首届中国植物保护学会科学技术奖获奖成果介绍 水稻条纹叶枯病与传毒媒介灰飞虱发生规律、监测预警与持续控制技术研究（一等奖）

首次测定了浙北地区近年暴发的水稻病毒病病原基因组全序列,明确该病害由水稻条纹叶枯病毒（RSV）引起;在RSV pcl蛋白的RdRp特征性区域内发现3个酶活性位点及其N-端存在一个OUT一结构域,在RSV及同属病毒基因组中发现一个保守并能形成茎环结构的新基序;建立了双抗夹心ELISA和RT—PCR方法,用于RSV及单头灰飞虱带毒率的快速检测和诊断;探明了RSV与灰飞虱田闻发生消长规律、暴发成灾成因,发现千金子和白顶早熟禾分别为RSV和灰飞虱新寄主;发明了具有自主知识产权的灰飞虱发生监测和采集仪器多项,     

一种侵染滇重楼的Potexvirus病毒分离物分子鉴定及其3'末端序列分析

 从云南武定的滇重楼上得到一个病毒分离物Paris-YN,病毒粒体为弯曲线状。利用RT-PCR扩增获得一条1074bp的片段,序列比较分析发现其与马铃薯X病毒属(Potexvirus)病毒3'末端的结构最为相似,且与属内的白三叶草花叶病毒等20个不同分离物3'末端有36.7%~58.9%的同源性;该病毒cp基因长639个核苷酸,编码212个氨基酸(22.8kDa),与20个Potexvirus病毒分离物的CP氨基酸序列比较发现,Paris-YN与白三叶草花叶病毒的CP氨基酸同源性最高(60.1%)。证据表明,该分离物可能为Potexvirus的新成员,暂命名为重楼X病毒(Paris polyphylla virus X)。     

侵染云南烟草的番茄环纹斑点病毒N基因的分子变异分析

 应用电镜观察和ELISA检测从云南11个县（市）烟草种植区采集的烟草上检测到番茄环纹斑点病毒（Tomato zonate spot virus, TZSV）。根据TZSV N基因设计引物扩增得到了31个TZSV分离物N基因全序列。测序分析表明,31个TZSV N基因核苷酸序列与GenBank中报道的序列相似性在94.9%~98%之间,其推导的氨基酸序列同源性为98.2%~99.3%。构建系统进化树发现云南不同地区的TZSV分离物存在一定差异。氨基酸序列比较发现,文山分离物和西畴分离物具有2个该地区独有的氨基酸位点。     

番木瓜环斑病毒南瓜分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

利用电镜和酶联免疫法在云南省采集到的5份南瓜病样中检测到番木瓜环斑病毒(Papayaring spot virus,PRSV)。为了进一步从分子水平确定云南省南瓜病毒病原种类,并为下一步转基因育种提供抗性基因,采用反转录PCR(RT-PCR)方法扩增了5个分离物的外壳蛋白(coat protein,CP)基因片段,并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明,番木瓜环斑病毒石屏分离物(PRSV-SP)和番木瓜环斑病毒蒙自分离物(PRSV-MZ)的CP基因长873nt,编码290个氨基酸,番木瓜环斑病毒峨山分离物(PRSV-ES)、番木瓜环斑病毒版纳分离物(PRSV-BN)和番木瓜环斑病毒宾川分离物(PRSV-BC),3个分离物CP基因长867nt,编码288个氨基酸。PRSV5个分离物核苷酸序列的同源性在94%以上,氨基酸序列的同源性在96%以上。与国内外17个分离物相比,核苷酸序列同源性为89.6%~98.7%,氨基酸序列同源性为86.5%~99.6%。其中PRSV-SP和来自于越南分离物PRSV-V47无论是核苷酸序列,还是氨基酸序列同源性都达到了最高,而5个分离物与来自于巴西(PRSV-BR)、美国(PRSV-USA)、墨西哥(PRSV-Y)核苷酸序列同源性均低于90%。     

菜豆黄花叶病毒中国和叙利亚蚕豆分离物外壳蛋白的序列分析

 病毒病是影响云南省蚕豆生产的重要病害。对采集的蚕豆病毒病标样进行了组织印迹法检测,表明菜豆黄花叶病毒(BYMV)是最主要的病原。据此,以BYMV基因的保守序列设计了一对特异性引物,用BYMV的5个中国云南蚕豆分离物和1个叙利亚蚕豆分离物侵染的蚕豆叶片总RNA为模板,RT-PCR扩增获得了长度为907bp的目标片段。序列分析显示,此片段中包含822bp的外壳蛋白序列。6个分离物间的外壳蛋白核苷酸和推导编码蛋白质的氨基酸序列的同源性分别为86.4%~100.0%和96.7%~100.0%。与GenBank登录的34个具有完整外壳蛋白序列的BYMV分离物进行同源性和系统进化树分析的结果表明,6个分离物在核苷酸和氨基酸水平上与其它分离物的同源性分别为79.1%~97.9%和83.5%~98.5%,BYMV中国蚕豆分离物与日本蚕豆分离物同源性最高。外壳蛋白基因的序列特征揭示,在BYMV中的蚜传相关基序为NAG。     

来源于猕猴桃的柑橘叶斑驳病毒的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV)为柑橘病毒属(Citrivirus)代表种。本研究采用RT-PCR技术从我国栽培猕猴桃上首次检测到CLBV,总检出率为13.3%。测定了5个CLBV分离物的外壳蛋白基因(coat protein gene,cp)序列,全长均为1 092核苷酸(nt),分离物间cp基因核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为83.2%~99.7%和91.9%~98.9%,这些分离物与新西兰报道的CLBV猕猴桃分离物M3-A核苷酸序列相似性仅为83%左右,与来源于柑橘及近缘种的CLBV分离物cp基因核苷酸序列相似性为84%~86%。在基于该病毒cp基因核苷酸序列的系统进化树中,本研究所测定的CLBV猕猴桃分离物与新西兰报道的除M3-A外的猕猴桃分离物聚在同一组群。研究结果为进一步明确CLBV在我国猕猴桃上的侵染和危害特点及建立该病毒的分子检测技术提供了重要信息。     

西瓜花叶病毒2号南瓜分离物的鉴定及其外壳蛋白基因序列分析

 利用电镜和酶联免疫吸附测定法(ELISA)在黑龙江省采集的南瓜病样中检测到西瓜花叶病毒2号(WMV-2)。再利用免疫PCR (IC-PCR)和反转录PCR (RT-PCR)方法,扩增获得其外壳蛋白(CP)基因片段,并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明,该分离物CP基因全长为852个核苷酸,编码由284个氨基酸组成的31.8 kDa蛋白。与国外已报道的WMV-2 CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.2%~94.0%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.5%~98.1%。与国内2个分离物相比,和山西分离物核苷酸和氨基酸的同源性都达到98.5%,和郑州分离物核苷酸和氨基酸的同源性分别为91.5%和95.0%。     

西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

 利用RT-PCR从新疆昌吉地区表现花叶、疱斑、扭曲等症状的南瓜病株上检测到西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物(简称WMV-2-XJ-CJ),并测定了该分离物外壳蛋白(CP)基因序列。序列分析表明,新疆昌吉分离物CP基因全长850个核苷酸,编码197个氨基酸。与国内外报道的12个WMV-2CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.6%~98.3%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.7%~99.3%。新疆昌吉分离物在CP N'端可变区明显不同于国内外报道的核苷酸序列。WMV-2新疆昌吉分离物与日本和郑州分离物较其它国家和地区的分离物多出6个核苷酸,但其核苷酸及其推导的氨基酸序列差异较大。新疆昌吉分离物外壳蛋白有2个氨基酸残基明显不同于其它分离物,其中蚜传株系的特征结构域DAG突变为DAE。     

一种侵染滇重楼的Potexvirus病毒分离物分子鉴定及其3′末端序列分析

从云南武定的滇重楼上得到一个病毒分离物Paris-YN,病毒粒体为弯曲线状。利用RT-PCR扩增获得一条1074bp的片段,序列比较分析发现其与马铃薯X病毒属(Potexvirus)病毒3′末端的结构最为相似,且与属内的白三叶草花叶病毒等20个不同分离物3′末端有36.7%～58.9%的同源性;该病毒cp基因长639个核苷酸,编码212个氨基酸(22.8kDa),与20个Potexvirus病毒分离物的CP氨基酸序列比较发现,Paris-YN与白三叶草花叶病毒的CP氨基酸同源性最高(60.1%)。证据表明,该分离物可能为Potexvirus的新成员,暂命名为重楼X病毒(Paris polyphylla virus X)。     

实时荧光RT-PCR-步法检测南方菜豆花叶病毒

南方菜豆花叶病毒(Southern bean mosaic virus,SBMV)是我国二类检疫性有害生物,以南方菜豆花叶病毒日本分离物(SBMV-J)总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增病毒外壳蛋白基因及其上游基因的cDNA片断并将其克隆到pMD18-T载体上。序列分析结果表明:SBMV-J cp基因由801个核苷酸组成,编码266个氨基酸,SBMV-J与其它分离物及株系cp基因的核苷酸序列同源性为83%～97%,氨基酸序列同源性为86%～97%。由于SBMV各分离物及株系cp基因的同源性较低,难于设计出较长的普通PCR引物。通过较短引物设计和TaqMan-MGB探针技术,建立了SBMV的实时荧光RT-PCR一步检测方法。该方法的检测低限是0．16 pg,最佳检测总RNA的量是0．16 ng。     

灰飞虱传播水稻条纹叶枯病毒的特性

灰飞虱是水稻条纹叶枯病的传毒介体,带毒的长短翅型成虫及各龄若虫均能在秧苗期和分蘖期传毒感病,秧苗感病以卷叶型为主,均相继枯死,分蘖期感病以展叶型为主,病株95％以上不能抽穗结实。主蘖传毒,主蘖及各分蘖均发病,分蘖传毒,仅分蘖发病。带毒雌雄配对繁衍3代,无毒分离率平均为31.38％。带毒虫传毒3min,发病率为2％,传毒2h,发病率达22.5％。带毒率50％以上的群体一生传毒频次为3～5次,10％以下仅1次。各龄若虫及不同成虫1天传毒致病株:秧苗期为0.97株及1.26株:分蘖期为0.45株及0.42株。秧田传毒后,80％以上的隐症病株到本田期才陆续显现病状,故秧田“治虫防病”甚为重要。     

云南烟草产区辣椒脉斑驳病毒的调查及其遗传多样性分析

明确辣椒脉斑驳病毒(chilli veinal mottle virus, ChiVMV)在云南6个州(市)烟草生产区的分布、遗传多样性和群体遗传结构,对病害的防控预警具有重要意义。本研究以2022年采集自云南6个州(市)不同烟草产区的96份疑似感染ChiVMV的烟草样品为试验材料,利用电子显微镜负染色观察和分子生物学方法对病毒进行检测和鉴定,获得21个ChiVMV云南烟草分离物的cp基因序列。利用SDT、MEGA、RDP、DnaSP及Arlequin等生物学软件对21个云南烟草分离物及NCBI上下载的38个来自不同国家、地区及寄主的ChiVMV分离物cp基因序列的系统进化、遗传多样性和群体遗传结构特征进行分析。结果显示,从云南6个州(市)烟草生产区采集的96份烟草样品中,ChiVMV检出率为51.04%;序列比对发现,本研究获得的cp基因与NCBI中38个ChiVMV分离物cp基因的核苷酸一致性在84.1%以上;系统发育分析发现,59个ChiVMV分离物按照地理位置的远近被划分为4个分支,聚类结果具有明显的地理分布特征,而与寄主植物无关;遗传多样性和遗传分化分析表明,4个地理种群的ChiVMV cp基因遗传多样性水平均较高,中国种群与印度、泰国和其他国家种群间发生了很大的遗传分化且差异显著(P<0.05);遗传力分析显示,基因交流、遗传漂变和基因的负选择压力是ChiVMV分离物适应性进化的重要方式。     

灰飞虱种群数量变动规律与模型测报技术研究

根据临海市1986-2005年灰飞虱成虫灯下诱集资料和田间测报调查情况,阐述灰飞虱田间消长动态,分析灰飞虱种群变化特征和运动规律,以及主要影响因子,并运用灰飞虱种群运动原理,创建了7种灰飞虱种群数量预测的数学模型,具有良好应用效果。     

灰飞虱冠蛋白的基因克隆与表达分析

灰飞虱Laodelphax striatellus冠蛋白属于WD40重复超家族成员,主要通过结合肌动蛋白调控细胞骨架的动态聚合与解聚。本研究通过RT-PCR克隆并获得了灰飞虱3个冠蛋白coronin 1A、coronin 2B和coronin 7的基因CDS区。系统进化树分析显示,这3个冠蛋白分别属于3个分支,且与褐飞虱Nilaparvata lugens的3个冠蛋白同源性最高,氨基酸序列相似性分别为99.2%、88.2%和82.5%。荧光定量PCR检测结果显示,coronin 1A在成虫中的转录水平显著高于2龄、4龄若虫,coronin 2B在雄虫中的转录水平显著高于2龄、4龄若虫和雌虫,coronin 7在雌虫中的转录水平显著高于2龄、4龄若虫和雄虫。而3个冠蛋白基因在唾液腺中的转录水平都显著高于肠道。灰飞虱携带水稻条纹病毒(rice stripe tenuivirus, RSV)后体内3个冠蛋白基因的转录水平显著高于对照,说明冠蛋白可能在灰飞虱传播RSV过程中发挥一定作用,研究结果为深入探究冠蛋白的功能奠定了基础。     

灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建及分析

以灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）mRNA为起始模板,利用Gateway技术构建了灰飞虱酵母双杂交cDNA文库。经过检测表明：构建的初级cDNA文库的库容量为1.85×107 cfu;扩增文库滴度为7.7×108 cfu/mL,重组率约为97%;扩增文库插入片段主要集中在1 000~1 500 bp之间。随机挑取10个克隆,经测序与GenBank数据库比对结果显示7个克隆具有同源序列,其中L2、L9为已公布的灰飞虱序列。灰飞虱酵母双杂交cDNA文库的构建为克隆全长目的基因及研究灰飞虱与其传播的水稻病毒间的互作奠定了基础。     

灰飞虱对杀虫剂抗药性的研究进展

灰飞虱对杀虫剂产生抗药性是其近年来暴发频繁的重要原因。本文综述了国内外关于灰飞虱抗药性的研究成果,包括灰飞虱抗药性的发展、交互抗性、抗性机理、抗性遗传及生物适合度等。田间灰飞虱种群对多种药剂产生了不同程度的抗药性,其中对新烟碱类药剂吡虫啉和昆虫生长调节剂噻嗪酮产生了高水平到极高水平抗性(抗药性倍数分别为44.6～108.8倍和超过200倍),对有机磷类药剂毒死蜱和乙酰甲胺磷(抗药性倍数分别为10～12.6倍和9～13倍)、氨基甲酸酯类药剂甲萘威和残杀威(抗药性倍数分别为29.8～45.3倍和40.1～131.5倍)和拟除虫菊酯类药剂高效氯氰菊酯和溴氰菊酯(抗药性倍数分别为7.8～108.8倍和12～21倍)产生了中等水平到高水平的抗药性,对氟虫腈、阿维菌素和噻虫嗪没有产生抗药性(抗性倍数5倍)。长期大面积使用化学药剂是灰飞虱产生抗药性的重要原因。因此,必须加强灰飞虱的抗性治理,以延缓其抗药性进一步发展。     

大麦黄条点花叶病毒传播方式和传播特性研究初报

大麦黄条点花叶病毒(Barley yellow striate mosaic virus,BYSMV)是我国小麦产区新发现的一种病毒,为了明确该病毒的发生流行规律并建立相应的防治方法,在温室条件下对该病毒的传播方式、介体传毒特性进行了研究。初步研究结果表明:BYSMV仅由介体昆虫灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)传播,不能通过机械摩擦、土壤和病残体传播。该病毒在灰飞虱体内的循回期最短为6 d,接种后20 d达到传毒发病盛期。灰飞虱最短获毒和传毒时间均为1 min,病毒在小麦苗中的最短潜育期为5 d。由此可见,灰飞虱对BYSMV具有较强的获毒和传毒能力。本研究为下一步进行该病毒的寄主范围、病害的发生规律等方面的研究提供了技术手段,也为生产上预防和控治由该病毒引起的病害提供了理论依据。     

Prophage region and short tandem repeats of “Candidatus Liberibacter asiaticus” reveal significant population structure in China

Whole-genome sequencing of “Candidatus Liberibacter asiaticus” (Las) indicated some polymorphic gene regions enabling the molecular characterization of this bacterium. Although the population diversity of Las in China has been previously studied, no reports have used a combination of a prophage region and short tandem repeat (STR) loci for phylogenetic relationship characterization. In this study, we investigated the genetic diversity and structure of 667 Las strains from nine provinces in southern China using multiple genetic loci including three type-specific prophage loci, two STR loci, and a miniature inverted-repeat transposable element (MITE) region. The results indicated that the genetic diversity varied according to the gene loci used. The prophage regions, including the MITEs, revealed significant genetic differences of Las populations in Yunnan and Guizhou from other provinces, while the STR loci only indicated a difference of Las population in Guizhou from those of other provinces. In particular, the Las population shown to be diverse in Jiangxi at the CLIBASIA_01215_STR locus was not diverse when measured using the other loci. Considering all loci, the Las populations from Yunnan and Guizhou were different, those from Guangdong and Guangxi were complex, while the Las population in Jiangxi was comparatively simple. Las populations from five neighbouring provinces, including Guangdong, Guangxi, Hunan, Fujian, and Jiangxi were grouped in a big cluster. The Las population structure changed with age according to the prophage type. This study evaluated the method used for studying the molecular diversity of Las populations and provided more detailed information on the geographical origin and epidemic trend of Chinese Las populations.     

4种杀虫剂对玉米3种害虫的毒力及种子处理防治效果评价

为评价4种杀虫剂在玉米田防治灰飞虱Laodelphax striatellus、禾蓟马Frankliniella tenuicornis和玉米蚜Rhopalosiphum maidis的应用前景,采用浸苗法测定了其对3种害虫的毒力,并通过种子处理筛选对3种害虫田间防效较高的药剂。结果表明,噻虫嗪、呋虫胺和吡虫啉对灰飞虱、禾蓟马和玉米蚜具有较高毒力,LC50分别为0.14～1.10、4.24～31.01 mg/L和0.80～7.49 mg/L,氟啶虫酰胺的毒力最低,对3种害虫的LC50分别为84. 55、222.72 mg/L和44.81 mg/L。采用种子处理的方式施药后,各药剂处理组玉米出苗率与对照组无显著差异,安全性较高;播种后30 d,20%氟啶虫酰胺种子处理悬浮剂对灰飞虱、禾蓟马的防效均在75%以上,播种后40 d,70%噻虫嗪种子处理可分散粉剂对灰飞虱防效最高,其次为20%氟啶虫酰胺种子处理悬浮剂、8%呋虫胺悬浮种衣剂和600 g/L吡虫啉悬浮种衣剂;播种后50 d(玉米抽雄期)调查,20%氟啶虫酰胺种子处理悬浮剂对玉米蚜防治效果可达92.1%,表现出较高的防治效果,噻虫嗪、呋虫胺、吡虫啉防治效果略低,但均在70%以上,能有效防治玉米蚜的为害。综上,氟啶虫酰胺、噻虫嗪、呋虫胺和吡虫啉均适合用于防治玉米田灰飞虱、禾蓟马和玉米蚜3种害虫。     

基于DNA条形码技术的湖南省柑橘主产区实蝇幼虫分子鉴定

为明确湖南省柑橘主产区的实蝇入侵为害现状,从该省7个市(自治州)22个地点收集柑橘蛆果中的幼虫,利用DNA条形码技术对其进行分子鉴定,并以DNA条形码序列作为分子标记探究橘大实蝇Bactrocera minax的20个中国地理种群(湖南省6个组群共16个种群、其它3省市4个种群)以及1个印度地理种群间的亲缘地理关系,分析橘大实蝇在我国的遗传进化关系。结果表明,仅采集自邵阳市城步苗族自治县柑橘蛆果中的5头幼虫被鉴定为蜜柑大实蝇B. tsuneonis,其余21个地点采集的595头幼虫均被鉴定为橘大实蝇。21个橘大实蝇地理种群的平均单倍型多样性为0.75,核苷酸多样性为0.0032,核苷酸差异数为2.13,中国所有地理种群均具有较高的遗传多样性;单倍型网络进化图显示湖南、重庆、贵州种群共享的单倍型H3为原始单倍型,表明其为比较原始的种群;AMOVA分析结果显示种群内个体间遗传变异占总体变异的59.04%,是遗传变异的主要来源;遗传分化结果表明湖南省6个组群间均出现了中度至高度的遗传分化,FST在0.0521～0.7795之间。表明DNA条形码技术可用于蜜柑大实蝇和橘大实蝇幼虫的分子鉴定及其种群遗传进化分析。