苹果树腐烂病内生拮抗放线菌A-2的鉴定及其活性评价

以苹果树腐烂病菌Valsa mali为靶标菌,从健康苹果树枝条中获得一株高效内生放线菌A-2。采用生长速率法、对峙培养法和玻片法测定了菌株A-2的抑菌谱及对苹果树腐烂病菌菌丝生长和孢子萌发的影响;利用离体枝条烫伤接种法测定了菌株A-2对腐烂病的防治效果。结果表明:A-2发酵滤液对腐烂病菌的抑制率达90%以上,对其他9种常见的植物病原真菌也具有良好的拮抗作用;菌株A-2可导致腐烂病菌菌丝畸形、分支增多和局部膨大;不同稀释倍数的A-2发酵滤液对苹果离体枝条腐烂病均有明显的防效,接种病原菌前后24 h和同时施用500倍发酵滤液的防效均达70%以上。根据培养特征、生理生化特性和16S rDNA 序列分析,将菌株A-2鉴定为卡伍尔链霉菌Streptomyces cavourensis。     

苹果树腐烂病拮抗细菌菌株BJ1的鉴定及其抑菌作用

为开发对苹果树腐烂病有效的生防措施,对从山东栖霞苹果果园根际土壤中分离的63株细菌进行了筛选,获得有显著拮抗作用的菌株BJ1。采用玻片法和对峙培养法测定BJ1对苹果树腐烂病菌孢子萌发和菌丝生长的抑制作用及其抑菌谱,根据菌株BJ1的形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列对其进行鉴定,并用离体枝条烫伤接种法对腐烂病的防效进行测定。菌株BJ1对腐烂病菌的抑制率为78.38%,其发酵滤液的抑菌率达到70.54%;BJ1可显著降低腐烂病菌分生孢子的萌发率,致使菌丝畸形、分支增多及细胞质外渗;该菌株对常见的8株果树病原真菌具有显著的拮抗作用。经鉴定,菌株BJ1属于微嗜酸寡氧单胞菌Stenotrophomonas acidaminiphila。BJ1不同稀释倍数的发酵滤液均对苹果树腐烂病有明显的抑制作用,其稀释50倍发酵滤液的防效仍可达81.06%,表明该菌株具有良好的生防潜力。     

10种化学杀菌剂对苹果树腐烂病的防效评价

本试验通过采用抑制菌丝生长、促进伤口愈合以及在离体枝条上的保护和治疗试验,对市售的10种化学药剂进行了防治苹果树腐烂病效果的评价.这些药剂分别为甲硫·萘乙酸、腐植酸·铜、菌毒清、丙环唑、代森铵、丁香菌酯、噻霉酮、辛菌胺·醋酸盐、甲基硫菌灵(山西北方种业)和甲基硫菌灵(日本曹达).试验结果表明,不同的测试方法得到不同的排序.在抑菌试验中,抑菌作用最强的药剂是甲基硫菌灵(山西北方种业)和腐植酸·铜,抑菌带均为5.00 cm,其次为菌毒清、丙环唑和甲硫·萘乙酸.在伤口愈合试验中,甲基硫菌灵(日本曹达)和甲硫·萘乙酸对伤口的愈合作用最好,其愈伤组织宽度分别比对照宽2.00 mm和0.92 mm.在离体枝条保护作用试验中,甲硫·蕃乙酸、腐植酸·铜、甲基硫菌灵(日本曹达)处理均未发病.在离体枝条治疗作用试验中,甲硫·萘乙酸、菌毒清、代森铵、甲基硫菌灵(山西北方种业)、腐植酸·铜的病斑平均扩展面积均小于50 mm2,其中甲硫·萘乙酸和菌毒清的防效均为87.5％,病斑面积仅为对照的1.6％和2.2％.综合排序和分析认为,甲硫·萘乙酸是治疗腐烂病效果最好的药剂.     

七株植物内生放线菌对苹果树腐烂病的防治作用

通过分生孢子萌发试验、菌丝抑制试验、接种离体枝条试验及田间病斑涂抹药剂防治试验,研究了7株植物内生放线菌对苹果树腐烂病的防治效果。结果表明,7株植物内生放线菌无菌发酵滤液对病原菌分生孢子萌发及菌丝生长均有明显的抑制作用,2倍稀释液对孢子萌发抑制率均达85%以上,20倍稀释液对菌丝生长抑制率均达80%以上。显微观察发现,Hhs.015 (BAR1-5)菌株无菌发酵滤液可导致病菌芽管、菌丝畸形。在人工接种条件下,无菌发酵滤液原液对离体枝条病斑扩展具有明显的抑制作用,其中AR1-14、Hhs.015 (BAR1-5)和TGYXCSA-7处理5天后防治效果分别达83.2%、69.7%和85.6%。田间刮除病斑后涂抹放线菌发酵原液也可明显抑制病斑复发,防效均达80%以上。     

农抗120对苹果树腐烂病菌的作用研究

试验表明:农抗120单用,和农抗120加助剂B,对苹果树腐烂病菌菌丝的生长,均有明显的抑制作用。最小抑菌浓度为250μg/ml和125μg/ml;最小杀菌浓度为2000μg/ml和1000μg/ml。其杀菌作用机理是使病菌体的原生质凝集,小分子物质外流,形成大量空泡,菌体重量剧减。病菌在该浓度中浸泡12小时后便失去致病力。涂药试验:先刮除病斑,再用农抗120 1000μg/ml或农抗120加助剂B500μg/ml涂抹处理,16天后复发率仍为零,不刮除病斑,只用刀划刻病枝再涂药液,4天后病斑又继续扩展。     

黄腐酸处理对苹果树腐烂病菌的抑制作用及对苹果树防御酶活性的影响

黄腐酸作为一种广谱性植物生长调节剂,具有稳定可靠的抗逆增产效果。本试验以黄腐酸为生长调节剂,研究其对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的抑制作用及对苹果树皮抗腐烂病的影响。试验结果表明,黄腐酸能抑制苹果树腐烂病菌菌丝的生长,浓度越大抑制效果越明显。经黄腐酸处理后,苹果树腐烂病组织中SOD、POD、PAL和CAT均呈现先升高后降低的趋势。其中黄腐酸处理后SOD活性于14d达到峰值,而其他酶活性均在21d达到最大值。说明黄腐酸能显著提高苹果树体内相关防御酶系的活性,很大程度上提高了植物的免疫力,即增强了苹果树的抗病性。     

马铃薯干腐病菌拮抗放线菌JY-22的抑菌作用及菌株鉴定

为了进一步明确拮抗放线菌JY-22对马铃薯干腐病的生防潜力,采用生长速率法和孢子萌发法测定了JY-22无菌发酵液(JY-22SFB)对马铃薯干腐病菌的抑菌作用及抑菌活性稳定性。JY-22SFB原液对马铃薯干腐病菌菌丝生长和孢子萌发均有很强的抑制作用,抑制率分别为74.5%和100%,其中对孢子萌发的抑制效果与浓度为30 mg/mL的化学药剂50%多菌灵相当。JY-22SFB处理后马铃薯干腐病菌菌丝生长畸形、易断裂。JY-22SFB对热处理和紫外线照射处理具有很好的稳定性,水浴80℃处理3 h和紫外线照射30 min对其抑菌活性没有影响。JY-22SFB浸泡处理可明显降低马铃薯干腐病菌的致病性。通过形态和分子鉴定,确定该菌属链霉菌属吸水链霉菌Streptomy-ces hygroscopicus。研究表明菌株JY-22在马铃薯干腐病生物防治中具有潜在的利用价值。     

苹果树腐烂病菌异柠檬酸裂解酶基因VmICL的功能分析

由黑腐皮壳菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)引起的苹果树腐烂病严重影响了苹果树的健康生长。异柠檬酸裂解酶是真菌乙醛酸循环中的关键酶,异柠檬酸裂解酶基因(ICL)在真菌生长发育及致病过程中发挥重要作用。本研究在苹果树腐烂病菌基因VmICL生物信息学分析的基础上,应用PEG介导原生质体转化法获得了基因VmICL的敲除突变体及回补菌株,解析了VmICL对病菌生长发育、细胞壁完整性、渗透胁迫、碳氮源利用及致病力的影响。研究表明,基因VmICL位于9号染色体,VmICL蛋白在第23-545位氨基酸区域具TIM super family结构域,系统发育分析显示与水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)亲缘关系最近。基因VmICL缺失突变体生长速率减慢,分生孢子器产生数量减少,分生孢子萌发延迟;基因VmICL参与维持细胞壁的完整性,但不参与渗透胁迫;基因VmICL正调控碳源吸收,负调控氮源吸收,正调控致病力。总之,基因VmICL参与调控苹果树腐烂病菌的生长发育、细胞壁完整性的维持、碳氮源利用及致病力的发挥。     

姜瘟病菌拮抗放线菌的筛选与鉴定

 从山东各地区姜田随机采集土样30份,利用稀释分离法分离到放线菌菌株621株。采用琼脂移块法测定这些菌株对姜瘟病菌(Ralstonia solanacearum)的拈抗作用,共筛选出具有拮抗作用的放线菌菌株53株。选择抑菌活性最强的菌株Y7进行进一步研究。菌株Y7孢子丝顶端呈小螺旋形或钩状,孢子椭圆形至圆柱形。在5种供试培养基中,菌株Y7只在燕麦培养基上产生黄色色素。该菌株能利用麦芽糖、葡萄糖、果糖、L(+)树胶醛糖、半乳糖和山梨糖,不能利用蔗糖、木糖、肌醇、纤维二糖和山梨醇。形态特征、生理生化特征和16SrDNA序列分析结果表明,Y7为淡紫灰链霉菌(Streptomycetes lavendulae)。正交实验结果表明其最佳发酵条件是小米培养基pH7.0,28℃,培养14d。     

地肤子提取物对苹果树腐烂病菌的抑制作用及对其菌体结构和功能的影响

为开发新型安全高效的植物源苹果树腐烂病防治剂,采用菌丝生长速率法测定中草药地肤子乙醇提取物及各层析流分L1～L9对苹果树腐烂病菌Valsa mali的抑制作用,同时通过室内常规分析方法观测流分L7对该菌菌丝形态结构、细胞膜通透性及物质吸收和代谢的影响。结果表明,地肤子乙醇粗提物浓度为2 mg/mL时对苹果树腐烂病菌具有较强的离体抑制活性,处理后96 h的抑菌率达到92.16%。分别用石油醚、氯仿、正丁醇萃取醇提物,石油醚萃取物对苹果树腐烂病菌的抑制效果最为明显,其EC_(50)为0.07 mg/mL;在石油醚萃取物通过硅胶柱层析分离得到的9种流分中,流分L7对苹果树腐烂病菌的抑制作用显著,离体抑菌率高达96.73%;且在流分L7处理下,病菌菌丝体出现肿胀、膨大或畸形等现象,细胞膜通透性增大,可溶性蛋白、还原糖以及丙酮酸的含量随流分L7浓度的升高而持续降低,当浓度为100μg/mL时,菌丝体可溶性蛋白、还原糖及丙酮酸的含量分别降低70.78%、71.74%和78.68%。表明在离体培养条件下地肤子乙醇提取物能明显抑制苹果树腐烂病菌的生长,并对菌丝体细胞膜结构和功能稳定性产生显著影响,具有进一步开发为新型植物源苹果树腐烂病防治剂的潜力。     

苹果树腐烂病菌染色质重塑因子Vmles4的功能研究

染色质重塑因子INO80是一类由多亚基构成的遗传学调控因子,调控多种DNA代谢,在基因的表达中发挥着重要的调控功能。但其在苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中是否存在及其生物学功能并不清楚,为此,本研究从病菌基因组中分析鉴定到INO80的一个亚基基因Vmles4,利用qRT-PCR技术分析了Vmles4在病菌侵染过程中的表达模式,利用Double-joint PCR技术和PEG介导的原生质体转化方法进行了基因敲除,然后对3个突变体的营养生长及致病力进行测定和分析,并对病菌的非核糖体肽合成酶基因VmNRPS12及VmNRPS14在突变体中的表达进行定量分析。结果表明：Vmles4在侵染初期的表达显著上调,接种后6 h上调表达6.2倍。敲除突变体的生长速率平均降低28%且菌丝生长稀疏,在富士苹果品种（Malus domestic cv. Fuji）叶片和枝条上的致病力分别降低到22.5%和27.5%,VmNRPS12及VmNRPS14基因在Vmles4突变体侵染苹果枝条24 h后的表达量分别下调86.5%和50%;综上所述,Vmles4正调控腐烂病菌的营养生长、致病力以及次级代谢合成酶基因VmNRPS12和VmNRPS14的表达。     

温度对梨树腐烂病菌生长、病斑扩展及产毒素水平的影响

为探明温度对梨树腐烂病菌生长、病斑扩展及产毒素水平的影响,采用常规生物学方法和高效液相色谱法,测定了该病菌强致病力菌株LXS240101在不同温度下的菌丝生长、病斑扩展及产毒素水平。结果表明:菌株LXS240101最适宜的生长温度为25~30℃;在5~35℃范围内,梨树离体枝条接种梨树腐烂病菌后均能发病并导致病斑扩展,25℃时病斑扩展速度最快,面积达4.45cm2,5℃和35℃时病斑扩展速度缓慢,面积不足0.3 cm2。该菌株在梨树树皮培养基中最适宜的产毒素温度为20℃,10~25℃条件下可产生5种毒素,而在其它温度下仅产生3~4种;接种该菌株的梨树离体枝条5℃条件下未检测到间苯三酚和对羟基苯甲酸,且毒素总量最低,其余温度下均可检测到5种毒素,最适宜的产毒素温度为10℃,毒素总量可达224.14μg/g干组织。     

苹果树腐烂病菌VmMFS1~VmMFS3基因的功能分析

为绿色持久防控苹果树腐烂病,该研究分析苹果树腐烂病菌Valsa mali的3个主要协同转运蛋白超家族（major facilitator superfamily,MFS）编码基因的氨基酸序列特征,利用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,RT-qPCR）技术分析这3个基因在苹果树腐烂病菌侵染阶段的表达水平,通过构建这3个基因的缺失突变体和回补菌株分析其在病原菌营养生长、致病力和非生物胁迫应答等方面的功能。结果表明,这3个基因的氨基酸序列均具有MFS保守结构域,将其命名为VmMFS1~VmMFS3; VmMFS1和VmMFS2的进化距离较近,均与VmMFS3的进化距离较远;在苹果树腐烂病菌侵染过程中VmMFS1~VmMFS3基因表达均显著上调;与野生型03-8菌株相比,VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的菌落形态无明显差异,但生长速度下降; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体的致病力均显著降低; VmMFS1~VmMFS3基因缺失突变体对H₂O₂胁迫的敏感性无明显变化,但对NaCl胁迫更敏感;基因回补后基因缺失突变体的表型缺陷能恢复到野生型菌株的水平。     

人参病原菌拮抗细菌的分离筛选与鉴定

为明确土壤拮抗细菌对人参常见病原菌的生防价值,从吉林省抚松县人参根际土壤中分离、纯化获得113株细菌,采用平板对峙法测定菌株的拮抗能力,通过温室盆栽试验研究其在土壤及人参根部的定殖规律,并通过形态、培养特征及16S r DNA序列分析进行分类鉴定。对峙试验结果表明,2株细菌对供试人参病原菌具有良好的拮抗广谱性,且多次验证其抑菌效果稳定。定殖研究结果表明,活性菌株SZ-56与SZ-60的定殖能力均达到显著水平,在土壤中的最大定殖菌量分别为每克土7.51×106CFU和7.28×106CFU,30 d后定殖菌量仍保持在105CFU;21 d后在人参根部的定殖菌量仍保持在每克根105CFU水平。根据形态、培养特征、生理生化指标和16S r DNA序列分析,确定SZ-56为内生芽胞杆菌Bacillus endophyticus,SZ-60为解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens。     

梨和苹果腐烂病菌不同培养表型菌株的致病性分析

The pathogenicity of three strains (F-SD-8, F-BJ-2c-2 and F-HN-2a-1) of Valsa mali var. pyri causing pear canker and one strain (F-SX-A6) of V. mali var. mali causing apple canker in China were comparatively tested by wound inoculation on in vitro twigs of pear, apple and some other woody plants, and in vivo twigs of pear. Significant pathogenicity differentiation was detected in V. mali var. pyri. Generally strains F-SD-8 and F-BJ-2c-2 were highly pathogenic on pear although their culturing characteristics differed greatly. The strain F-SX-A6 was more aggressive on apple than on pear, and the strain F-HN-2a-1 showed significant lower pathogenicity on ten pear cultivars and other seven species of woody plants. Our results confirmed that two variants of V. mali had host preference and were also aggressive to crabapple, apricot, and peach besides apple and pear. Meanwhile, strains F-SD-8 and F-BJ-2c-2 could induce the formation of pycnidia on in vivo twigs of pear, which was not observed on in vivo twigs inoculated with F-HN-2a-1 and F-SX-A6.     

小麦全蚀病菌拮抗细菌的筛选及生防效果

为筛选小麦全蚀病菌Gaeumannomyces tritici的拮抗细菌,从健康小麦根际土壤中分离和筛选拮抗细菌,采用对峙培养法和室内盆栽试验测定拮抗细菌对小麦全蚀病菌的抑制活性及生防效果,通过形态学特征观察、生理生化特性测定和保守序列分析确定其分类地位。结果表明,从小麦根际土壤中分离并筛选获得2株具有较好拮抗效果的菌株XJ-3和XJ-4,对小麦全蚀病菌菌丝生长的抑制率分别为64.31%和65.25%。基于菌株XJ-3和XJ-4的形态学特征、生理生化特性和gyrB基因系统进化分析结果,将其均鉴定为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。菌株XJ-3和XJ-4的发酵液中均含有一类具抗真菌活性、耐热性的非蛋白类次生代谢产物;经菌株XJ-3和XJ-4发酵液处理小麦幼苗后,株高较对照分别显著增加了6.48%和13.12%,干重较对照分别增加了1.30%和14.29%,其中菌株XJ-4的促生效果相对较好;对小麦全蚀病的盆栽防效分别达到51.29%和52.46%。表明筛选得到的贝莱斯芽胞杆菌XJ-3和XJ-4可用于小麦全蚀病的生物防治,具有开发为生防制剂的潜力。     

黄瓜棒孢叶斑病拮抗细菌的筛选、鉴定及防治效果

为开发防治黄瓜棒孢叶斑病的生防资源,从辽宁省、山东省、河北省该病害发生严重的田块根际土壤中分离和筛选生防菌株,测定所得菌株对黄瓜棒孢叶斑病菌Corynespora cassiicola的抑制活性,通过离体叶片试验、盆栽试验和田间试验,测定其防效,并利用形态学和分子生物学方法对其进行鉴定。结果显示,从30份根际土壤样品中共分离出细菌263株,对黄瓜棒孢叶斑病菌平板抑制率大于60.04%的菌株有10株,其中菌株ZF57的效果最好,抑制率为64.85%;菌株ZF57对其它7种植物病菌也有较好的抑制效果;菌株ZF57对黄瓜棒孢叶斑病的离体叶片防治效果、盆栽防治效果和田间防治效果分别达到66.67%、58.73%和62.13%,与对照药剂氟吡菌酰胺的防治效果相当;经形态学和分子生物学鉴定,菌株ZF57为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。     

采用环介导等温扩增法(LAMP)快速检测苹果根结线虫

为高效、简便、快速地对我国进境植物检疫性有害生物名录中的非中国种—苹果根结线虫Meloidogyne mali进行检疫,通过比较Gen Bank中根结线虫相关序列,以苹果根结线虫28S r DNA非保守区域序列设计环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)的特异性引物,并优化反应条件,建立一种可快速检测苹果根结线虫的LAMP检测体系。结果显示:d NTPs浓度为0.4 mmol/L、Mg~(2+)浓度为5.0 mmol/L、不添加甜菜碱、反应时间为60 min时,LAMP检测体系扩增效率最高;用琼脂糖凝胶电泳、SYBR Green I染色和LFD试纸均能检测到苹果根结线虫的扩增产物。所建立的LAMP检测体系能够从10种供试植物线虫种群中特异性地检测出苹果根结线虫,灵敏度为1/20 000条线虫DNA,比常规PCR灵敏度高10倍。表明所建立的苹果根结线虫LAMP快速检测体系可用于我国口岸进境植物中苹果根结线虫检疫。