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相似文献
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1.
本研究旨在以纯化的山羊痘病毒P32蛋白为免疫原,构建杂交瘤细胞株,制备P32蛋白单克隆抗体。用纯化的P32蛋白免疫BALB/C小鼠后,按常规方法进行细胞融合,构建抗山羊痘病毒P32蛋白的杂交瘤细胞,制备P32蛋白单克隆抗体,获得4株能识别重组蛋白且特异性强无交叉反应的杂交瘤细胞株,腹水抗体效价均在105以上。山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备为进一步开展检测方法研究提供了材料。  相似文献   

2.
截去跨膜区对羊痘病毒P32基因免疫原性的影响   总被引:3,自引:0,他引:3  
羊痘是由羊痘病毒属绵羊痘病毒或山羊痘病毒引起的羊的一种急性、热性、接触性传染病。以无毛、少毛部位皮肤及黏膜发生丘疹和疱疹为特征,是所有动物痘病中最为严重的一种,被感染的羊群由于其生产力和皮毛质量大幅下降,造成巨大的经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为“法定通报疾病”,我国将其列为一类动物疾病。P32蛋白是羊痘病毒(CPV)颗粒的特异性强、免疫原性良好的结构蛋白,可用于羊痘的预防。CPV全长P32基因对细胞有毒性,国内外研究者多以截去跨膜区的P32基因为研究对象,研究其重组蛋白的用途,但对基因截去跨膜区所表达的部分蛋白是否与完整的P32蛋白具有相同的抗原性和特异性,目前尚不明确。笔者等通过构建P32和MP32的重组真核表达质粒,观察对小鼠的免疫效果,初步探讨截去跨膜区对P32基因免疫原性的影响。  相似文献   

3.
利用PCR技术扩增出羊痘病毒结构蛋白P32基因,并进行同源性比对及进化分析.结果表明,该病毒与其他绵羊痘病毒与山羊痘病毒同源性分别为99%与96%.  相似文献   

4.
山羊痘是由山羊痘病毒引起的一种严重的、高度接触传染的动物疾病,被国际兽疫局(OIE)列为A类动物传染病.临床上以体温升高、全身性或局部性皮肤痘疹及内脏病变(特别是肺)乃至死亡为特征.山羊痘病毒(GTPV)属痘病毒科脊索动物亚科羊痘病毒属的成员,该属其他成员还有绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(LSDV).P32抗原是一种结构蛋白抗原,包含有一个主要的抗原决定簇,存在于所有的羊痘病毒属的3个成员中.针对山羊痘病毒与副痘病毒属存在免疫交叉反应,缺乏有效的鉴别诊断试剂盒,本研究克隆表达出羊痘病毒属特异的P32蛋白,为进一步研制抗体及抗原检测试剂盒奠定前期工作基础.  相似文献   

5.
《中国兽医学报》2014,(12):1906-1911
P32蛋白是羊痘病毒株中特异性很强的免疫原性结构蛋白,本研究利用原核表达系统对山羊痘病毒P32基因进行表达,并应用该蛋白建立了检测山羊痘病毒血清抗体检测方法。将P32基因克隆至pGEX-6P-1表达载体,经抗性筛选,测序鉴定获得重组阳性克隆,成功构建了羊痘病毒重组pGEX-P32表达载体。经IPTG诱导表达,可稳定、高效地表达P32融合蛋白。融合蛋白纯化后SDS-PAGE结果表明,以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导,8h后表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,相对分子质量约56 000,表达产量约占菌体总蛋白的28%。Western-blotting检测表明,表达的融合蛋白能与羊痘阳性血清发生特异性反应,说明表达获得的产物具有良好的反应原性。用表达的融合蛋白建立了检测羊痘血清抗体的ELISA方法,经方阵滴定,确定抗原最佳包被质量浓度为每孔0.4mg/L,最佳血清稀释度为1∶20。符合率试验表明ELISA方法和琼脂扩散试验的阳性符合率为83.44%,并且所建立的方法具有很好的特异性、重复性和敏感性,这为应用该融合蛋白制备山羊痘病毒免疫血清学诊断试剂和疫苗研究奠定了基础。  相似文献   

6.
本研究旨在表达山羊痘病毒p32蛋白、制备p32蛋白单克隆抗体。通过PCR克隆p32基因,连接到pMD18-T并测序;酶切、连接后将p32基因克隆到pET28a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,在IPTG诱导下成功表达p32蛋白;利用亲和层析法纯化p32蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后制备p32蛋白单克隆抗体,获得22株识别重组蛋白的单抗,通过间接免疫荧光鉴定,其中3株能识别病毒的p32蛋白。山羊痘病毒p32蛋白的表达和单克隆抗体的制备为山羊痘病毒抗原、抗体检测提供了生物材料。  相似文献   

7.
为了研究新疆南疆分离的山羊痘病毒P32基因的特征,试验通过PCR扩增得到P32基因及其膜外区P32_(1~282)基因和膜外亲水区P32_(20~270)基因,分别构建了表达载体(pET42b-P32、pET42b-P32_(1~282)和pET28a-P32_(20~270))并进行了原核表达,对其核苷酸序列的同源性、遗传进化关系及推测的氨基酸序列、蛋白质二级结构进行了预测分析。结果表明:山羊痘病毒南疆株P32基因发生了较大突变,相对对照在第100~105位增加了6个核苷酸,编码K、N两个氨基酸,全长达到975 bp,编码324个氨基酸,与Gansu 2009株相似。跨膜分析显示P32蛋白膜外区为1~282位氨基酸,跨膜区为283~305位氨基酸,膜内区为306~324位氨基酸。二级结构分析发现其分子两端呈明显的疏水结构,抗原性较弱,而中间区域有较强的亲水性和较强的抗原性。蛋白质表达发现其全长在大肠杆菌中几乎没有表达,其膜外区可以表达,但表达量较低,难以纯化。说明山羊痘病毒P32蛋白是一个典型的膜蛋白,全长较难表达纯化,南疆株P32蛋白也具有这样的特性。  相似文献   

8.
山羊痘病毒P32基因重组表达载体的构建及原核表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
以含山羊痘病毒贵州LD株P32基因的质粒pMD18-T-P32/LD为模板,应用PCR方法扩增P32基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET-28a-P32/LD,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,有分子量约为35.5 ku的融合蛋白获得表达,与预期结果相符;Western-Blotting证实该表达蛋白具有免疫学活性。P32蛋白的成功表达为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。  相似文献   

9.
为表达山羊痘病毒P32蛋白并研究其免疫原性,构建了含有P32基因的重组表达质粒p ET-P32,诱导表达和纯化了P32蛋白;分别运用SDS-PAGE和Western blot,对该蛋白进行了分析和生物活性鉴定;用分析鉴定后的P32蛋白免疫BALB/c小鼠,然后采集小鼠血清,用间接ELISA进行抗体检测;用小鼠脾淋巴细胞增殖试验,检测该蛋白对机体的细胞免疫活性。结果显示:表达纯化的含有GST标签的P32重组蛋白,大小约39k Da;Western blot显示P32重组蛋白具有较好的特异性;间接ELISA抗体检测和小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明P32重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验结果为深入研究P32蛋白的生物学功能以及对山羊痘的诊断与防治奠定了基础。  相似文献   

10.
羊痘病毒P32蛋白的表达   总被引:5,自引:0,他引:5  
将已获得的Bac—Bacl—P32、Bac—BacHT—P32重组杆状病毒表达载体转染sf9昆虫细胞,得到含羊痘病毒P32基因的重组杆状病毒rBacHT—P32。将P32基因插入到大肠杆菌表达载体pET30a中,转化BL21感受态细胞,IPTG诱导表达。经SDS-PAGE、Western-blot鉴定,在杆状病毒、大肠杆菌中都得到了35kDa重组P32蛋白。  相似文献   

11.
羊痘病毒P32基因的克隆与原核表达   总被引:10,自引:1,他引:10  
根据发表的羊痘病毒P32基因,设计一对特异性引物,PCR扩增P32全长基因,将其克隆入pMD-18-T载体,获得重组质粒pMD-P32.再将P32基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组表达质粒pGEX-P32,转化大肠埃希菌BL21后用IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析.结果表明,P32全长基因在大肠埃希菌中以融合形式成功表达,分子质量为58 ku左右,与预期大小相符.  相似文献   

12.
通过Ni柱亲和层析和G-100层析技术对真核表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析GPVP32蛋白纯化效果;应用琼脂扩散试验检测纯化蛋白的抗原反应性,并以纯化蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法。结果显示,从真核表达产物中获得了纯化的GPVP32蛋白,琼脂扩散试验显示纯化的GPVP32蛋白具有良好的抗原反应性;基于纯化蛋白建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。结果表明,本试验建立的间接ELISA方法可用于山羊痘流行病学的调查和血清抗体水平的监测,为山羊痘的防控提供了有效技术。  相似文献   

13.
为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原,根据其基因序列设计合成了1对特异性引物,对CaPVP32基因进行了PCR扩增,产物大小约为969bp;产物回收纯化后,将其克隆至pBAD/Thio—TOPO载体中,转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞,与已报道的多株CaPVP32基因序列的同源性高达99%;相应地,氨基酸序列同源性为98%。经测序筛选出阳性克隆,该重组菌株经L—arabinose诱导,可稳定、高效地表达CaPVP32抗原。表达蛋白为融合蛋白,分子质量约51.53ku.  相似文献   

14.
从吕氏泰勒虫宁县株中提取RNA,用RT-PCR方法扩增主要表面蛋白P32基因的cDNA片段,克隆后测定其核苷酸序列,并推导了相应的氨基酸序列。结果表明,扩增的P32基因长度为875个核苷酸,共编码284个氨基酸。核苷酸序列与已发表的牛的4种泰勒虫的主要表面蛋白基因相比较,其与瑟氏泰勒虫俄罗斯株、日本株、中国辽阳株的核苷酸和氨基酸序列相似性均在98.9%以上。其推导的氨基酸序列中有3个糖基化位点。  相似文献   

15.
The effect of different dietary protein levels and DL‐methionine (Met) supplementation on hair growth and the resulting pelt quality in mink was studied. Four groups of male mink were fed with four isocaloric diets containing 32% (P32), 24% (P24), 16% (P16) or P24+Met (0.8%) crude protein of dry matter (DM) from September to December. Skin biopsies were taken at the pelting. Histological techniques and computer‐assisted light microscopy were used to determine the ratio of activity (ROA) of under hairs and guard hairs respectively. The results showed that when the dietary protein level reduced from 32% to 16%, body length, number and diameter of under hairs and guard hairs of minks declined, and pelt length and pelt weight of minks decreased significantly (p < 0.05). These parameters were similar between P32 and P24 with Met supplementation (p > 0.05). The hair follicle density of the winter coat was not influenced by the dietary protein levels and Met supplementation (p > 0.05). Low‐protein diets content led to a reduction of hair follicle developing to next phase. It was documented that 24% crude protein of DM with Met supplementation during growing‐furring period was sufficient for minks to express their genetic capacity to develop hair follicles and achieve the prime fur characteristics. Overall this study demonstrated that hair growth and hair properties in pelts are very dependent on the dietary protein and Met supply in the growing‐furring period of minks.  相似文献   

16.
根据GenBank公布的肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1蛋白羧基端序列(AF290001.1),设计合成2对特异性引物,采取套式PCR方法,以肺炎支原体培养物中提取的DNA为模板,扩增肺炎支原体P1蛋白羧基端基因序列,将其克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a/P1(3 802~4 695),转化大肠埃希菌BL21-gold,测序验证后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE表明重组蛋白表观分子质量与预期一致,可溶性表达产物经Western blot证实重组蛋白具有免疫反应性。  相似文献   

17.
本文旨在探讨饲粮蛋白质水平对水貂生长性能、营养物质消化吸收、毛皮品质和血清生化指标的影响.随机选取日龄体重相近的70只健康公水貂平均分至5组,饲喂5个蛋白质水平的饲粮(32%、28%、24%、20%和16%),每千克干物质中含蛋白质分别为326.4、284.7、249.3、203.9和172.8 g.试验组编号分别为P...  相似文献   

18.
Manipulation of porcine carcass composition by ractopamine   总被引:1,自引:0,他引:1  
The effect of dietary ractopamine and protein level on growth performance, individual muscle weight and carcass composition of finishing pigs were evaluated in two experiments. Twelve barrows and 12 gilts (Exp. 1) and 32 barrows (Exp. 2) with an average initial weight of 64 kg were penned individually and offered ractopamine at 0 or 20 ppm in diets containing 13 or 17% CP in 2 x 2 factorial experiments for 28 d. In both experiments, dietary ractopamine improved daily gain (P less than .1) and gain-to-feed ratio (P less than .05) at 17% dietary protein level but depressed these response criteria at 13% protein level. Leaf fat was reduced (P less than .05) and longissimus muscle depth was increased (P less than .1) by feeding ractopamine regardless of dietary CP concentration. Longissimus, psoas major, semitendinosus, biceps and quadriceps femoris (P less than .05) and tensor facia latae (P less than .1) muscles were 8 to 22% heavier with ractopamine feeding at 17% dietary CP level. Results from both trials suggest that ractopamine improves growth rate and carcass leanness at the higher dietary protein level but improves only carcass leanness at the lower protein level.  相似文献   

19.
We determined that the protein profiles of 14 isolates from animals with hemorrhagic septicemia were relatively homogeneous and could be placed in 2 distinct groups on the basis of their country of origin. Such differences correlated with the serotypic properties of the individual isolates; hemorrhagic septicemia isolates of Asian and North American origin (Carter B) had a major protein band with an apparent molecular mass of 32 kDa, whereas those of African origins (Carter E) had a major protein band with an apparent molecular mass of 37 kDa. The possession of a major 32-kDa protein band appeared to be unique to Carter B isolates, suggesting that electrophoresis may be a useful nonserologic technique for the identification of organisms of this serotype. Other major bands with apparent molecular masses of 27, 45, and 47 kDa were shared by all strains, regardless of their serotype. The lipopolysaccharides were of low molecular mass and relatively uniform from 1 isolate to the next.  相似文献   

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