氯氟氰菊酯及其代谢物的人工抗原合成与多克隆抗体的制备

于氟氰菊酯分子的酸部分连接4-氨基丁酸间隔臂(HCA1)、醇部分连接丁二酸酐间隔臂(HCB2),分别合成了两种不同的半抗原,通过碳二亚胺法将HCA1和HCB2分别与牛血清蛋白(BSA)偶联制备了人工抗原HCA1-BSA和HCB2-BSA,通过混合酸酐法将HCA1、HCAS 和HCB2分别与卵清蛋白(OVA)偶联制备包被抗原,两种人工抗原通过免疫新西兰大白兔制备相应的多克隆抗体。结果表明,用HCA1-BSA获得的多克隆抗体对氯氟氰菊酯和氯氟氰菊酸有免疫反应性(IC50值分别为33.12 和0.95 mg/L),用HCB2-BSA获得的多克隆抗体对氯氟氰菊酯几乎没有免疫反应性。     

半抗原的间隔臂长度对免疫识别的影响

分别以2甲4氯和二氯喹啉酸的3种不同间隔臂长度(0、4、6个碳)的包被抗原及相应的3种抗体为研究对象,通过抗体效价的测定及包被抗原与抗体的亲和性正交试验,讨论了半抗原的间隔臂长度对免疫识别的影响。结果表明,两种化合物均以接有4个碳链长度间隔臂的半抗原诱导产生的抗体效价最高;同一抗体更易识别间隔臂较长(6个碳)的抗原;对于同一包被抗原,抗2甲4氯抗体中均以不接臂的半抗原诱导产生的抗体的识别能力最强,而抗二氯喹啉酸中则以接有4个碳长间隔臂的半抗原诱导产生的抗体的识别能力最强,表明抗体的识别能力可能与IgG蛋白的空间构型有关。     

碱解法—液质联用测定小麦中2甲4氯异辛酯及其代谢物2甲4氯

本研究采用QuECHERS及碱解衍生技术，结合高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)建立了测定小麦籽粒和秸秆中的2甲4氯异辛酯和其代谢产物2甲4氯及其共轭物的残留量的检测方法。籽粒和秸秆样品经0.1%甲酸乙腈提取，0.25 mol/L的氢氧化钠溶液碱解，1 mol/L盐酸酸化，上清液经固相萃取剂净化后，HPLC-MS/MS上机检测。结果显示2甲4氯异辛酯在籽粒和秸秆添加浓度0.02～5 mg/kg的范围内，回收率范围为86%～96%,相对标准偏差为2.1%～5.6%,2甲4氯在籽粒和秸秆添加浓度0.02～5 mg/kg的范围内，回收率范围为94%～106%,相对标准偏差范围为3.0%～6.3%,籽粒和秸秆的方法定量限均为0.02 mg/kg。该方法试剂和材料易得，操作过程简单快捷，回收率及精密度满足农药残留分析要求，可用于实际样品的2甲4氯异辛酯、2甲4氯及其共轭物的残留检测，便于2甲4氯异辛酯在小麦的膳食风险评估。     

高效液相色谱-串联质谱法测定小麦中2甲4氯残留

采用高效液相色谱-串联质谱仪(HPLC-MS/MS),建立了麦苗、麦粒、麦秆中2甲4氯的残留分析方法,其前处理方法同样适用于土壤样品中2甲4氯残留的检测(HPLC-UVD检测)。试样采用0.04 mol/L的氢氧化钠溶液振荡提取,用磷酸调节pHm/z 199/141为监测离子对进行检测。二甲4氯在麦苗、麦粒、麦秆基质中的平均回收率在75.0% ~112.1%之间,相对标准偏差在2.7% ~14.8%之间,方法的报告限(LPL)为0.5 mg/kg(麦苗)、0.05 mg/kg(麦粒)和0.5 mg/kg (麦秆)。该方法操作简便,适用于田间小麦样品中2甲4氯残留的检测。     

氨基甲酸-2-氯吡啶-5-甲酯化合物的合成与抑菌活性

以芳香硝基化合物、2-氯-5-吡啶甲醇和一氧化碳为原料,在Pd-Fe/Ti O2催化下进行羰基化反应,合成了11个新型氨基甲酸-2-氯吡啶-5-甲酯化合物,其结构经1H NM R和M S表征。初步抑菌活性测定结果表明:在50 mg/L下,大多数目标化合物对4种供试病原菌具有一定的抑制活性,其中化合物3f(4-甲氧基苯基氨基甲酸-2-氯吡啶-5-甲酯、3h(2,4-二氯苯基氨基甲酸-2-氯吡啶-5-甲酯)和3j(3,4-二氯苯基氨基甲酸-2-氯吡啶-5-甲酯)对小麦赤霉病菌Gibberella zeae的抑制率达77.3%以上,3f对苹果轮纹病菌Physalospora piricola的抑制率达82.5%,与对照药多菌灵接近;所有化合物在50 mg/L下对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea的抑制活性均优于对照药多菌灵。     

稻田除草剂水体残留对水生植物大薸的影响

采用模拟方法研究了稻田3种常用除草剂丁草胺、苄嘧磺隆、2甲4氯钠残留水体对大薸生长的影响。结果显示:(1)3种除草剂水体残留对大薸植株形态影响以苄嘧磺隆处理最为明显,残留浓度大于0.01 mg/L可导致大薸植株大量死亡。4.25 mg/L的丁草胺和3.36 mg/L的2甲4氯钠残留对大薸的生长均有一定的抑制作用,但短期内不能致死。当水体除草剂残留降低至田间常规管理施用浓度的1/8时,即丁草胺0.53 mg/L、苄嘧磺隆0.01 mg/L、2甲4氯钠0.42 mg/L,大薸植株形态的药害影响已经明显减轻。(2)苄嘧磺隆水体残留大于0.01 mg/L时大薸干物质产量显著降低,分株生长受到严重抑制。丁草胺残留浓度为0.53 mg/L时促进大薸干物质积累和分株生长,当残留浓度大于1.06 mg/L时大薸干物质积累和分株生长受到抑制。2甲4氯钠残留浓度低于3.36 mg/L对大薸的干物质产量、分株数及植株含水率影响一般。     

氯苯醚酰胺(Y13149)生物活性初步研究及水稻纹枯病菌对其敏感性基线的建立

氯苯醚酰胺[N-(2-(2,4-二氯苯氧基)苯基)-3-(二氟甲基)-1-甲基-1H-吡唑-4-酰胺，Y13149]是由华中师范大学基于药效团连接碎片虚拟筛选策略(PFVS)快速发现的新型琥珀酸脱氢酶抑制剂类(SDHIs)化合物。采用菌丝生长速率法，测定了该创制化合物的农药生物活性。结果表明:氯苯醚酰胺对真菌具有较广的抗菌谱，对供试10种植物病原真菌均具有较好的抑制活性，EC50值在0.008~15.25 mg/L之间，其对立枯丝核菌的抑制活性最强，但对辣椒疫霉和链状腐霉活性较弱。田间试验表明，氯苯醚酰胺对水稻纹枯病具有较好的防治效果，有效剂量75 g/hm2时的平均防效为79.6%，其防效总体略好于噻呋酰胺(75 g/hm2的平均防效为77.3%)。此外，氯苯醚酰胺对采自浙江和江苏两省的125株水稻纹枯病菌的EC50值分布在0.002~0.259 mg/L之间，且呈近似正态单峰曲线，平均EC50值为(0.021 ±0.008) mg/L，因此可将其作为水稻纹枯病菌对氯苯醚酰胺的敏感性基线，用于田间抗药性监测。     

溴氰菊酯酶联免疫吸附分析方法研究

建立了定量测定溴氰菊酯间接竞争酶联免疫吸附分析方法(ic-ELISA)。合成了半抗原1-羧基-(3'-苯氧基苯基)甲基-3-(2',2'-二溴乙烯基)-2,2-二甲基环丙基羧酸酯(Med)和N-2-(羧基丙基)氨基甲酰基-(3'-苯氧基苯基)甲基-3-(2',2'-二溴乙烯基)-2,2-二甲基环丙基羧酸酯(Di)。分别采用碳二亚胺法和混合酸酐法将半抗原与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备了免疫原Di-BSA和包被原Di-OVA、Med-OVA。将制得的溴氰菊酯免疫原免疫动物获得多克隆抗体,经间接非竞争ELISA法测得其效价为2.5×105。通过对甲醇含量、离子强度、pH值等影响因素进行异源分析条件的优化,确立了溴氰菊酯间接竞争酶联免疫分析方法的最佳检测条件(30%甲醇、氯化钠0.4 mol/L、pH 7.5),并建立了标准竞争曲线。该方法的IC50值为0.55±0.05 mg/L,检测限(IC10)为3.76±0.35 μg/L,对大多数拟除虫菊酯无交叉反应。分别在自来水、河水和土壤样品中添加0.05 ~5.0 mg/L(或mg/kg)的溴氰菊酯,回收率分别为89.7% ~106.8%、82.4% ~101.7%、75.6% ~97.8%。     

同源与异源分析对ELISA检测灵敏度和特异性的影响

以获得的抗2甲4氯抗体及其包被抗原为研究对象,比较了同源和异源分析的灵敏度和特异性,并试图进一步揭示抗体的识别机制。结果表明:异源分析,特别是半抗原结构异源可大幅度提高检测灵敏度;同源分析和异源分析对于类似化合物的特异性无明显差异。     

含苯丙氨酸和1H-茚-1-酮类氯虫苯甲酰胺类似物的合成及杀虫活性

为了开发新的杀虫化合物，以氯虫苯甲酰胺为先导，2-甲基-3-氨基苯甲酸为起始原料，经过卤化生成5-氯-3-甲基-2-氨基苯甲酸；再与3-溴-1-(3-氯吡啶-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酸进行缩合反应，生成6-氯-2-(3-溴-1-(3-氯吡啶-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-基)-8-甲基-4H-3,1-苯并噁嗪-4-酮；最后引入苯丙氨酸片段并经环化反应，分别合成了两个系列共计23 个新化合物( 4 和 5 )，其中化合物 4 为含苯丙氨酸的氯虫苯甲酰胺类似物，化合物 5 为由化合物4环化生成的含1H-茚-1-酮片段的氯虫苯甲酰胺类似物，所有化合物的结构均通过核磁共振氢谱(1H NMR)、碳谱(13C NMR)和高分辨质谱(HRMS)的表征及确证。初步室内杀虫活性测试结果表明，多数目标化合物对黏虫Mythinma separata具有较高的杀虫活性，其中14个化合物在100 mg/L下对黏虫Mythinma separata的致死率为100%，化合物 5k ( 1H-茚-1-酮片段中取代基为羟基 ) 在4和0.8 mg/L下的致死率分别为90%和70%，其LC₅₀值为0.55 mg/L。分子对接结果表明，化合物 5k 与氯虫苯甲酰胺一样，也是作用于鱼尼汀受体(RyR)，但与靶标结合的氨基酸残基不同，这种差异可能对黏虫的抗药性治理研究有益。     

固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法检测稻田中硝磺草酮和2甲4氯钠残留

建立了一种同步检测稻田中硝磺草酮和2甲4氯残留的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱（SPE-LC-MS/MS）分析方法。样品经乙酸乙酯提取后，用PSA吸附、C₁₈固相萃取小柱净化，C₁₈色谱柱分离，0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇溶液为流动相，梯度洗脱分离，在电喷雾ESI离子源正、负离子模式下，采用质谱多反应监测（MRM）模式定性分析。结果表明:硝磺草酮和2甲4氯的检出限（LOD）分别为0.005和0.025 ng，定量限（LOQ）分别为0.01和0.05 mg/L。在0.001~2 mg/L和0.005~5 mg/L范围内，硝磺草酮和2甲4氯的质量浓度与对应的峰面积间呈良好的线性关系，其相关系数均大于0.999 7。在0.01~2 mg/L添加水平下，硝磺草酮在田水、土壤、植株、稻壳和糙米中的平均回收率为75%~103%，相对标准偏差（RSD）为0.1%~8.2%；在0.05~10 mg/L添加水平下，2甲4氯在田水、土壤、植株、稻壳和糙米中的平均回收率为90%~113%，RSD为0.5%~7.4%。说明该方法高效、快捷、精确度高，能够满足硝磺草酮和2甲4氯钠在稻田中的残留量检测分析要求。     

甲萘威酶联免疫吸附分析技术研究

合成了两种不同结构的甲萘威半抗原并与载体蛋白质共价偶联制备人工抗原。以人工抗原免疫动物获得对甲萘威具特异性的高效价抗体 ,建立并优化了痕量甲萘威的竞争性酶联免疫吸附测定法。该法测定甲萘威的线性浓度范围为 10 1～ 10 -4 μg/ml,检测限低于 0 .0 1ng/ml。其他结构类似的氨基甲酸酯类杀虫剂对甲萘威的分析无干扰。     

乙草胺人工抗原的合成及其单克隆抗体的制备

通过乙草胺与3-巯基丙酸在碱性条件下反应合成了半抗原——乙草胺-巯基丙酸(AMPA)。采用活性酯法将半抗原AMPA分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备了人工抗原。通过紫外光谱测定了AMPA与BSA及OVA间的分子结合比分别为41和26。用AMPA-BSA免疫小鼠,制备得到的单克隆抗体的效价为1∶ 16×104。以AMPA-OVA作包被抗原,用乙草胺单克隆抗体建立了ELISA检测方法,IC50值为0.55 μg/L,方法的检测范围为0.04~5 μg/L,检测限为0.04 μg/L。     

高效液相色谱法测定二甲四氯在铁铝土中的吸附特征

二甲四氯 (MCPA) 是铁铝土区域广泛使用的一种除草剂，生物毒性大。吸附是控制MCPA在土壤中迁移/转化的关键过程。本研究建立了以C₁₈为色谱柱、V(甲醇):V[水 (乙酸调pH值至2.5)] = 80 : 20为流动相、PDA为检测器 (检测波长280 nm) 的MCPA高效液相色谱检测方法，并结合批量平衡法评估MCPA在铁铝土中的吸附特征。结果表明:在0.5~40 mg/L内，MCPA的质量浓度与对应的峰面积间呈良好线性关系 (R2 = 0.999 9)，检出限为0.2 mg/L，定量限为0.5 mg/L；回收率为98%~103%，相对标准偏差为3.5%~4.0%，适用于MCPA吸附试验的测定。铁铝土对MCPA的等温吸附过程符合Freundlich模型，吸附自由能△G<0，|△G|为9.34~14.73 kJ/mol，是一个自发的、非均质的、多层的物理吸附过程。吸附常数K_f值在0.85~4.24 L/kg之间，属于难吸附污染物，对地下水具有环境风险。不同铁铝土对MCPA的吸附作用受土壤pH值、有机质、矿物影响，表现为水稻土>暗红湿润铁铝土>简育湿润铁铝土。氢键结合、偶极间作用是吸附发生的关键作用力。     

肟菌酯在斑马鱼中的生物富集效应研究

采用PRiME HLB固相萃取结合超高效液相色谱-串联质谱仪,建立了斑马鱼中肟菌酯残留的检测方法,并在此基础上研究了肟菌酯在斑马鱼中的生物富集效应。结果表明:在0.0001~0.05 mg/L范围内,肟菌酯进样质量浓度与峰面积之间具有良好的线性关系;当添加水平分别为0.0005和0.05 mg/L时,肟菌酯在水样中的平均回收率为86.6%~106%,相对标准偏差 (RSD)为5.1%~8.9%;添加水平分别为0.01、0.1和10 mg/kg时,其在鱼肉中的平均回收率为70.5%~104%,RSD为1.4%~3.3%。肟菌酯在水样中的定量限 (LOQ)为0.0005 mg/L,在鱼肉中的LOQ为0.01 mg/kg。利用所建立的方法,研究了在水生生物鱼类的1/10急性毒性基准剂量 (ALB) 值 (7.15 × 10?4 mg/L) 和ALB 值 (7.15 × 10?3 mg/L)、斑马鱼的1/100 LC₅₀值 ( 5.10 × 10?4 和1.20 × 10?3 mg/L)以及1/10 LC₅₀值 (5.10 × 10?3和1.20 × 10?2 mg/L)剂量暴露下,肟菌酯在斑马鱼中的生物富集效应。结果表明:经不同浓度肟菌酯连续暴露192 h后,肟菌酯在斑马鱼中的生物富集系数 (BCF)为113~178,具有中等生物富集效应。研究表明,生产中在使用肟菌酯时,应考虑其低浓度暴露下因生物富集作用而对水生生物引起的生态毒理学风险。     

嘧草醚在水稻及其环境中的残留

采用改良的QuEChERS-高效液相色谱-质谱 (HPLC-MS) 技术，建立了嘧草醚在水稻及其环境中残留量的检测方法。样品经V (乙腈) : V (甲酸) = 199 : 1的混合溶液提取，由十八烷基键合硅胶 (C₁₈) 或C₁₈ + 丙基乙二胺 (PSA) 吸附剂净化。以V (乙腈) : V (0.1%甲酸水溶液) = 70 : 30的混合溶液为流动相，经ZORBAX Eclipse XDB-C₁₈色谱柱分离，采用电喷雾正离子 (ESI+) 模式扫描，HPLC-MS检测，外标法定量。结果表明:在0.01~1 mg/L范围内嘧草醚的峰面积与其质量浓度间线性关系良好，在乙腈、稻田水、土壤、稻株、糙米和稻壳中的相关系数均大于0.99。嘧草醚在稻田水中的检出限 (LOD) 为0.0015 mg/L，定量限 (LOQ) 为0.005 mg/L，在土壤、糙米、稻壳和稻株中的LOD分别为0.003、0.015、0.015 和0.003 mg/kg，LOQ分别为0.01、0.05、0.05 和0.01 mg/kg。在0.005、0.01和0.1 mg/L (或mg/kg) 添加水平下，嘧草醚在稻田水、土壤和糙米中的平均回收率分别为95~109%、92%~106%和89%~107%，相对标准偏差 (RSD) 分别为3.0%~5.0%、1.1%~2.9%和3.1%~3.7%；在稻壳和稻株中的平均回收率分别为95%~102%和93%~107%，RSD分别为1.1%~3.8%和3.5%~9.9%。该方法灵敏度、精密度和准确度均符合农药残留分析要求。