Ta6-SFT基因对油菜的转化及抗旱性分析

为了研究Ta6-SFT对油菜抗旱的影响,进行了Ta6-SFT对油菜纯系材料的遗传转化,获得经PCR、Southern杂交和Northern 斑点杂交验证的转基因植株。对7株T₁代转基因油菜进行了为期36 d的干旱胁迫,分析干旱胁迫36 d和复水后2 d各植株及野生型对照中的Ta6-SFT的转录水平表达和果聚糖含量,同时进行同时期丙二醛含量和相对电导率测定。结果表明,Ta6-SFT的转录水平表达与转基因植株体内的果聚糖含量、转基因植株的抗旱性呈正相关,表明Ta6-SFT在干旱胁迫下的表达增强了转基因植株的抗旱性。     

基因苜蓿T1代遗传稳定性和抗盐性研究

采用分子生物学检测和不同浓度的ＮａＣｌ对转BADH基因苜蓿Ｔ１代２个株系进行遗传稳定性和抗盐性研究。结果表明,２个株系的Ｔ１代ＰＣＲ 阳性植株和阴性植株分离比例都符合孟德尔遗传规律;在０．８％ＮａＣｌ胁迫下,转基因植株Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交表达量明显增加,ＢＡＤＨ 酶活性和甜菜碱含量分别比对照植株增加２～４和４～５倍;不同浓度ＮａＣｌ胁迫下转基因株系脯氨酸和可溶性糖含量、抗氧化酶活性都显著高于对照植株,而电导率和丙二醛含量显著低于对照植株。表明转入的犅犃犇犎基因可以稳定遗传,转基因苜蓿植株耐盐性明显高于对照。     

多年生黑麦草P5CS基因的定点突变及其在拟南芥中的转化

 在前期克隆获得Lp5CS基因的全长ｃＤＮＡ 序列基础上,采用ＰＣＲ 扩增技术对多年生黑麦草脯氨酸合成酶基因p5CS的定点突变体系进行了探讨,并运用农杆菌转化技术对突变后的基因进行了功能验证。根据突变位点序列设计一对引物,使用Ｐｆｕ高保真ＤＮＡ 聚合酶和超级感受态细胞ＤＭＴ,通过ＰＣＲ 扩增,获得含有所要突变位点的犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ,定向克隆入真核表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００中,转化拟南芥验证基因功能。结果表明,预期位点上发生了突变,Lp5CS编码的第１２８位密码子已由苯丙氨酸残基（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ,简称Ｐｈｅ或Ｆ）变为丙氨酸残基（Ａｌａｎｉｎｅ,Ａｌａ）,证明用ＰＣＲ 技术已成功地使Lp5CS基因发生定点突变。转基因拟南芥Ｔ１ 代植株进行ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ检测,获得４个转基因阳性株系。拟南芥Ｔ２代植株经１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ处理７ｄ后,转基因株系脯氨酸含量分别为４２６２和５６２３μｇ／ｇＦＷ,显著高于野生型株系的２５８１μｇ／ｇＦＷ。说明转基因株系能积累更多地脯氨酸。     

转DREB1A/Bar双价基因马铃薯的耐旱性及除草剂抗性分析

在前期获得DREB1A/Bar双价转基因马铃薯的基础上,对转基因植株进行了耐旱性和除草剂抗性分析。耐旱性分析显示,在正常浇水条件下,对照和各转基因马铃薯株系生长状态良好且大致相同,各株系的丙二醛含量、相对电导率和SOD酶活性无显著差异(P0.05)。经过控水10d后,非转基因对照植株叶片明显萎蔫卷曲,而转基因植株仍然保持良好的生长状态;转基因株系的丙二醛含量和相对电导率显著低于非转基因株系(P0.05),而SOD酶活性显著高于非转基因对照(P0.05)。控水18d时,大部分对照植株死亡,死亡率为74.33%;转基因植株只有极少数植株死亡,DR2和DR5的死亡率分别为20.43%和5.65%。用0.3%的市售草铵膦喷施各株系,10d后,对照植株全部枯死,转基因株系的个别叶片干枯,绝大多数叶片及所有茎秆生长状态良好。以上分析表明,DREB1A和Bar基因的导入,明显增强了转基因马铃薯对干旱和除草剂的抗性。     

过表达FaSAMDC基因提高黑麦草属植物的抗旱性和耐热性

主要探讨了在黑麦草属植物中导入高羊茅S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(FaSAMDC)对转基因植株抗旱耐热性的提高效果,为培育黑麦草抗旱耐热新品种提供种质新材料。选择黑麦草成熟种子为外植体,采用贵州省草业研究所分子生物学实验室构建的过表达载体以及黑麦草胚性愈伤组织高频植株再生和农杆菌介导的遗传转化体系,将克隆自高羊茅的FaSAMDC基因转入贵州地区主栽品种多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季的基因组内,经抗性筛选、PCR检测和Southern杂交分析验证,获得45株特高与44株四季的转基因植株,转化频率分别为2.93%和2.28%。抗旱耐热试验表明,在30 ℃高温和中度干旱胁迫条件下,特高转基因株系的根冠比比对照组培苗高出7.08%,叶片相对含水量(RWC)比对照高出13.12%,RWC降低幅度比对照少5.49个百分点;四季转基因株系的根冠比比对照组培苗高出6.54%,RWC比对照高出12.54%,RWC降低幅度比对照少6.50个百分点,差异均达到显著水平(P<0.05),证明转入FaSAMDC基因的黑麦草阳性株系的抗旱耐热能力得到了明显提高。形态与生长特征观测结果显示,与非转基因组培苗相比,转基因株系的叶长、株高、主茎节数减小,叶宽、单株分蘖数增加,叶色变深,植株形状趋向于叶片丛生的紧凑型,推测导入的FaSAMDC基因参与了基因表达、细胞分裂等生理功能的调节。     

日本结缕草ZjZFN1基因对拟南芥的转化及其耐旱性分析

锌指蛋白在植物干旱胁迫中起重要作用,尽管已经在各种植物中克隆并鉴定了编码这些蛋白质的基因,但是它们在日本结缕草中的功能和潜在的转录机制还不清楚。通过花序侵染法将ZjZFN1基因及其启动子转化拟南芥,并通过草铵膦/潮霉素抗性筛选和PCR鉴定,获得转基因株系。ZjZFN1的启动子能够驱动GUS基因的表达,在甘露醇处理下的GUS基因表达水平显著高于对照;在拟南芥中过表达ZjZFN1降低了种子发芽率,减弱了植物对干旱胁迫的适应性和植物在干旱胁迫下的生长状况;干旱处理后,转基因植株中的丙二醛含量高于野生型植株,而脯氨酸含量显著低于野生型植株;实时荧光定量分析表明对过表达ZjZFN1的拟南芥进行干旱处理后,POD、SOD、P5CS、LEA的表达水平降低,而APX的表达水平升高。ZjZFN1基因的过表达可减弱植物的耐旱性,为进一步开发利用该基因奠定基础。     

日本结缕草ZjZFN1基因对拟南芥的转化及其耐旱性分析

锌指蛋白在植物干旱胁迫中起重要作用,尽管已经在各种植物中克隆并鉴定了编码这些蛋白质的基因,但是它们在日本结缕草中的功能和潜在的转录机制还不清楚。通过花序侵染法将ZjZFN1基因及其启动子转化拟南芥,并通过草铵膦/潮霉素抗性筛选和PCR鉴定,获得转基因株系。ZjZFN1的启动子能够驱动GUS基因的表达,在甘露醇处理下的GUS基因表达水平显著高于对照;在拟南芥中过表达ZjZFN1降低了种子发芽率,减弱了植物对干旱胁迫的适应性和植物在干旱胁迫下的生长状况;干旱处理后,转基因植株中的丙二醛含量高于野生型植株,而脯氨酸含量显著低于野生型植株;实时荧光定量分析表明对过表达ZjZFN1的拟南芥进行干旱处理后,POD、SOD、P5CS、LEA的表达水平降低,而APX的表达水平升高。ZjZFN1基因的过表达可减弱植物的耐旱性,为进一步开发利用该基因奠定基础。     

转BADH基因苜蓿T1代遗传稳定性和抗盐性研究

采用分子生物学检测和不同浓度的NaCl对转BADH基因苜蓿T1代2个株系进行遗传稳定性和抗盐性研究。结果表明,2个株系的T1代PCR阳性植株和阴性植株分离比例都符合孟德尔遗传规律;在0.8%NaCl胁迫下,转基因植株Northern杂交表达量明显增加,BADH酶活性和甜菜碱含量分别比对照植株增加2～4和4～5倍;不同浓度NaCl胁迫下转基因株系脯氨酸和可溶性糖含量、抗氧化酶活性都显著高于对照植株,而电导率和丙二醛含量显著低于对照植株。表明转入的BADH基因可以稳定遗传,转基因苜蓿植株耐盐性明显高于对照。     

马铃薯ARF基因RNAi载体的遗传转化及对其试管薯生理特性的影响

用含有ADP核糖基化因子(ARF)基因的干扰载体的农杆菌转化马铃薯栽培品种“甘农薯2号”,获得转化植株48株,经卡那霉素抗性筛选和PCR检测证明ARF基因已成功整合到马铃薯基因组中。用实时荧光定量PCR检测表明,转化植株中ARF基因的表达较对照均有不同程度的下降,在转基因株系Z-11和Z-12中,ARF基因表达的干扰程度分别高达92.53%和93.22%。对转基因植株诱导的试管薯的淀粉、可溶性糖、蛋白质、蔗糖和葡萄糖含量测定结果表明,与未转基因的对照相比,转基因植株的淀粉含量提高了4.29%~34.27%,蛋白质含量提高了1.47%~7.35%,可溶性糖含量提高了1.44%~17.39%;蔗糖含量提高了11.53%~53.84%,而葡萄糖含量降低了6.06%~21.21%。     

GsCRCK 基因转化农菁１号苜蓿及其耐盐性分析

 GsCRCK 基因是参与胁迫早期应答的钙／钙调素调控的受体类蛋白激酶基因,研究发现GsCRCK  正向调控拟 南芥对ＮａＣｌ和ＡＢＡ 胁迫的耐性,将耐盐蛋白激酶基因犌狊犆犚犆犓转化苜蓿,对于增强苜蓿的耐盐性具有重要的现 实意义。本研究采用农杆菌介导法将其转入农菁１号苜蓿,获得大量抗性植株。经ＰＣＲ 和ＲＴ－ＰＣＲ 检测证明 GsCRCK  基因已整合到农菁１号苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。对获得的２ 个转基因株系进行耐盐 性分析,在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ条件下进行胁迫处理,测定处理０,３,６,９,１２,１５ｄ后的质膜透性、丙二醛（ＭＤＡ）和叶 绿素（Ｃｈｌ）含量,以及胁迫１５ｄ时的ＳＯＤ 活性;并统计４００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ处理１５ｄ时各株系的死亡率。结果显 示,３００ｍｍｏｌ／Ｌ 高盐胁迫１５ｄ后转基因苜蓿仍能正常生长,而野生型苜蓿则遭受盐害严重;转基因苜蓿的相对电 导率极显著低于野生型,ＭＤＡ 含量也显著低于野生型,而Ｃｈｌ含量和ＳＯＤ 活性都显著高于野生型;在４００ ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理下,２个转基因株系的死亡率分别为１３．３３％和１０．００％,明显低于野生型植株（６３．３３％）。表明 GsCRCK 基因的导入提高了转基因苜蓿的耐盐性。     

盐胁迫对菊芋糖组分含量和分配的影响

本研究以菊芋品种南芋一号(NY-1)为试材,在温室进行全生育期土培盆栽试验,研究了盐胁迫对糖分积累与分配的影响。通过HPLC-ELSD(高效液相色谱-蒸发光检测仪)检测发现,盐胁迫对NY-1块茎、茎和叶中各种糖的含量有不同影响。对于单糖和二糖来说,与对照相比,盐处理140 DAP (days after planting)时茎中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量分别降低了72.67%,78.31%和39.40%;块茎中果糖、葡萄糖和蔗糖含量分别降低了67.08%,60.91%和30.07%;叶中果糖、葡萄糖和蔗糖含量与对照相比无显著性变化。盐处理220 DAP时,块茎中这些糖的含量无明显降低,茎中的葡萄糖含量与对照相比降低了139.22%;而叶中这些糖已检测不出。低聚合度果聚糖主要集中分布在菊芋块茎和茎中。与对照相比,盐处理140 DAP 时茎与块茎中蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的含量没有显著差异,叶中这些糖分布很少,与对照相比变化很小。盐处理220 DAP,块茎中这些糖含量与对照相比无显著性差异,而茎与对照相比,蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖含量几乎为0,表明随块茎的形成,茎和叶中的果聚糖逐步向块茎转运,盐胁迫产生渗透机制,增加了果聚糖在块茎中的积累。以上结果表明盐胁迫影响了糖分的积累转运,微调了植物体内的果聚糖组成,但极其严重地减少了果聚糖在地上部分(尤其是茎)的积累。     

内蒙古典型草原羊草和大针茅地下器官中碳水化合物含量的季节性变化

多年生牧草在地下器官中贮藏的碳水化合物是春季萌发生长和刈牧后再生的物质基础。羊草和大针茅是内蒙古典型草原地带性分布的优势种。为了研究草原植物碳水化合物贮藏特性,采用高效液相色谱技术对羊草和大针茅的贮藏性碳水化合物的种类组成及季节变化进行了测定。结果表明,羊草和大针茅地下器官的贮藏性碳水化合物的组分主要包括果聚糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、甘露醇和淀粉。其中甘露醇、淀粉和果聚糖在2种牧草地下器官中的含量均居前3位。羊草地下器官碳水化合物的含量显著高于大针茅,其果聚糖和淀粉含量分别是大针茅的3.2和3.6倍。5月20日-10月15日,羊草和大针茅地下器官中的碳水化合物总量、可溶性碳水化合物含量、淀粉含量、甘露醇含量和果聚糖含量均表现出“降低-升高-再降低-再升高”的特征。不同碳水化合物组分冬前积累和春季降解的起止时间也存在较大差异。     

转DREB1A基因多年生黑麦草T1代萌发期耐盐性研究

摘要：对转DREB1A基因多年生黑麦草（Lolium perenne）的T1代种子和多年生黑麦草非转化植株的子一代种子进行了不同质量分数的NaCl （0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%）处理，研究了转基因植株对盐胁迫的生理响应。结果表明，随着盐质量分数递增，相对发芽势、相对发芽率、胚芽长、叶绿素含量、叶片含水量及相对含水量呈现下降的趋势，转基因组与对照组之间的差异达到显著水平,高盐胁迫下，前者各指标均高于后者；胚根长变化无明显规律；细胞膜透性的变化与盐质量分数的增加成正相关，转基因组的细胞膜透性低于对照组，二者存在显著差异。说明转基因植株的耐盐性明显强于对照组，转DREB1A基因多年生黑麦草T1代种子可以作为盐害土壤改良和利用的植物资源。     

NaCl、PEG双重胁迫下转DREB1A基因多年生黑麦草T1代萌发期抗性研究

对转DREB1A基因多年生黑麦草(Lolium perenne)T1代种子和多年生黑麦草非转化植株F1代种子分别用1.5%NaCl溶液、15%PEG溶液、1.5%NaCl+15%PEG进行处理。测定了相对发芽势、相对发芽率、胚芽长、胚根长、细胞膜透性、相对含水量、叶绿素含量、萎蔫幼苗数、存活率等指标,研究了供试材料对单独胁迫和双重胁迫的抗性,并进行对比。相对发芽势、相对发芽率、胚芽长、细胞膜透性、叶绿素含量等指标的测定结果显示,DREB1A对三种胁迫的抗性强度依次为NaCl>PEG>NaCl+PEG。叶片相对含水量、存活率等指标的测定结果表明DREB1A对三种胁迫的抗性强度依次为PEG>NaCl>NaCl+PEG。萎蔫幼苗株数的测定结果显示,DREB1A对三种胁迫的抗性强度依次为NaCl>NaCl+PEG>PEG。胚根长在三种胁迫下的响应差异不显著。DREB1A对NaCl、PEG单独胁迫和NaCl+PEG双重胁迫均具有一定程度抗性,比非转化植株的抗性明显增强。转DREB1A基因多年生黑麦草T1代种子可以作为干旱、盐碱地区改良和利用的植物资源。     

过表达长穗偃麦草EeHKT1；4基因增强拟南芥抗旱耐盐性分析

植物高亲和性K⁺转运蛋白基因（HKT）编码K⁺、Na⁺转运或K⁺-Na⁺共转运质膜通道蛋白,在植物抗逆过程中发挥重要作用。为了研究长穗偃麦草EeHKT1;4（GenBank： KF956112.1）的功能作用,构建了EeHKT1;4过表达植物表达载体转化拟南芥,进行拟南芥转基因植株的抗旱耐盐性评价分析。结果显示,正常生长条件下野生型（WT）与转基因株系的主根长度无差异,NaCl与甘露醇处理下WT和转基因株系根的生长受到抑制,转基因株系根长度均大于同等胁迫条件下（WT）的根长;正常生长条件下WT与转基因株系表型无显著差异,但在NaCl与甘露醇处理下WT表现出叶片萎缩和植株枯黄,转基因株系仅部分植株表现出叶片萎缩,同一胁迫条件下转基因株系的植株存活率皆高于WT。硝基氮蓝四唑（NBT）与二氨基联苯胺（DAB）染色结果显示,正常生长条件下WT与转基因株系叶片染色相对较浅,随着NaCl与甘露醇浓度提高,所有叶片染色程度逐渐加深且同等胁迫下WT染色程度高于转基因株系。以正常生长条件下基因的表达量为对照,随着NaCl浓度的增加,AtSOS1基因在WT和转基因植株中逐渐上调且在转基因中的表达量高于WT;AtNHX1基因在NaCl处理下上调表达且转基因植株中表达量低于WT,除转基因株系L5外并未检测到WT和转基因株系自身因NaCl浓度的提高AtNHX1基因表达量发生改变;在甘露醇处理下,AtRD29B和AtP5CS1基因均上调表达且转基因植株中表达量高于WT。综上所述,EeHKT1;4过表达降低了逆境胁迫下拟南芥中超氧阴离子和H₂O₂的积累,诱导抗逆基因上调表达,增强拟南芥抗旱耐盐性。     

盐胁迫应答基因GmWRKY6的克隆及转基因百脉根的抗盐分析

根据大豆盐胁迫RNA-Seq数据,筛选并克隆得到1个大豆WRKY类转录因子GmWRKY6基因。序列分析表明,该基因含有1 个1674 bp的开放阅读框,编码557 个AA,编码蛋白属于IIb 类WRKY 家族成员,含有1个WRKY 保守结构域和1个C₂H₂锌指结构基序。基因表达模式分析表明,GmWRKY6基因在大豆根中表达量较高,并且该基因受盐胁迫诱导表达。构建GmWRKY6基因的植物超表达载体,获得7株T₀代阳性转GmWRKY6基因百脉根。进一步对T₁代转基因株系进行抗盐分析发现,在200 mmol·L^-1 NaCl 处理14 d后转基因株系生长状态良好,而野生型对照生长矮小,叶片干枯。此外,对相关生理指标的测定发现,转基因株系叶片中脯氨酸和叶绿素含量显著高于野生型对照,而丙二醛含量和相对质膜透性显著低于野生型对照。此外,盐胁迫下转基因百脉根叶片中钠离子含量显著低于对照,而钾离子含量显著高于对照。以上结果表明大豆GmWRKY6基因的超表达能够显著增强百脉根的抗盐能力。     

甘露醇及AgNO_3对根癌农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化的影响

多年生黑麦草是优良的牧草和草坪草.农杆菌介导多年生黑麦草遗传转化非常困难.为了建立稳定的多年生黑麦草遗传转化体系,本研究以品种"多福"种子成熟胚为外植体诱导愈伤组织,携质粒pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105介导,进行遗传转化.在预培养及共培养基中添加0.1 mol/L甘露醇或5 mg/L硝酸银,并分析了二者对转化的影响.经巴龙霉素筛选、PCR及GUS组织染色检测表明,共获得了转基因植株38株.添加O.1mol/L甘露醇或5 mg/L AgNO3或O.1 mol/L甘露醇+5 mg/L AgNO3,转化效率分别为对照的1.96,1.59和2.95倍.结果表明,在根癌农杆菌介导的多年生黑麦草愈伤组织遗传转化中,在预培养和共培养基中添加甘露醇或AgNO3能提高转化率,且当二者共同添加时可显著提高.     

从光合作用和有机酸积累角度探索转GsPPCK1和GsPPCK3基因苜蓿耐碱性增强的生理机制

光合作用影响着植物的生长发育及产量,并在盐碱胁迫响应中起到积极作用。前期研究将光合途径中野生大豆来源的GsPPCK1和GsPPCK3基因转入苜蓿,所获得转基因苜蓿耐碱性提高。从光合作用和有机酸积累角度探索转GsPPCK1和GsPPCK3基因苜蓿耐碱性增强的生理机制。结果表明,碱胁迫9 d后,叶绿素的相对含量下降,转基因株系P1-5、P3-8与未处理相比变化并不显著,分别下降了11.27%、13.30%,而非转基因株系的叶绿素含量下降了39.11%。转基因株系P1-5、P3-8光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)、气孔导度(G_s)及胞间CO₂浓度(C_i)在胁迫处理后也有下降趋势,但下降的幅度仅为非转基因植株下降幅度的1/2。光合途径中NADP-苹果酸脱氢酶、NADP-苹果酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸正磷酸二激酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶等关键酶的酶活及有机酸(苹果酸、柠檬酸、草酰乙酸、磷酸烯醇式丙酮酸)含量在碱胁迫处理后均呈上升趋势,而转基因株系P1-5、P3-8 的光合酶活和4种有机酸含量与非转基因对照相比上升极显著(P<0.01)。PEPC(Medtr4g079860.1)、NADP-ME(Medtr8g014390.1)、NADP-MDH(Medtr1g043040.1)、PPDK(Medtr4g118350.1)及Rubisco(Medtr4g 021210.1)基因的表达呈先上升后下降趋势,转基因株系中基因的表达变化较非转基因对照更为显著(P<0.01)。由此表明,在正常情况下,GsPPCK1和GsPPCK3基因的超量表达并未影响植物的光合作用,但是在碱胁迫下,转基因苜蓿的光合作用受碱胁迫的抑制较小,这一过程可能与PEPC酶的激活有关。另外,光合中间产物有机酸含量的显著上升对维持细胞内pH值的稳定也起到重要作用。