二化螟Cry1Ac汰选品系对不同Bt蛋白的敏感性

为明确靶标害虫对Bt蛋白的抗性及对不同类型Bt蛋白的交互抗性,采用生物测定法进行了二化螟Chilo suppressalis(Walker)敏感品系和Cry1Ac汰选品系在Cry1Ac毒饲料上的时间-死亡率反应、对不同Bt杀虫蛋白的敏感性及不同Bt蛋白复配组合对二化螟毒力效果的研究。结果表明,二化螟Cry1Ac汰选品系已对36.67μg/mL(LC_(50))的Cry1Ac杀虫蛋白产生了一定的适应性,但对308.69μg/mL(LC90)的Cry1Ac蛋白反应仍较敏感。Cry1Ac敏感品系和汰选品系对Cry1Ab蛋白的LC_(50)分别为1.40μg/mL和3.86μg/mL,二者差异显著,但对Cry1Ca(1.63μg/mL和1.73μg/mL)或Cry2Aa(127.48μg/mL和144.50μg/mL)的LC_(50)差异不显著,即Cry1Ac汰选品系与Cry1Ab存在明显的交互抗性,但与Cry1Ca和Cry2Aa不存在交互抗性。在不同Bt蛋白复配组合中(1∶1复配),Cry1Ab+Cry1Ca、Cry1Ab+Cry2Aa和Cry1Ca+Cry2Aa增效作用最为显著。表明抗虫基因cry1Ca和cry2Aa可作为双价转基因抗虫水稻研发的候选基因。     

APN1的原核表达及其与Cry1Ac蛋白体外结合

本研究分析了Cry1Ac蛋白与棉铃虫BBMVs的结合情况;并将棉铃虫apn1基因的全长和片段在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达,利用Ligand blotting技术分析原核表达的APN1全长及4个片段与Cry1Ac蛋白的结合情况。结果表明:Cry1Ac蛋白可以与棉铃虫的BBMVs结合;在大肠杆菌中表达的棉铃虫受体蛋白APN1的全长、片段H1(33~257)、H2(258~547)和H3(548~798)可以与Cry1Ac蛋白结合,其中片段H3是首次发现可以与Cry1Ac蛋白结合。本研究的结果也为其他Bt蛋白受体的体外功能研究提供新的借鉴。     

棉铃虫V-ATPase亚基B是Cry1Ac的功能受体

目前对转苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）的研究发现,液泡型ATP酶（Vacuolar-type proton ATPase,V-ATPase）可能是Bt的一类新型受体。我们前期通过构建棉铃虫的中肠酵母文库筛选Cry1Ac的结合蛋白发现棉铃虫V-ATPase亚基B（V-ATPase B）可以与Cry1Ac结合。为明确V-ATPase B在Cry1Ac毒力和昆虫对Cry1Ac抗性机制中的作用,本研究首先采用实时荧光定量PCR技术分析了该基因在抗感Cry1Ac棉铃虫幼虫中及其受到Cry1Ac诱导时的基因表达情况;通过Ligand blot进一步地证实了其与Cry1Ac的结合特性;并通过在Sf9细胞中表达V-ATPase B的试验验证了其功能。结果表明V-ATPase B在抗性品系及受到Cry1Ac诱导时均下调表达,Ligand blot证实了V-ATPase B与Cry1Ac特异性结合;并且在昆虫细胞内过表达该基因,会增强Cry1Ac的细胞毒力。研究结果表明棉铃虫V-ATPase B是Cry1Ac的功能受体,并有可能通过降低基因表达来参与棉铃虫对Cry1Ac的抗性形成。     

V-ATPase H表达量下调增强棉铃虫对Cry1Ac的抗性

棉铃虫Helicoverpa armigera是世界性重要农业害虫。目前防治棉铃虫的主要手段是种植转苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)杀虫蛋白的转基因作物。本文旨在研究棉铃虫V-ATPase H在Cry1Ac蛋白毒力和抗性中的作用。利用实时荧光定量qRT-PCR技术分析V-ATPase H在Cry1Ac抗、感品系棉铃虫幼虫中肠及敏感品系棉铃虫幼虫受Cry1Ac诱导后的表达情况;在昆虫Sf9细胞中过表达V-ATPase H对其进行细胞定位,通过细胞毒力试验验证其对Cry1Ac毒力的影响。结果发现棉铃虫V-ATPase H基因在抗性品系中低表达,并且V-ATPase H在受到Cry1Ac诱导时也低表达;在Sf9细胞内表达V-ATPase H蛋白发现其在整个细胞中都有分布,过表达该蛋白后增强了细胞对Cry1Ac蛋白的敏感性。结果表明V-ATPase H参与Cry1Ac蛋白的毒力。     

我国棉铃虫对Bt蛋白Cry1Ac抗性现状及分子机制研究进展

棉铃虫Helicoverpa armigera是一种全球性的重要农业害虫,主要为害棉花、玉米和大豆等作物。长期种植单价Bt棉花（表达Cry1Ac蛋白）会使棉铃虫田间种群承受单一、持续的选择压力,必然会导致棉铃虫对Cry1Ac的抗性发生演化。该文概述我国棉铃虫田间种群对Cry1Ac的抗性现状、自然庇护所对棉铃虫Cry1Ac抗性演化的延缓作用以及棉铃虫对Cry1Ac抗性的遗传多样性,并对今后我国关于棉铃虫Bt抗性的治理对策进行了展望。     

四种Bt毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫毒力测定及中肠组织病理学变化

为更好地了解苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis毒素蛋白对二点委夜蛾Athetis lepigone的毒力以及作用机理,通过饲喂含有Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab和Vip3Aa四种不同Bt毒素蛋白饲料,测定Bt毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫的毒力,并观察取食4种毒素蛋白后幼虫中肠组织的病理学变化。结果显示,二点委夜蛾幼虫取食毒素蛋白后72 h,Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫的杀虫活性较高,校正死亡率为84.7%和76.4%;Vip3Aa和Cry2Ab毒素蛋白的毒力较弱。二点委夜蛾幼虫取食4种Bt毒素蛋白后,中肠柱状细胞微绒毛脱落,杂乱地分散在肠腔内,杯状细胞变形和腔内微绒毛脱落,线粒体和内质网等变形破裂,细胞核的核膜消失、核质凝聚和形状发生变化,经Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白处理后中肠细胞的病变症状和速度明显高于Cry2Ab和Vip3Aa毒素蛋白处理。表明Cry1Ab和Cry1Ac毒素蛋白对二点委夜蛾幼虫杀虫活性较高,显著高于Cry2Ab和Vip3Aa毒素蛋白,且对其中肠细胞的破坏作用也较强。     

Bt杀虫蛋白对棉铃虫的抗虫毒力和增效作用

用 Bt杀虫蛋白 (ICP) Cry1A汰选的棉铃虫 (H elicoverpa armigera)抗性种群和同源对照种群分别测定了 4种不同类型 Bt ICP的抗虫毒力。结果表明 :4种杀虫蛋白对对照种群的毒力顺序为 :Cry1Ac>Cry1Ac+ 1C>Cry2 A>Cry1C;对抗性种群的毒力顺序为 :Cry1Ac+ 1C>Cry1Ac>Cry2 A>Cry1C,其中Cry1Ac+ 1C表现出对抗性种群有显著的协同增效作用。采用从 Bt液体发酵上清液中提取的增效粉 ,与Cry1Ac以 1∶ 1和 1∶ 2的比例混合 ,对 Cry1Ac有显著的增效作用 ,用抗性种群测定的增效比值明显大于对照种群 ,处理 5d的增效比值大于 14d的     

入侵云南草地贪夜蛾种群对5种常用Bt蛋白的敏感性评价

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J. E. Smith)是原分布于美洲大陆热带和亚热带地区的一种重要玉米害虫。在当地,种植抗虫转基因玉米是防控草地贪夜蛾危害的主要手段。该虫于2019年1月入侵我国云南省,为明确入侵我国云南的草地贪夜蛾种群对常用Bt蛋白的敏感性水平,本文通过饲料表面涂抹法测定了瑞丽草地贪夜蛾幼虫对Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ab以及Vip3A等5种Bt蛋白的敏感性。结果表明:几种常用Bt蛋白对瑞丽草地贪夜蛾致死作用顺序为Vip3ACry1AbCry1FCry2AbCry1Ac,对草地贪夜蛾抑制生长发育的顺序为Cry1AbCry1FVip3ACry1AcCry2Ab。此外,与美国相对敏感种群比较,云南瑞丽草地贪夜蛾种群对Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ab和Vip3A的敏感性指标在0.28～3.76之间,表明该入侵种群对此5种Bt蛋白均未产生抗性。此研究可为将来建立以转Bt基因玉米作为防控草地贪夜蛾的技术体系提供依据。     

蛋白质转导结构域增加Cry1Ac对小菜蛾的毒力研究

蛋白质转导结构域是一类能自动穿透细胞膜,并能作为载体将其他生物大分子携带进入细胞膜内的一段富含精氨酸的多肽。本研究通过遗传重组的方法,构建蛋白质转导结构域TAT与Bt杀虫蛋白Cry1Ac的融合基因及其表达载体TAT-Cry1Ac,对表达蛋白的生测结果表明,TAT极为显著地增加Cry1Ac对小菜蛾的杀虫毒力,增效倍数达到5.54倍,预示着TAT在微生物杀虫蛋白领域可能有着良好的应用前景。     

钙粘蛋白氨基酸点突变介导红铃虫对Cry1Ac的抗性

为明确室内筛选的红铃虫Pectinophora gossypiella抗性品系AQ-R对Cry1Ac的抗性机制,采用室内生物测定法明确该品系对Cry1Ac和Cry2Ab的敏感性,通过遗传杂交和基因克隆分析抗性基因的显隐性及突变位点,并进行细胞学试验分析突变蛋白的亚细胞定位。结果显示：红铃虫AQ-R抗性品系对Cry1Ac的抗性倍数为181.67倍,对Cry2Ab没有交互抗性;该品系携带了一种新型的隐性钙粘蛋白抗性等位基因PgCad1,其编码蛋白的钙粘蛋白重复区、前蛋白区和近膜区共发生了17个氨基酸替换。表达野生型PgCad1-s基因的Hi5细胞对Cry1Ac敏感,且钙粘蛋白定位于细胞膜;而表达抗性PgCad1-r基因的Hi5细胞则对Cry1Ac不敏感,且钙粘蛋白错误定位到内质网。表明钙粘蛋白氨基酸点突变能导致其定位错误,从而促成红铃虫AQ-R品系对Cry1Ac产生抗性。     

Cross-resistance and inheritance of resistance to Bacillus thuringiensis toxin Cry1Ac in diamondback moth (Plutella xylostella L) from lowland Malaysia

A field population of Plutella xylostella from Malaysia (SERD4) was divided into five sub-populations and four were selected (G2-G5) with the Bacillus thuringiensis insecticidal crystal (Cry) toxins Cry1Ac, Cry1Ab, Cry1Ca and Cry1Da. Bioassay at G6 gave resistance ratios of 88, 5, 2 and 3 for Cry1Ac, Cry1Ab, Cry1Ca and Cry1Da respectively compared with the unselected sub-population (UNSEL-SERD4). The Cry1Ac-selected population showed little cross-resistance to Cry1Ab, Cry1Ca and Cry1Da, (3-, 2- and 3-fold compared with UNSEL-SERD4), whereas the Cry1Ab-SEL sub-population showed marked cross-resistance to Cry1Ac (40-fold), much greater than Cry1Ab itself. In contrast, the Cry1Ca- and Cry1Da-SEL sub-population showed little if any cross-resistance to Cry1Ac and Cry1Ab. The mode of inheritance of resistance to Cry1Ac was examined in Cry1Ac-selected SERD4 by standard reciprocal crosses and back-crosses using a laboratory insecticide-susceptible population (ROTH). Logit regression analysis of F1 reciprocal crosses indicated that resistance to Cry1Ac was inherited as an incompletely dominant trait. At the highest dose of Cry1Ac tested, resistance was recessive, while at the lowest dose it was almost completely dominant. The F2 progeny from a back-cross of F1 progeny with ROTH were tested with a concentration of Cry1Ac that would kill 100% of ROTH. The mortality ranged between 50 and 95% in seven families of back-cross progeny, which indicated that more than one allele on separate loci were responsible for resistance to Cry1Ac.     

Cry1Ac的绿色荧光蛋白GFP标记及其在棉铃虫幼虫中肠的定位分布

为了明确Cry1Ac蛋白在棉铃虫体内与中肠组织的相互作用,采用重叠PCR方法将Bt-cry1Ac基因和绿色荧光蛋白GFP基因融合,构建含Cry1Ac毒蛋白和绿色荧光蛋白GFP原核表达载体,并在大肠杆菌大量表达。利用荧光显微镜观察发现,表达Cry1Ac-GFP融合蛋白的大肠杆菌在蓝光激发下发出绿色荧光。将含有融合蛋白的菌液拌入人工饲料饲喂3龄棉铃虫幼虫96h,取棉铃虫幼虫中肠做冰冻切片并在荧光显微镜下观察。结果显示,取食含有Cry1Ac-GFP融合蛋白饲料的棉铃虫幼虫中肠能够发出强烈荧光。比较Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性棉铃虫幼虫中肠的发光部位,敏感棉铃虫幼虫的中肠围食膜已经消失,肠壁细胞发出强烈的荧光,而抗性棉铃虫的围食膜较健全并发出荧光。     

转基因抗虫耐除草剂(Cry1Ac+EPSPS)玉米对草甘膦耐受性研究

将具有我国自主知识产权的抗虫、耐除草剂基因转化到玉米中获得兼具抗虫和耐除草剂的复合性状转基因玉米,实现了玉米复杂性状的有效改良,研究了转耐除草剂CC-2基因和可表达Bt毒素的cry1Ac基因的双抗玉米对除草剂的耐受性及目标蛋白表达量。通过调查喷施除草剂后玉米植株存活率及株高和生长发育情况,研究了转抗虫耐除草剂基因玉米‘CC-2×BT799’、抗虫玉米‘BT799’、耐除草剂玉米‘CC-2’,以及常规玉米‘郑58’在田间对除草剂的耐受性,并用ELISA测定了供试品种中CP4EPSPS和Cry1Ac蛋白含量。对草甘膦的耐受性试验表明,转复合基因玉米‘CC-2×BT799’与单抗草甘膦品种‘CC-2’对草甘膦均具有良好的耐受性。心叶期喷施草甘膦推荐施用剂量中量和2倍剂量对其株高和后期生长发育无不良影响。ELISA检测显示,CP4EPSPS蛋白在雄穗中的表达量较叶片稍高。且双抗品种‘CC-2×BT799’较‘CC-2’中的CP4EPSPS蛋白含量稍高。在雄穗中,‘BT799’的Cry1Ac蛋白含量与‘CC-2×BT799’相当。在叶片中,‘BT799’的Cry1Ac蛋白含量约为‘CC-2×BT799’的2倍。抗虫耐除草剂玉米能够有效抵御草甘膦的喷施,Cry1Ac蛋白含量在不同品种不同组织中存在差异。     

Effects of Cry1Ac toxin of Bacillus thuringiensis and nuclear polyhedrosis virus of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) on larval mortality and pupation

In the laboratory, the percentage mortality and pupation of Helicoverpa armigera (Hübner) were investigated when larvae were exposed to Cry1Ac of Bacillus thuringiensis Berliner, nuclear polyhedrosis virus of H. armigera (HaNPV) or Cry1Ac and HaNPV together. The results revealed that interactions between Cry1Ac and HaNPV varied with bioassay method and concentration of the suspension. When larvae were infected using a suspension containing both HaNPV and Cry1Ac, most combinations of Cry1Ac (62.5, 125 and 250 microg mL(-1)) and HaNPV (1.2 x 10(6), 6.0 x 10(6) and 3.0 x 10(7) PIB mL(-1)) showed an antagonistic effect. In the bioassay procedure where larvae were force fed diet containing Cry1Ac 48 h after being infected by HaNPV, interaction between Cry1Ac (0.5, 1, 2, 4 and 8 microg mL(-1)) and HaNPV (6.0 x 10(6) and 3.0 x 10(7) PIB mL(-1)) showed an additive effect, while combinations of Cry1Ac (0.5, 1, 2 and 4 microg mL(-1)) and HaNPV (1.2 x 10(6) PIB mL(-1)) showed an antagonistic effect. In the bioassay procedure where larvae being infected by HaNPV were fed on Cry1Ac diet from neonate to death or pupation, the results suggested that Cry1Ac and HaNPV showed an additive interaction. The percentage mortality was lower in the treatment of larvae infected by transgenic Bt cotton leaf discs containing HaNPV suspension than in the treatment of larvae by conventional cotton leaf discs containing HaNPV, while the pupation rate was higher. The combination of Bt cotton and HaNPV showed antagonism. The present results showed that a combination of Cry1Ac and HaNPV usually resulted in mortality levels greater than in the case of Cry1Ac but not greater than with the virus alone.     

荧光增白剂对Cry1Ac抗感棉铃虫围食膜的影响及增效作用

为了提高Bt的杀虫活性,运用扫描电镜、SDS-PAGE电泳和生物测定技术,研究了荧光增白剂FB28对棉铃虫Cry1Ac抗性和敏感品系围食膜的影响及对Cry1Ac杀虫蛋白的增效作用。结果表明,正常棉铃虫围食膜表面光滑致密,没有空洞和缝隙。用含1%FB28的人工饲料饲喂刚蜕皮的5龄棉铃虫幼虫2 h后,抗感棉铃虫围食膜表面均出现许多空洞,且敏感棉铃虫的空洞明显大于抗性棉铃虫;随着处理时间的延长,围食膜上的空洞逐渐变小,13 h后恢复正常。用1%FB28离体或活体处理抗、感品系棉铃虫,均可造成围食膜蛋白被降解。用1%FB28与Cry1Ac杀虫蛋白混合饲喂抗、感棉铃虫初孵幼虫,可明显提高棉铃虫的死亡率,且对抗性品系的增效作用明显大于敏感品系,对敏感和抗性品系棉铃虫的增效比分别为2.23和9.34;1%FB28还可以明显增加对抗、感品系3龄棉铃虫幼虫的生长抑制作用。     

中黑盲蝽对四季豆豆荚和棉铃虫卵的取食选择性

盲蝽类害虫具有杂食性特点,但已有的取食行为研究主要集中于植食性,缺乏对其食性的全面认识。本文观察了中黑盲蝽在有选择和无选择条件下对四季豆豆荚和棉铃虫卵的取食与选择行为,并利用刺探电位技术分析了其对四季豆豆荚和棉铃虫卵的刺吸行为。研究显示:3种处理上中黑盲蝽总取食时间比例分别为:混合食物(四季豆豆荚和棉铃虫卵)38%、四季豆豆荚33%、棉铃虫卵27%,混合食物上取食四季豆豆荚的时间比例(22%)高于棉铃虫卵(16%)。6h测试时间内,中黑盲蝽刺吸四季豆豆荚时间为6 595s,高于棉铃虫卵(3 641s);单次刺吸时间以在四季豆豆荚上较高(334s)。以上结果表明中黑盲蝽喜欢取食混合食物,且倾向取食刺吸植物。研究结果对进一步解析中黑盲蝽的杂食性,探明其在生态系统中的地位及开发人工饲料有重要科学意义。     

甜菜夜蛾中肠碱性磷酸酶alp2基因的克隆、表达及功能分析

为探究甜菜夜蛾Spodoptera exigua中肠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase protein 2,ALP2)是否为Cry1Ac杀虫蛋白的受体,采用同源克隆和RACE技术克隆了编码alp2基因的完整c DNA序列,利用荧光定量PCR比较了甜菜夜蛾幼虫中肠不同龄期ALP2表达量的差异,利用Ligand blot方法检测了中肠ALP2与Cry1Ac杀虫蛋白的结合。结果表明,alp2基因序列全长1 629 bp(Gen Bank序列号为KP420013),编码542个氨基酸,预测在氨基酸序列N端包含1个由21个氨基酸组成的信号肽,在C端存在1个GPI修饰的锚定位点,且在整个氨基酸序列中存在多个糖基化修饰位点。在整个甜菜夜蛾幼虫期均有ALP2表达,但不同龄期的表达量差异显著,1龄幼虫期表达量最低,4龄幼虫期最高。Ligand blot方法检测结果表明原核表达的ALP2片段与活化的Cry1Ac杀虫蛋白可以结合。研究表明,甜菜夜蛾中肠的ALP2可能是Cry1Ac的受体之一。