转录因子FoSwi6调控香蕉枯萎病菌的生理特性和致病性

 香蕉枯萎病菌 (Fusarium oxysporum f. sp. cubense) 是威胁香蕉生产的重要土传病原真菌。为了解析该病原菌的致病机理和探索新的防治途径,本研究利用同源重组的方法获得了转录因子FoSwi6的敲除突变体菌株,与野生种菌株相比,敲除突变体菌株 ΔFoSwi6表现为生长缓慢、气生菌丝显著减少且部分菌丝膨大畸形、产孢量降低、对H₂O₂过敏感、镰刀菌酸合成相关基因FoFUB4的表达量下调及致病性减弱。由此表明, FoSwi6 参与调控香蕉枯萎病菌的生理特性和致病性。     

拮抗内生芽孢杆菌BEB17分离鉴定及其挥发性物质抑菌活性分析

 项目组从健康香蕉植株根部中分离得到一株对多种植物病原真菌具有抑菌活性的内生细菌。结合形态特征观察、生理生化分析及分子鉴定,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),命名为BEB17。双皿对峙实验结果表明,该菌株产生的挥发性有机物(Volatile organic compounds, VOCs)可抑制多种病原真菌生长,其中对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4,Foc4)抑制效果最强,抑制率达66.86%±0.90%,并能抑制其孢子萌发。用BEB17产生的挥发性物质做熏蒸处理后,Foc4菌丝发生缢缩膨大,细胞膜被破坏。采用顶空法固相微萃取结合气质联用(HS-SPME-GC-MS)对BEB17产生的挥发性有机物(VOCs)进行收集鉴定,得到10类33种单体有机物组分。     

拟康宁木霉Tk1的分离鉴定、拮抗作用及其生物学特性

为了分离利用高效植物病害生物防治菌株，从广东药用植物金丝皇菊根部分离获得一株木霉菌株Tk1。经过形态观察、rDNA-ITS和EF-1α序列分析明确其为拟康宁木霉Trichoderma koningiopsis。用平板对峙培养法测定，该菌株对金丝皇菊枯萎病菌（尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum）和柑橘炭疽病菌（胶胞炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides）的抑制率分别为68.5%和77.1%，且在后期能完全覆盖或部分覆盖病原真菌。其无菌发酵液对金丝皇菊枯萎病菌的抑制率为45.55%。该菌株营养生长和产孢的最适碳源分别为乳糖和葡萄糖，最适氮源是酵母膏；在pH 4~11的培养基上均可生长、产孢，最适pH为7；12 h交替光照条件下菌丝的生长速度最快，全光照条件下产孢数量最大；该菌株的致死温度为73℃处理10 min。     

贝莱斯芽胞杆菌HN-2的鉴定及对杧果炭疽菌的抑菌活性研究

菌株HN-2为本实验室分离得到的一株生防细菌，通过采用形态学观察结合现代分子生物学的手段鉴定生防菌HN-2为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis，以杧果炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides Penz作为靶标，其发酵上清液的正丁醇萃取粗提物的活性最好，抑菌圈大小为20.93 mm，半最大效应浓度（EC₅₀）为70.62 μg/mL。通过飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）数据结合基因检测的结果分析发现，正丁醇提取物中主要活性成分为脂肽类物质，其中含有表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturins）和泛革素（fengycin）等。通过显微观察发现正丁醇粗提物可以造成杧果炭疽病菌菌丝扭曲、膨大、畸形，从而抑制杧果炭疽病菌的生长，菌株HN-2正丁醇提取物处理后的杧果15 d内未出现杧果炭疽病病状，对杧果果实具有较好的保护作用。贝莱斯芽胞杆菌HN-2的主要活性物质为脂肽类物质，其对植物病原真菌有较好的防治效果，具有进一步深入研究和开发应用的潜力。     

黄瓜枯萎病菌拮抗菌的筛选、鉴定和防效测定

为获得对黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum（FOC）具有拮抗作用的生防菌株,采用稀释涂布平板和平板生长对峙法从健康黄瓜根际土壤中分离、筛选对FOC具有强拮抗能力的拮抗细菌,并从形态学观察、生理生化特性、全细胞脂肪酸分析及16S rRNA和gyrB基因序列相似性对拮抗能力最强的菌株进行鉴定,同时测定拮抗菌无菌过滤发酵液对FOC菌丝生长、孢子萌发的抑制作用,并评价其发酵液对盆栽和大田黄瓜枯萎病的防治效果。研究结果显示,从健康黄瓜根际土壤中分离获得23株对FOC具有拮抗作用的细菌,其中菌株FJ17-4对FOC抑菌作用最强,鉴定为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。FJ17-4抑制FOC引起菌丝畸形、扭曲、膨胀、皱缩、缠绕等异常现象。10%无菌过滤液对FOC菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别为70.96%和85.40%。50倍发酵液、菌体悬浮液和无菌过滤液盆栽防治效果分别为70.20%、58.87%和47.80%,大田防治效果分别为69.53%、58.46%和36.12%。综上,FJ17-4能有效抑制FOC,对黄瓜枯萎病具有显著的生防效果,具有广泛的应用前景。     

枯草芽胞杆菌SNUB16的抗真菌作用研究

本文测定了枯草芽胞杆菌SNUB16发酵液无菌滤液的抗菌谱及无菌滤液对尖镰孢和棉花枯萎病菌孢子萌发和菌丝生长的影响。结果表明,枯草芽胞杆菌SNUB16发酵液无菌滤液对23株真菌有抗菌作用,尤其对植物病原真菌尖镰孢、棉花枯萎病菌、玉米大斑病菌、辣椒炭疽病菌和小麦根腐病菌有显著抗菌作用。发酵液无菌滤液可使尖镰孢及棉花枯萎病菌孢子萌发率下降,芽管顶端、菌丝末端及菌丝中央发生畸形的球状结构,菌丝干重减少,菌丝细胞损伤,使细胞内物质外泄。     

马铃薯枯萎病生防芽胞杆菌筛选及生防效果研究

马铃薯枯萎病是马铃薯主要土传真菌病害之一，已成为限制我国马铃薯产业健康发展的重要因素之一。菌株ZF128是本实验室从马铃薯根际土壤分离筛选得到的一株对马铃薯枯萎病菌具有显著抑制效果的生防细菌。经生理生化、BIOLOG GENIII和系统发育树分析，鉴定菌株ZF128为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。抑菌谱测定结果显示，ZF128对5种病原真菌和5种病原细菌都具有显著拮抗效果。光学显微观察发现，菌株ZF128处理的病原菌菌丝生长受到抑制并出现膨胀变粗现象。发酵试验表明，菌株ZF128在甘露醇培养基中发酵上清液对马铃薯枯萎病菌的抑制效果最好。盆栽试验结果证明，接种菌株ZF128后马铃薯发病明显减轻，防效为82.46%。此外，定殖和促生试验表明，菌株ZF128能在马铃薯根际和根部有效定殖30d以上，处理组马铃薯株高、根长、地上部和地下部鲜重及叶绿素含量等指标均显著高于对照组。综上，菌株ZF128生防性状优良，是一株具有潜在应用价值的芽胞杆菌。     

贝莱斯芽胞杆菌HN-2发酵上清液抑制三种黄单胞菌的生物活性研究

贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis HN-2为本实验室从土壤中分离得到的一株生防菌，本文研究了菌株HN-2发酵上清液活性成分的最优提取方式、抑菌效果及其活性成分的稳定性。结果表明，通过不同方式提取的菌株HN-2发酵上清液活性成分对3种黄单胞菌均有良好的抑菌活性。其中正丁醇提取物对水稻细菌性条斑病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzicola的抑菌效果最好，抑菌圈大小为（41.57±0.33）mm；并且在10 mg/mL浓度下，贝莱斯芽胞杆菌HN-2正丁醇提取物比杆菌肽、春雷霉素和叶枯唑具有更好的抑菌效果。稳定性试验结果表明，贝莱斯芽胞杆菌HN-2正丁醇提取物对pH有较宽的适应范围（pH 1.0～9.0），且在紫外线及高温等环境下仍具有较好的稳定性。综上所述，贝莱斯芽胞杆菌HN-2正丁醇提取物具有开发成为生物源农药的潜力。     

烟草青枯病菌拮抗细菌的筛选、鉴定和抑菌机制研究

青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum造成的烟草青枯病是烟草主要毁灭性病害之一。本研究采用牛津杯法从运城盐湖湖岸土壤中筛选获得一株对烟草青枯病菌具有较好拮抗效果的菌株FY-C;并进一步分析了菌株FY-C的抑菌谱、对青枯病菌的潜在生防效果。结果显示,经菌株FY-C无菌滤液处理24 h后的青枯病菌细胞壁降解,内容物外渗;且对青枯病菌产生的抑菌活性表现出较强的热稳定性、酸碱稳定性。通过形态、生理和系统发育分析将菌株FY-C鉴定为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis,且菌株FY-C对多种病原真菌都有抑制作用。促生试验显示,菌株FY-C发酵液灌根处理烟草45 d后,株高和鲜重分别比对照提高28.54%和24.90%;防治试验显示,菌株FY-C发酵液灌根预处理5 d后接种青枯病菌较对照处理（LB处理）防效增长了59.74%。此外,发现菌株FY-C具有分泌纤维素酶、蛋白酶及生成生物膜的能力。综上,贝莱斯芽胞杆菌FY-C具有较大的生防潜力,能够为植物病害的绿色防控提供研究思路。     

莫海威芽胞杆菌D50产抗菌脂肽培养基优化

莫海威芽胞杆菌B. mojavensis D50是一株对多种植物病原真菌具有拮抗作用的生防菌株,前期研究表明脂肽类化合物是其产生的主要抑菌物质。本研究采用抑菌圈法测定了菌株D50抗菌脂肽的稳定性,发现其脂肽粗提液在高温、非强酸强碱、紫外辐射的环境下都具有较高的稳定性。通过Plackett-Burman和Box-Behnken试验,测定了不同培养基成分对脂肽产量的影响,并对菌株D50产抗菌脂肽培养基进行了优化。结果表明,硫酸镁、葡萄糖、酵母浸粉是影响脂肽产量的关键性因素。优化后的培养基成分为葡萄糖15.45 g/L、牛肉膏3.00 g/L、酵母浸粉5.99 g/L、硫酸锰0.30 g/L、氯化钙0.30 g/L、硫酸铵2.00 g/L、硫酸镁0.16 g/L、磷酸二氢钾1.50 g/L和磷酸氢二钠2.00 g/L。培养基优化后,脂肽产量可达1.74 g/L,比优化前提高了167.70%。本研究明确了莫海威芽胞杆菌D50产生的抗菌脂肽对环境因子具有较高的稳定性,并获得了利于抗菌脂肽产生的培养基组分,为D50抗菌脂肽的大规模生产奠定了基础。     

内生解淀粉芽孢杆菌BEB17脂肽类和聚酮类化合物的抑菌活性分析

BEB17是本实验室从健康香蕉植株根部中分离得到的一株具有较强抑制真菌活性的内生解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。在本研究中,我们通过PCR检测多个脂肽类和聚酮类化合物的合成相关基因,并结合基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析,发现该菌株能产生表面活性素Surfactin、泛革素Fengycin和伊枯草菌素Iturin三类脂肽类化合物以及Bacillibactin、Difficidin和Bacillaene三类聚酮类化合物。通过比较两种发酵培养基(M9和Landy培养基)和两种提取方法(酸沉淀法和大孔树脂抽提法),结果发现酸沉淀法提取较为高效,Landy培养基更易于BEB17脂肽类和聚酮类化合物的发酵。活性检测表明,两种提取方法提取的粗提物对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4,Foc4)都具有较好的抑制作用,其中大孔树脂抽提法提取的物质抑制效果最好,当其浓度为300μg·m L-1时抑制率可达80.75%,说明该方法制备的粗提物的活性物质含量相对较高。进一步研究表明,该提取物能引起Foc4菌丝膨大和畸形,并抑制其孢子萌发。分析表明,该提取物对Foc4细胞膜具有破坏作用。     

内生解淀粉芽胞杆菌BEB33脂肽类化合物分析及对香蕉枯萎病菌拮抗作用研究

为解析内生解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens BEB33的生防机理，检测了该菌株脂肽类化合物合成相关基因，利用基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱分析了该菌株脂肽类化合物的种类，评价了脂肽类粗提物对香蕉枯萎病菌（FOC4）形态、镰刀菌酸合成的影响，以及粗提物对香蕉枯萎病的生防潜力分析。结果显示，BEB33基因组中编码有surfactin、fengycin、iturin和bacillomycin D 4种脂肽类物质合成酶基因。使用M9培养基发酵能产生surfactin、fengycin和bacillomycin D 3种脂肽类物质；脂肽类粗提物可导致香蕉枯萎病菌菌丝细胞膨大，细胞膜穿孔，镰刀菌酸产量降低70%；并发现脂肽类粗提物对香蕉枯萎病具有明显的防治效果。在不同处理中，枯萎病发病率分别降低47.67%、23.22%和36.56%，病情指数分别降低38.09、28.56和35.87。本文所获研究结果为进一步利用该菌株进行香蕉枯萎病生防制剂的研发提供理论基础。     

贝莱斯芽胞杆菌ZZBV-3的鉴定及其对草莓根腐病的防效

为获得草莓根腐病原菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum的优良拮抗菌,以草莓种植基地的土壤为拮抗菌来源,通过室内测定不同菌株的抑菌活性,筛选抑菌率最高的菌株,在此基础上对所筛菌株进行分类鉴定,并评价其抑菌谱和防效。结果表明,从土壤中分离获得39株拮抗菌,筛选出3株对尖孢镰刀菌具有明显抑制作用的菌株。其中,菌株ZZBV-3的抑菌作用最强,抑菌圈直径为16.2 mm。经形态学及多基因（包括16s rDNA和gyrB基因）比对分析,确认菌株ZZBV-3为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。菌株ZZBV-3抑菌谱广,对多种植物病原菌均具有良好的抑菌效果。盆栽试验结果表明,菌株ZZBV-3对草莓“红颜”和“甜查理”品种的根腐病防效分别为77.96%和81.18%,生防应用前景良好。     

玉米根际细菌群落特征及生防菌筛选

为了明确玉米根际细菌群落结构特征并从中筛选玉米病害生防资源,本研究采用培养法从玉米根际分离得到1584株细菌,分别属于变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门,其中变形菌门为优势菌群。在属水平上,假单胞菌为优势菌群。以玉米大斑菌为靶标菌,通过平板对峙方法,筛选出162株具有抑菌效果的菌株,其中1株抑菌效果最强,根据形态学和分子生物学结合的方法,将其鉴定为解淀粉芽胞杆菌。该菌对4种玉米病害病原菌具有广谱的抑菌效果,且含有脂肽类抗生素合成基因,其脂肽类物质粗提液对病原菌的抑制率高达81.56%。总体来看,该菌株具有较大的生防潜力,可作为生防菌防治玉米病害。     

一株海洋细菌BA-3的鉴定及其对建兰尖孢镰刀菌茎腐病的防治

为获得对建兰茎腐病病原菌尖孢镰刀菌具有良好抑菌效果的生防菌，以海洋鱼类为分离来源，室内测定不同海洋细菌菌株的抑菌活性，筛选抑菌率最高的菌株，在此基础上对所筛菌株进行分类鉴定及抑菌谱和防效测定。结果表明：从海洋鱼类中分离获得43株海洋细菌，初筛出10株对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌具有明显抑制作用的菌株，抑菌带宽0.60～1.60 cm，其中菌株BA-3抑制作用最强，抑菌率达87.69%；经形态、生理生化及分子生物学鉴定，确认菌株BA-3为解淀粉芽胞杆菌。该菌抑菌谱广，对建兰茎腐病原菌尖孢镰刀菌的室内防效为79.05%，大棚防效74.71%～77.09%，具有良好的应用前景。     

枯草芽孢杆菌XM16菌株制剂对苹果霉心病的防治及病原的抑制作用

 从苹果树体上分离得到枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis(Ehrenberg) Cohn]XM16颉颃菌株。室内测定其带菌培养液对Alternaria alternata、Trichothecium roseum和Fusarium sp.3种苹果霉心病主要病原的抑制作用均为100%,而XM 16菌株50倍的灭菌制剂,对上述3种病菌的抑制效果分别为92.5%、86.5%和92.2%。其抑菌机理主要是使病菌孢子和菌丝畸变,细胞壁溶解,原生质泄漏。1997年和1998年连续两年对苹果霉心病进行小区防治试验,北斗和红星品种霉心病的病果率分别为6.8%、6.5%和6.0%、5.4%,而对照的发病率分别为48.0%、45.5%和50.6%、43.0%;XM16制剂处理的防治效果分别为85.8%、85.7%和88.1%、87.4%,明显高于化学药剂处理的21.9%、30.1%和26.9%、20.9%的效果;两年的试验结果基本一致。     

南极海单胞菌BSw10005代谢活性物质及对植物病原菌抑制作用

 对从南极海水中分离的海单胞菌BSw10005发酵液进行冷冻干燥、乙醚萃取, 获得白色固体活性粗提物, 其对15种植物病原真菌、细菌和海洋病原弧菌等都具有较好的抑制作用。对西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)的抑制表现为使菌丝中原生质凝聚、菌丝体壁破裂和抑制分生孢子萌发。该活性物质在30~100℃范围内稳定性较好, 在pH值2~8的条件下具有较好的活性, 说明该活性物质具有作为农用抗生素的潜力。该抑菌物质经过官能团显色反应、凝胶柱层析、薄层层析、红外光谱和元素分析, 初步判定为胺类物质。     

烟草赤星病菌拮抗菌解淀粉芽胞杆菌YW-2-6鉴定及生防效果

为获得有效拮抗烟草赤星病菌的生防资源,采用稀释分离法和平板对峙法从烟草根际土壤中分离筛选烟草赤星病菌拮抗菌株。通过形态学观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析进行鉴定,并测定其对烟株的促生作用,验证菌株的产IAA能力,评价生防菌发酵液对烟草赤星病的田间防效。结果表明,从分离的65株细菌菌株中筛选到5株烟草赤星病拮抗细菌,其中菌株YW-2-6对烟草赤星病菌拮抗效果最好,抑制率为71.32%,初步鉴定菌株YW-2-6为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。菌株YW-2-6对小麦赤霉病菌、辣椒疫霉病菌、烟草靶斑病菌等病原菌具有显著的拮抗作用。YW-2-6发酵液对烟草赤星病防效为56.93%,且菌株YW-2-6对烟株有明显的促生作用。菌株YW-2-6具有良好的生防潜力和开发前景。