目的片段,扩增产物克隆入pET30a(+)原核表达载体,构建pET30a-PCV2-ORF2重组质粒,转入大肠埃希菌BL21(DE3);在37℃以1mmol/L IPTG诱导表达6h;采用Ni-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白,并用不同浓度的尿素对纯化蛋白进行复性。SDSPAGE分析表明,该ORF2编码基因在大肠埃希菌中得到表达,蛋白大小约为34ku;Western blot检测结果表明,该重组Cap蛋白与PCV2阳性血清发生特异性反应,与NA-PRRSV和PPV1血清不发生交叉反应。成功构建了PCV2-ORF2原核表达载体,实现了在大肠埃希菌中的表达,纯化后的复性蛋白具有较好的反应原性,为猪圆环病毒2型检测方法建立或试剂盒的开发奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因密码子优化后在昆虫细胞中的表达

将猪瘟病毒E2基因密码子改造后,克隆入pFastBac1质粒载体,经转座、转染后构建重组杆状病毒.并对表达产物进行鉴定分析.结果:E2基因改造后与设计序列一致;成功获得了重组杆状病毒(BAC/SE2M),采用猪瘟E2单抗WH303进行Western-blot和ELISA鉴定,证明:表达的CSFV E2蛋白特异性好,纯化后的E2蛋白,可用于猪瘟抗体检测试剂盒的开发.     

猪瘟病毒蛋白E2、N^pro基因的克隆表达及纯化

克隆了猪瘟病毒（CSFV）石门株E2和Npro基因,并分别插入pGEX-6p-1表达载体中,构建了原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组质粒均得以成功表达。使用超声法破碎菌体获得蛋白,将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中E2和Npro的表达形式分别为包涵体表达和可溶性蛋白表达。将E2变性后重折叠,应用亲和层析法纯化蛋白,Western blot检测发现CSFV蛋白E2能够被CSFV阳性血清识别,具有良好的反应原性,而Npro不能与CSFV阳性血清反应。