新疆棉花黄萎病的发生现状及其病原菌的分子鉴定与ISSR分析

为掌握新疆主要植棉区棉花黄萎病的发生现状及其病原菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae的落叶型菌系分布以及遗传变异情况,于2015年对26个新疆主要植棉区棉花黄萎病的发生情况进行了随机调查,统计新疆大丽轮枝菌的培养性状,利用大丽轮枝菌落叶型特异引物D1/D2、INTD2F/INTD2R与非落叶型特异性引物ND1/ND2、INTNDF/INTNDR对新疆大丽轮枝菌菌系进行互补鉴定,并对部分菌系的遗传变异进行简单序列重复区间(inter simple sequence repeat,ISSR)分析。结果表明:2015年新疆棉花黄萎病发病田比例为54.0%,其中病情指数在10.0以上的发病田与2013年持平,而病情指数在20.0以上的严重发病田比例为10.8%,比2013年增加3.8个百分点;新疆大丽轮枝菌的培养性状以菌核型为主,比例为70.1%,菌丝型与中间型比例分别为13.4%和16.5%;新疆大丽轮枝菌落叶型菌系比例为53.2%,26株菌株的来源地全部检出落叶型菌系;聚类分析结果显示,当遗传相似系数为0.66时,新疆大丽轮枝菌落叶型与非落叶型菌系聚为2个谱系,菌系地理来源、培养性状与大丽轮枝菌的遗传分化无明显相关性。     

棉花黄萎病病原菌大丽轮枝菌的快速分子检测

大丽轮枝菌Verticillium dahliae是引起棉花黄萎病的土传病害病原真菌。快速及时地检测出大丽轮枝菌,对棉花黄萎病的早期预警及后期防治具有重要意义。采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测技术对已报道大丽轮枝菌的检测引物进行验证、筛选和改进,获得1对改进的特异性PCR引物VDS-F/VDS-R。在优化的反应体系与扩增条件下,能特异性地从大丽轮枝菌基因组扩增出l条约520 bp的产物条带,检测灵敏度达到10~(-2)ng/μL;利用该引物可特异性地从含有大丽轮枝菌的土壤及棉花植株组织中检测出病原菌;采用巢氏PCR法对人工病土的检测灵敏度达到了10个孢子/g土。表明本引物的PCR检测体系可用于棉花黄萎病的早期快速检测。     

一种丹参新病害的病原菌鉴定及致病力测定

 调查发现河北省安国市丹参生产区发生一种丹参新病害。为有效防治该病害,开展了丹参新病害病原菌分离鉴定及致病力测定。采用常规组织分离法,从丹参病株中分离并单孢纯化获得15个真菌分离物。柯赫氏法则证明这15个真菌分离物可造成丹参组培苗表现与田间病株相似症状,并分离获得了与丹参病株初分离物菌落形态相同的真菌菌株。显微观察发现15个病株初分离物的分生孢子梗具有明显的轮状分枝,在培养基中能够产生黑色放射状微菌核,据此将罹病丹参分离物确定为轮枝菌属真菌(Verticillium)。rDNA-ITS序列比对发现分离物与大丽轮枝菌(V. dahliae)亲缘关系最近,进一步通过特异性引物扩增证明该分离物为大丽轮枝菌。利用大丽轮枝菌落叶型和非落叶型引物扩增发现,13株分离物为落叶型菌株,2株为非落叶型菌株。人工切根接种鉴定结果表明从丹参分离的轮枝菌菌株间存在致病力差异,不同丹参品种对黄萎病存在抗病性差异。本研究首次报道了由大丽轮枝菌引起的丹参黄萎病,研究结果将为防治丹参新病害提供重要依据。     

宁夏马铃薯黄萎病病原菌分离鉴定及寄主范围测定

 为明确引起宁夏马铃薯黄萎病病原菌种类,本试验通过常规组织分离法对采自宁夏马铃薯主栽地区固原和西吉的27株马铃薯黄萎病标样进行了分离,共获得11株分离物。采用形态学并结合肌动蛋白(ACT)、延伸因子-1α(EF1α)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)、色氨酸合成酶(TS)的多基因系统发育分析方法,11株分离物均被鉴定为非苜蓿轮枝菌(Verticillium nonalfalfae)。致病性测定结果表明,该轮枝菌能够侵染马铃薯植株幼苗并引致典型的黄萎病症状。非苜蓿轮枝菌对茄科、菊科、豆科、十字花科、葫芦科和锦葵科等6科13种双子叶作物的致病性测定结果表明,其对西葫芦、黄瓜、茄子、烟草、豇豆、棉花和向日葵的致病性强,对番茄、辣椒、生菜和白菜致病力弱且发病缓慢,对西蓝花和苜蓿无致病性。     

大丽轮枝菌侵染抗感棉种的组织学过程观察

 棉花黄萎病是一种极难防治的土传性真菌病害,研究病原菌侵染棉花的组织学过程对致病机理解析和抗病资源利用具有重要意义。本研究利用绿色荧光蛋白标记的大丽轮枝菌系统研究了其对抗病棉种海岛棉7124和三裂棉、感病棉种军棉1号和戴维逊棉的侵染过程。结果表明,大丽轮枝菌对抗/感棉种的初始侵染没有明显差异,接菌5 h后,分生孢子均能吸附在感病和抗病棉种的根表面。但侵染过程存在显著差异,侵染感病棉种中病原菌3~5 d到达皮层,5~7 d达到维管束,随后迅速扩展繁殖,侵染14 d后即完成系统侵染,并开始产生黄萎病症状;而病原菌侵染抗病棉种,5~7 d才侵入皮层,7~10 d到达维管束,14 d后仍无法扩展,病原菌的定殖与发展受到限制,无法形成系统侵染,较少形成黄萎病症状。本研究通过绿色荧光蛋白标记大丽轮枝菌对抗/感棉种的侵染过程研究,为大丽轮枝菌致病机理研究和抗性资源利用提供了强有力的理论依据。     

向日葵黄萎病病原菌轮枝菌的多重DPO-PCR检测方法

为建立可同时快速检测引起向日葵黄萎病害的2种检疫性病原菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.和黑白轮枝菌V.albo-atrum Reinke et Berthold的方法,根据2种病原菌的β-tubulin基因分别设计特异性DPO引物,建立多重DPO-PCR检测方法,并对其特异性和灵敏度进行评价。结果表明,所设计的DPO引物特异性强,仅大丽轮枝菌和黑白轮枝菌可分别扩增出225 bp与151 bp的特异性条带,其它向日葵病害的7种病原菌及阴性对照均无目的条带;反应体系中引物终浓度为0.2μmol/L、退火温度为60℃时,30个扩增循环的检测灵敏度均可达0.05 ng菌丝DNA量;在45~65℃退火温度范围内均可高效扩增靶基因片段,表明该方法退火温度范围宽。所建立的检测方法能够准确、高效地检测引起向日葵黄萎病的大丽轮枝菌和黑白轮枝菌,可用于向日葵种子带菌筛查及田间病害诊断检测。     

Nit突变体营养亲和性技术在棉花黄萎病菌生理型测定中的应用

 大丽轮枝菌(Verticullrum clahliue Kleb.)是世界性的土传病原菌,严重为害棉花等多种作物。姚耀文等(1982)根据我国棉花黄萎病菌在3大棉种上的致病性反应,将致病力最强的陕西泾阳菌系定为生理型I;致病力最弱的新疆和田菌系为生理型Ⅱ:致病力中等的河南安阳茵系为生理型Ⅲ。     

西兰花轮作及其残体还田对土壤中病原菌微菌核数量、黄萎病发生及马铃薯产量的影响

为明确西兰花轮作及其残体还田对土壤中病原菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae微菌核数量、马铃薯黄萎病发生以及马铃薯产量的影响，分别于2017-2018年和2018-2019年在内蒙古自治区乌兰察布市凉城县岱海镇元山子农场人工病圃和锡林郭勒盟正蓝旗上都镇菜园村自然病圃开展田间试验，利用NP-10培养基测定不同处理土壤中的大丽轮枝菌微菌核数量，并对马铃薯地上叶片和地下块茎上黄萎病的发病率、病情指数以及马铃薯总产量和商品薯产量进行调查。结果显示，以马铃薯连作方式为对照，西兰花轮作及其残体还田后土壤中大丽轮枝菌微菌核的数量明显减少，其中在人工病圃于7、8和9月调查时分别降低了8.46%、36.41%和36.27%，在自然病圃于7、8和9月调查时则分别降低了7.22%、38.06%和48.84%；马铃薯地上叶片和地下块茎上黄萎病的发病率和病情指数均显著降低，在人工病圃对黄萎病的防效为32.91%和54.82%，在自然病圃对黄萎病的防效为46.72%和34.78%；马铃薯总产量和商品薯产量均有所提高，在人工病圃分别增产27.74%和40.08%，在自然病圃分别增产7.12%和8.77%。表明西兰花作为理想的轮作作物可应用于马铃薯黄萎病的有效防控。     

检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定

 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)和黑白轮枝菌（V. albo-atrum）在世界范围内引起多种作物的黄萎病,属于我国重要进境植物检疫对象。本研究对采自我国部分地区和CBS保存的多种植物病原性轮枝菌,包括黑白轮枝菌、大丽轮枝菌及其变种大丽轮枝菌长孢变种(V. dahliae var. longisporum)、三体轮枝菌(V. tricorpus)、变黑轮枝菌(V. nigrescens)和云状轮枝菌(V. nubilum),采用生物学特性观察,结合rDNA-ITS序列分析的方法,进行了比较和分析。结果表明：不同种类轮枝菌在休眠结构形态上具有一定差异,部分菌株不产生任何休眠结构。各供试菌株在15～25℃范围内均可生长,但黑白轮枝菌在30℃下生长受到强烈抑制,而其他菌株受影响较小。对供试菌株rDNA-ITS序列分析结果表明植物病原性轮枝菌可聚为9个分支,包括三体轮枝菌、变黑轮枝菌、云状轮枝菌、V. theobromae、大丽轮枝菌、大丽轮枝菌长孢变种和3个不同的黑白轮枝菌分支,黑白轮枝菌、大丽轮枝菌及其长孢变种亲缘关系较近。采用生物学性状结合rDNA-ITS序列分析能够更加有效地将两种检疫性轮枝菌从其他植物病原性轮枝菌中区分出来。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

环介导等温扩增技术检测大丽轮枝菌

 本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),通过比对分析大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)与其相近种不同靶标序列间的差异,选取Gpd(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因作为靶标基因,设计并筛选了四条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和两条环引物,建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的大丽轮枝菌的检测方法,并进行了特异性、灵敏度实验及田间发病组织的检测。该方法在62 ℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。特异性试验中,仅含有大丽轮枝菌菌株DNA的反应管扩增后呈天蓝色的阳性反应,而其他供试菌株均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为100 pg·μL^-1,在土壤中检测的灵敏度为10个孢子/0.25g土壤。该技术能够检测出棉花发病组织中的目标菌,对采自江苏和山东的24份疑似病害样本进行检测,11份为阳性。该方法的建立为大丽轮枝菌的检测及其所致病害的诊断提供了新的技术。     

莴笋链格孢叶斑病病原鉴定

正莴笋(Lactuca sativa L.var.asparagina Baily)为菊科舌状花亚科莴苣属,又名茎用莴苣,属一年生或两年生草本植物,原产地中海沿岸,约在七世纪初经西亚传入我国,全国各地普遍栽培。2016年分别在河北省及内蒙古莴笋种植区发现一种叶斑病,病斑呈圆形或近圆形、黑褐色、具同心轮纹,     

大丽轮枝菌核糖体基因ITS区段的特异扩增

 根据棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)核糖体基因ITS区段的碱基编码序列,设计合成了1对为26 bp的PCR特异扩增引物(引物1:5'CATCAGTCTCTCTGTTTATACCAACG,和引物2:3'CGATGCGAGCTGTAACTACTACGCAA),进行了大丽轮枝病菌PCR特异扩增试验。试验结果表明:本试验设计合成的这对引物,能对大丽轮枝菌全基因组DNA和人工接种棉花黄萎病病株组织特异地扩增到大丽轮枝菌核糖体基因ITS区段的324 bp分子片段,该对引物可用于棉花黄萎病的分子鉴定和分子监测。本试验结果对棉花黄萎病的早期诊断和病原菌的检测和监测有潜在的应用价值。     

河北省苹果果实黑点病的症状与病原研究初报

 为明确河北省苹果果实黑点病的症状类型及其对应的病原菌,本研究对河北省6个市的果园进行了病害调查和样品采集,并对引起不同症状类型的病果进行了病原菌的分离和鉴定。结果表明,河北省的套袋苹果黑点病可以分为四大类型,分别是萼洼黑点型、果面黑点型、果面晕斑型和梗洼褐斑型。除了果面晕斑型为单一病原侵染之外,其他类型的病斑均分离获得3种或3种以上的病原菌。通过形态学分析以及系统发育分析发现,分离的菌株主要为5个不同属的真菌,分别是粉红聚端孢(Trichothecium roseum)、细极链格孢(Alternaria tenuissima)、产菌核枝顶孢(Acremonium sclerotigenum)、尾孢菌(Cercospora sp.)和镰刀菌(Fusarium sp.)。致病性检测表明,粉红聚端孢和细极链格孢的致病力较强,为引起该病害的主要致病菌。而产菌核枝顶孢在河北省造成的症状比之前的报道更加多样化。本研究明确了河北省苹果果实黑点病的主要症状类型及其对应的病原菌,为该病害的流行规律以及综合防控研究奠定了基础。     

江苏省大丽轮枝菌的培养、遗传及致病特性分析

由大丽轮枝菌引起的黄萎病是我国棉花和茄子的主要病害之一,对棉花和茄子的生产造成巨大损失。为了研究大丽轮枝菌的群体遗传变异以及对棉花和茄子的交互致病性,本文对分离自江苏省的63个棉花黄萎菌和10个茄子黄萎菌进行了培养、遗传和致病特性分析。根据菌株在PDA培养基上生长时形成微菌核的多少来划分培养类型,结果菌核型占83.6%,成为主要的培养类型。用PCR技术检测菌株的致病类型、交配型以及是否具有无毒基因Ave1,结果落叶型菌株占86.3%,为优势种群,但是10株茄子黄萎菌100%都是非落叶型菌株;供试的所有江苏菌株交配型都是MAT1-2型,并且都没有无毒基因Ave1。选择江苏省的6个棉花黄萎菌和4个茄子黄萎菌在室内苗期接种棉花和茄子,进行交互致病性测定,结果这10个菌株都可以侵染棉花和茄子,而且来源于不同寄主作物的菌系之间致病力分化明显,表现在不同菌株对同一寄主的致病力不同,同一菌株对不同寄主的致病力也不同。研究结果为深入研究大丽轮枝菌群体遗传结构和制定黄萎病防治措施提供了理论支持。     

多菌灵、三环唑对大丽轮枝菌微菌核、黑色素形成及致病力的影响

 在离体和活体条件下测定了多菌灵、三环唑对大丽轮枝菌的微菌核黑色素形成的影响,以及经2种杀菌剂处理产生的形态变异菌株对棉苗的致病力。结果表明:多菌灵在培养基内含量超过0.1μg/ml时,即可抑制大丽轮枝菌微菌核的形成,随着培养基内多菌灵浓度的增加,微菌核形成时间逐渐延长,形成量逐渐减少;三环唑浓度为0.5μg/ml时,可抑制微菌核的黑色素形成,微菌核从黑色变为浅红至红褐色。三环唑对微菌核黑色素形成呈可逆抑制,变色的微菌核菌落移入不含药的培养基后,大多可恢复形成黑色素。培养基内三环唑浓度的提高,也可抑制大丽轮枝菌微菌核的形成;因2种杀菌剂的抑制而丧失形成微菌核的白色菌丝体移入不含药的培养基,微菌核形成能力也不能恢复。多菌灵和三环唑经棉株吸收后均能抑制植株内大丽轮枝菌微菌核的形成,但对微菌核色素的形成未见有明显影响。2种杀菌剂处理产生的形态变异菌株的致病力与野生型菌株致病力差异不显著。     

大白菜枯萎病病原镰刀菌种类的初步研究

 2014~2016年,由于栽培管理及重茬等原因,大白菜枯萎病在我国大面积发生,造成了巨大的经济损失。为了明确引起大白菜枯萎病的病原菌,本课题组从山东、内蒙古、河北、甘肃等大白菜主产区采集了具有典型枯萎病症状的病样,并对样品中的病原菌进行了分离和鉴定。形态学鉴定结果表明:分离物分别具有尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌 (F. solani) 和木贼镰刀菌 (F. equiseti)的形态学特征。柯赫氏法则验证结果表明:3种病原菌均能使大白菜发病,且发病症状与田间症状一致。此外,基于病原菌的rDNA-ITS和mt SSU序列的测序比对,3种病原菌与尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和木贼镰刀菌的同源性分别达99%~100%,这与形态学鉴定结果相一致。尖孢镰刀菌引起白菜枯萎病为国内首次报道,而茄病镰刀菌和木贼镰刀菌引起白菜枯萎病为国内外首次报道。     

土壤中棉花黄萎病菌快速检测技术研究

 Verticillium wilt,caused by Verticillium dahliae,is the most important disease of cotton.In this work,the previously developed defoliating(D) and nondefoliating(ND) V.dahliae-specific primers were adopted for detection of pathotypes of V.dahliae in soil by using nested PCR.The results showed that the detection assay was efficient when used in infested soil and was an useful technique for rapid and accurate assessment of soil contamination by V.dahliae.     

多元混菌培养对棉花黄萎菌拮抗效果的研究

特基拉芽胞杆菌C-9和鞘氨醇杆菌A1是分离得到的2株对棉花黄萎菌具有较好生防效果的菌株,平板对峙试验测定菌株C-9与A1的抑菌率分别为77.8%和83.3%,根据脂肽类抗生素相关合成基因序列进行PCR扩增,2株生防菌都能检测到surfactin、fengycin和mycosubtilins相关基因片段。通过单因素试验对液体混菌培养体系进行初步筛选,得到对棉花黄萎菌具有较好防效的最佳混菌比例A1：C-9=1：9,在此比例下的混菌培养物对棉花黄萎菌的抑制能力较单菌株A1和C-9提高了131%和36.7%。镜检发现混菌培养物抑制可致黄萎菌菌丝发生膨大畸形。盆栽试验表明,混菌培养物对棉花黄萎病的防治效果可达66.7%,混菌培养物处理的棉花在挑战接种棉花黄萎菌后,棉花体内防御酶系CAT酶活快速响应,在达到峰值时比同时期的CK组增加了135.3%。POD和SOD的基础酶活较CK分别提高22.5%和39.8%,且MDA含量始终低于CK。综合分析表明,混菌发酵可提高菌株对黄萎菌的抑制效果,可通过直接抑制黄萎菌生长和诱导植物产生防御反应来提高对棉花黄萎菌的抗性。