枯草芽孢杆菌DZ1的培养基及发酵条件优化研究

本研究以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）DZ1作为研究试材,通过单因子试验及正交试验,确定其适宜的摇瓶培养基及发酵条件。结果表明,培养时间、培养基及培养条件对Bacillus subtilis DZ1的活菌数影响差异显著。DZ1的最佳种龄为12h,最佳碳源和氮源分别是可溶性淀粉和酵母膏。影响枯草芽孢杆菌DZ1活菌数的主要因素为酵母膏,其次为可溶性淀粉,K2HP04和MgSO4-7H2O影响较小。DZ1的最优培养基组合为可溶性淀粉l％,酵母膏1％,K2HPO40．15％,MgS04-7H200．02％,CaCl20．01％,在此条件下,其活菌数可达44．1×10。CFU／mL。单因子试验结果表明,DZl的适宜摇瓶培养条件分别为培养基温度34℃,初始pH值7．0,摇床转速180r／min和接种量7％。     

PGPR对番茄南方根结线虫病的影响

于温室盆栽条件下初步研究了4种根围促生细菌（PGPR）对番茄植株生长和南方根结线虫Meloidogyne incognit病发生情况的影响。结果表明接种多粘芽孢杆菌Bacillus polymyxa或芽孢杆菌菌株B697的番茄植株高度、地上部和地下部干重均显著大于对照,而巨大芽孢杆菌B. megaterium和固氮螺菌Azospirillum sp.菌株A135无促生作用。接种多粘芽孢杆菌＋南方根结线虫和B697菌株＋南方根结线虫两处理的二龄幼虫数、雌虫数、线虫总数、根上卵囊数、卵囊含卵量、发病率和病情指数显著低于只接种南方根结线虫的对照。多粘芽孢杆菌、B697菌株、巨大芽孢杆菌和A135菌株对南方根结线虫的防效分别达65.4%、68.2%、53.8%和53.8%。     

抗香蕉枯萎病菌拮抗菌的鉴定及其定殖

通过逐步提高药物浓度方法,获得了抗利福平400μg/ml、对香蕉枯萎病菌拮抗活性稳定的T2WF和W10标记菌株。初步确定两菌株为芽孢杆菌属细菌。采用灌根接种法,在香蕉苗根际土和香蕉苗体内定殖结果表明,拮抗菌液接种浓度为5×104cfu/ml,两菌株均可从香蕉根际土和香蕉体内分离到,并在香蕉体内定殖和传导。在香蕉根际土、根部、球茎和假茎中,T2WF标记菌的菌量高峰分别出现在接种后5、5、11和3d,分别为707、437、273、117cfu/mg;而W10标记菌的菌量高峰分别出现在接种后5、3、5和5d,分别为784、260、253、110cfu/mg。两菌株在香蕉根际土和香蕉体内1~15d的消长动态均有一个共同的“由升到降”趋势。从数量和数量变动幅度上看,香蕉根部的菌量明显高于茎部的菌量。     

番茄早疫病生防细菌B731的分离、鉴定及抑菌防病作用

利用对峙培养法,从分离自番茄根部土壤的细菌中筛选得1株对番茄早疫病菌具强拮抗活性的菌株B731.根据形态特征、生理生化反应及16S rDNA序列分析将其鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.该菌在初始pH 7.0的NB培养液、装液量25 mL(250 mL锥形瓶)、28℃、120 r/min培养24～48 h抑菌能力最大,抑菌带宽达1.24 cm,且其在番茄植株及根际土壤中有很强的定殖能力.接种15d后,在番茄植株叶片或果实表面,其定殖量可保持在2×102 cfu/cm2以上;而在番茄根际土壤中,其定殖量可达104 cfu/g.菌株B731的代谢产物能有效抑制番茄早疫病菌分生孢子的萌发和菌丝生长,抑制率分别高达89.72％和82.62％.喷施于叶面,具有很好的防病效果,预防处理防效可高达81.83％.     

解淀粉芽胞杆菌MH71摇瓶发酵培养基及发酵条件优化

从黑龙江省漠河多年永冻土层采集的冻土样品中分离的拮抗菌解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens MH71,对多种植物病原真菌和细菌具有较强的拮抗作用.本研究主要以无菌滤液对番茄灰霉病菌的抑菌活性为检测指标,采用单因素试验筛选菌株MH71的最佳产抗菌物质培养基及最佳碳源、氮源和无机盐,运用Minitab软件,通过Box-Benhnken试验及响应面分析相结合的方法对该菌株产抗菌物质的发酵培养基配方和摇瓶发酵条件进行了优化.结果表明,菌株MH71产抗菌物质最佳培养基组成为玉米粉36.6 g/L、牛肉膏3.2 g/L、NaC1 1.33 g/L、葡萄糖14 g/L、蛋白胨7 g/L、MgSO4 0.4 g/L、K2HPO4 0.8 g/L、GaGO3 8 g/L.最适发酵条件为培养温度30℃、摇床转速200 r/min、发酵起始pH 7.0、接种量3％、装液量100 mL/500 mL、发酵时间为72 h.在最佳培养基和培养条件下,菌株MH71的活菌数达到了2.1×109 CFU/mL,芽孢数为1.2×109 CFU/mL,同时对番茄灰霉病菌的抑菌能力较优化前提高了37.4％.     

高产苏云金素培养基和培养条件的优选

用正交试验的方法筛选了苏云金杆菌高产苏云金素的培养基配方和培养条件。在第一次正交试验筛选出的6种培养基配方的基础上,对培养基成分和用量作调整后进行第二次正交试验,筛选出五种培养基配方。将这11种培养基用3个菌株继续评选,尽管不同菌株在同一培养基中产苏云金素的量不同,但3个菌株产苏云金素量最高,且稳定的培养基匀为M_3培养基。正交试验的最后培养条件:温度32℃、pH6.5、通气量最大,转速200rpm、接种菌龄16小时、接种量3％、培养24小时。同时,还对苏云金菌杆CT—43菌株在培养基M_3中不同发酵时间的细胞数、pH、还原糖、氨态氮和可溶性磷以及苏云金素的杀虫活性进行了检测。     

枯草芽孢杆菌B006对黄瓜枯萎病菌和辣椒疫霉病菌的抑制作用及其抗菌组分分析

枯草芽孢杆菌菌株B006发酵液的甲醇提取物对黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum菌丝的抑制作用大于对辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici菌丝的抑制作用;但对P. capsici游动孢子萌发的抑制作用明显大于对黄瓜枯萎病菌孢子萌发的抑制作用,提取物原液在5 min内可使辣椒疫霉的游动孢子全部崩解。提取物经60、90和120℃加热处理10 min后仍保持抑菌活性,其盐酸水解液在TLC层析板显现橙红色斑点,说明提取物具有环肽结构。HPLC-ESI-MS分析可得到m/z为995、1009、1023、1037、1051和1436、1450、1478和1492的质谱峰,与抗菌物质surfactin和fengycin的分子量大小一致。以终浓度为10^6 cfu·g^-1的接种量将B006菌剂施入无菌育苗基质中,在黄瓜和辣椒4～6片叶期时用固相萃取法提取根际的抗菌物质,并进行HPLC-ESI-MS分析,可从根际检测到surfactin和fengycin,但未从对照处理根上检测到脂肽类抗生素。本研究对理解枯草芽孢杆菌在田间状况下的防病机理有一定意义。     

荒漠草原植物骆驼蓬根际土壤细菌群落分析北大核心CSCD

骆驼蓬（Peganum harmala L.）具有较强耐旱抗寒特性,在维护生态环境中发挥着重要作用。为了解其生态适应及与环境相互作用机制,采用高通量测序和纯培养方法研究了甘肃白银荒漠草原区骆驼蓬根际土壤细菌群落特征,并与周边土壤进行了对比。结果表明：骆驼蓬根际土壤主要优势细菌群为放线菌门（Actinobacteria）30.01%、变形菌门（Proteobacteria）23.98%、拟杆菌门（Bacteroidetes）11.53%、酸杆菌门（Acidobacteria）10.19%。周边荒漠草原土壤主要优势细菌群为放线菌门55.05%、变形菌门21.11%、酸杆菌门6.07%。可培养细菌类群包括厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门、放线菌门,其中根际土壤分离的优势菌为短杆菌属（Brevibacterium）23.53%、芽孢杆菌属（Bacillus）23.53%、假单胞菌属（Pseudomonas）17.65%,周边土壤可培养细菌的优势种群为节杆菌属（Arthrobacter）37.50%、芽孢杆菌属18.75%、假单胞菌属12.50%。骆驼蓬根际微生物群落组成和结构与周边土壤有显著差异,根际土壤微生物数量及多样性指数明显高于非根际土壤。研究结果对了解荒漠植物与根际微生物之间相互作用,揭示土壤微生物促进植物根际土壤物质循环转化作用,筛选促生长有益微生物,为加强荒漠草原生态保护提供科学依据。     

荒漠草原植物骆驼蓬根际土壤细菌群落分析

骆驼蓬(Peganum harmala L.)具有较强耐旱抗寒特性,在维护生态环境中发挥着重要作用。为了解其生态适应及与环境相互作用机制,采用高通量测序和纯培养方法研究了甘肃白银荒漠草原区骆驼蓬根际土壤细菌群落特征,并与周边土壤进行了对比。结果表明:骆驼蓬根际土壤主要优势细菌群为放线菌门(Actinobacteria)30.01%、变形菌门(Proteobacteria)23.98%、拟杆菌门(Bacteroidetes)11.53%、酸杆菌门(Acidobacteria)10.19%。周边荒漠草原土壤主要优势细菌群为放线菌门55.05%、变形菌门21.11%、酸杆菌门6.07%。可培养细菌类群包括厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门、放线菌门,其中根际土壤分离的优势菌为短杆菌属(Brevibacterium)23.53%、芽孢杆菌属(Bacillus)23.53%、假单胞菌属(Pseudomonas)17.65%,周边土壤可培养细菌的优势种群为节杆菌属(Arthrobacter)37.50%、芽孢杆菌属18.75%、假单胞菌属12.50%。骆驼蓬根际微生物群落组成和结构与周边土壤有显著差异,根际土壤微生物数量及多样性指数明显高于非根际土壤。研究结果对了解荒漠植物与根际微生物之间相互作用,揭示土壤微生物促进植物根际土壤物质循环转化作用,筛选促生长有益微生物,为加强荒漠草原生态保护提供科学依据。     

植物根际优良促生菌（PGPR）筛选及其接种剂部分替代化肥对玉米生长影响研究

通过测定植物根际促生菌株固氮酶活性、溶磷量、分泌植物生长素、对病原菌的拮抗作用及菌株生长速度,筛选出了5株具有较好促生特性的优良菌株.利用筛选的优良菌株研制复合接种剂,并于2009年和2010年进行田试,测定其部分替代化肥对玉米生长的影响.结果表明:利用筛选的优良促生菌研制的复合微生物接种剂符合《微生物肥料》NY227-94标准.施用接种剂替代20％ ～ 30％的化肥,玉米株高、地上植物量、穗长、穗粗、单位面积穗数、穗粒数和经济产量等均有提高.研制的微生物接种剂(菌肥+80％化肥),2010年大田推广使用,玉米增产9.86％,减少化肥投入、增产收入及直接经济效益分别为620.1元,hm-2、2 291.4元,hm-2和2 851.5元.hm-2.     

影响蜡蚧轮枝菌发酵产孢量和孢子活力的基本因素分析

不同接种浓度、发酵时间、菌株和基质对蜡蚧轮枝菌固体发酵的产孢量都有显著影响，而对孢子活力的影响不明显，萌发率均在90％以上。在5至7天内，随发酵时间的延长产孢量有明显增长；7至10天则变化不大；15天时产孢量和孢子活力均显著降低。随接种孢子浓度每增加1倍，菌株（VLFNL 95－01）发酵的产孢量平均提高15.6%，浓度加大至32倍则提高71.9%。3个菌株比较，VLFNL95－01产孢量明显高得多。不同固体基质发酵的结果有显著差异，产孢量最高的（正交3号配方）比其次的（黄豆饼粉＋玉米碎粒＋磷酸盐）就提高了95.1%。     

对紫茎泽兰具有除草活性的特基拉芽胞杆菌ZLSY5的鉴定及发酵条件筛选

为明确菌株的进化关系及发酵条件,本试验对一株来自泽兰实蝇幼虫消化道的ZLSY5菌株进行了鉴定,优化了基础发酵培养基和发酵条件。用形态学及建立系统进化树的方法鉴定了菌株;用分光光度法测定菌液在600 nm处的OD值, 根据OD值的大小判断发酵条件的优劣;用圆叶片法测定了优化前后菌株对紫茎泽兰叶片的侵害作用的比较。结果表明,菌株ZLSY5为特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis 10 b;分别在不同培养基上接种培养72 h后,以牛肉膏酵母葡萄糖培养基中细菌量最多,细菌生长速度最快;在5种不同碳源中,麦芽糖最利于菌株ZLSY5生长;在6种不同氮源中,酵母膏效果最好,其次为蛋白胨。最适发酵条件为温度28 ℃,pH 6,接菌量2.0 %,装液量40 mL/250 mL,转速240 r/min,发酵时间36 h,光照20 h/d。菌株ZLSY5最适培养基：蛋白胨10 g/L,酵母膏5 g/L,麦芽糖10 g/L,蒸馏水1 L。优化后培养基对叶片的影响较小,因此优化后所培养的菌株ZLSY5对紫茎泽兰叶片的侵害作用更好,原浓度时侵害指数接近90%。     

青枯病植物疫苗生产菌FJAT-1458发酵工艺的优化

为提高防治青枯病的植物疫苗菌FJAT-1458的发酵工艺，本文采用液固双相发酵方式，以活菌体数量为指标，通过单因子和正交设计试验对菌株FJAT-1458液体发酵培养基进行优化，并利用农业副产物——微生物发酵床养猪垫料为发酵培养基主成分进行固体培养工艺优化，为研制植物疫苗菌剂提供基础。结果表明，菌株FJAT-1458液体发酵的最适培养基配方为玉米粉2.5%、鱼骨粉0.5%、蔗糖0.1%、蛋白胨0.15%、K₂HPO₄ 0.05%和MgSO₄ 0.025%，发酵48 h后，发酵液活菌含量可达3.87×10⁹ cfu/mL。该菌固体发酵最佳培养基配方为垫料:黄豆饼粉=7:3（质量比），最佳发酵条件为温度35℃、含水量45%、接菌量15%、通气量70%时，培养40 h后，固体菌剂活菌量达4.68×10⁸ cfu/g。     

枯草芽胞杆菌B201产芽孢培养基优化

采用单因素试验及正交试验设计对枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis B201产孢培养基进行了碳源、氮源、无机盐筛选及优化,最终确定B201发酵培养基配方为玉米粉3 g/L,糖蜜10 g/L,豆粕粉10 g/L,鱼粉10 g/L,K₂HPO₄ 2 g/L,Na₂HPO₄ 2 g/L,MgSO₄ 0.5 g/L,MnSO₄ 0.5 g/L。优化后的培养基在500 L通气式机械搅拌发酵罐中进行了小试,结果表明B201生长快速,发酵16 h开始形成芽孢,26 h放罐后发酵液活菌量达到1.06×1010 CFU/mL,芽孢量8.8×109 CFU/mL,芽孢形成率为83.0%,活菌含量和芽孢形成率较高,为B201工业化生产奠定了基础。     

解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌的抗生作用

为明确解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌的抗生作用, 采用平板对峙法和菌丝生长速率法以及孢子萌发法测定了解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌菌落生长和孢子萌发的抑制作用?结果表明:菌株TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌具有显著的抑制作用, 其菌液对病菌的抑制率高达70.4%; 其发酵液对苹果炭疽叶枯病菌的抑制率随着发酵液浓度的增加而升高, 尤其当发酵液浓度为15%时, 其抑菌率为 59.0%; 发酵液处理苹果炭疽叶枯病菌孢子24 h后, 其萌发抑制率与芽管生长抑制率分别为78.2%与64.3%, 且芽管出现畸形; 利用TS-1203发酵液处理苹果离体叶片后接种炭疽叶枯病菌, 其防效为70.1%?综合分析表明, 解淀粉芽胞杆菌TS-1203对苹果炭疽叶枯病菌具有良好的抑制作用?     

醚菌酯对番茄灰霉病菌的生物活性及其防病方式研究

离体试验表明,醚菌酯对番茄灰霉病菌菌丝生长、孢子萌发、孢子产量和菌核产量均有一定的抑制作用,其EC50分别为935.670、0.667、0.479和6.975mg/L。其中对菌丝生长的抑制作用较低。但是,用10mg/L和20mg/L的醚菌酯叶片喷雾处理前24h,接种灰霉病菌菌碟,醚菌酯对灰霉病的保护效果分别达到92.3%和100%;处理后24h接种,治疗效果分别达83.3%和100%,说明醚菌酯对番茄灰霉病具有很好的保护和治疗作用。醚菌酯具有优异的内吸活性,能在植物体内向顶传导。     

对韭菜迟眼蕈蚊高活性的苏云金芽胞杆菌JQD117发酵培养基及摇瓶发酵条件优化

为了提高苏云金芽胞杆菌的芽胞产量，应用响应面设计对苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）JQD117进行发酵培养基和摇瓶发酵条件的优化。本研究在单因素试验基础上，采用响应面试验设计方法优化培养基组分和发酵条件参数。最佳发酵培养基为棉籽饼粉2.00%，大豆饼粉1.00%，酵母粉1.50%，可溶性淀粉2.00%，CaCO₃ 0.30%，MnSO₄ 0.04%，MgSO₄ 0.18%，K₂HPO₄ 0.04%；最佳发酵条件：接种量3%、装液量60 mL、温度30℃、转速150 r/min、初始pH 7.5。在最佳发酵条件下理论活芽胞产量可以达到6.75×10⁹个/mL，试验验证后实际活芽胞产量为5.97×10⁹个/mL。运用响应面法对Bt的发酵条件进行优化，获得了提高芽胞产量的关键参数，为该菌株产业化、规模化应用奠定了基础，为韭菜迟眼蕈蚊的绿色防控和蔬菜的安全生产提供了理论基础。     

马铃薯疮痂病高效生防芽孢杆菌的筛选及发酵条件优化

利用已鉴定的5株拮抗马铃薯黑痣病病原菌的生防芽孢杆菌（Bacillus），筛选其对马铃薯疮痂病病原菌的抑制作用，通过检测生防菌脂肽类抗生素合成相关基因研究其生防机制。对峙试验结果表明，5株生防菌中以QHZ-3对马铃薯疮痂病病原菌的抑制效果最佳，抑菌率为44%；抗生素合成基因检测结果显示，QHZ-1和QHZ-2具有丰原素（Fengycin）和伊枯草菌素（Iturin）合成酶基因；QHZ-4仅具有Fengycin合成酶基因；而QHZ-3与QHZ-5菌株同时具有表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（Iturin）和丰原素（fengycin）3种脂肽类抗生素合成酶基因。选择最具生防潜力的QHZ-3进行进一步试验，发现该菌株发酵滤液对疮痂链霉菌的抑菌圈直径达到30.4 mm，且在高温、紫外照射以及强酸强碱的条件下抑菌圈直径仍然可保持在27 mm以上。单因素试验结果表明，每瓶（250 mL）装液量60 mL，接种量6%，摇床转速180 r·min^-1，发酵时间60 h的条件下，菌株QHZ-3的生长量最高。正交试验结果显示，装液量每瓶40 mL、摇床转速170 r·min^-1、接种量6%、发酵时间48 h的组合下，QHZ-3生长状态最佳，活菌数可达到1.31×10¹⁰ cfu·mL^-1。二次固态发酵条件优化结果显示，以腐熟的牛粪有机肥为载体，在接种量为15%时，活菌数最高，达到1.14×10⁹ cfu·mL^-1。     

大黄酚对黄瓜白粉病菌的抑制作用研究

 采用子叶喷雾法分别测定了大黄酚(chrysophanol)对黄瓜白粉病菌(Sphaerotheca fuliginea)的保护和治疗生物活性。结果表明,大黄酚能有效降低黄瓜白粉病的病情指数,其保护和治疗作用的EC₅₀分别为0.23μg/mL和25.88μg/mL,对照药剂50%硫磺悬浮剂保护作用的EC₅₀为59.75μg/mL,10%苯咪甲环唑可湿性水分散粒剂治疗作用的EC₅₀为13.55μg/mL。在此基础上,利用2.4μg/mL大黄酚溶液处理黄瓜子叶24h后接种白粉病菌,在不同时段对病组织进行透明染色观察白粉病菌的变化情况。结果发现,大黄酚可有效降低黄瓜白粉病菌分生孢子的萌发率和萌发芽管个数,并能抑制菌丝的生长以及降低新生分生孢子的个数。接菌后24h,清水对照萌发率为66.6%,而大黄酚处理后的孢子不萌发;接菌后48h,对照菌丝的平均长度为414.7μm,大黄酚处理的菌丝平均长度为40.1μm;接菌后144h,对照的新生分生孢子串最多为8个孢子,大部分为6-7个,而大黄酚处理后的新生分生孢子串孢子个数最多为2个,大部分为1个。接菌7d后对照的病情指数为72.2,大黄酚处理组的病情指数仅为2.1,其保护作用防治效果达到97.1%,远高于50%硫磺悬浮剂65.4%的防效。