生姜腐皮镰刀菌的分离鉴定及PCR快速检测方法构建

 由腐皮镰刀菌(Fusarium solani)引起的生姜枯萎病是一种毁灭性真菌土传病害,其病原菌的快速高效检测,有助于枯萎病的早期诊断及预警。通过回接试验、形态学观测以及系统进化树分析,对湖北生姜产区分离的菌株进行鉴定,获得生姜腐皮镰刀菌(F. solani)。基于镰刀菌属通用引物TEF-1αF/TEF-1αR基因序列,以腐皮镰刀菌基因组DNA为模板进行扩增测序,根据序列信息设计筛选出一对腐皮镰刀菌特异性引物,构建了基于普通PCR的快速高效分子检测方法,并对接种过病菌的生姜植株和土壤进行检测验证。通过病原菌的菌落形态、孢子显微结构观察、真菌通用引物ITS1/ITS4鉴定和致病性测定,确定引起生姜枯萎病的病原菌为腐皮镰刀菌(F. solani)。用设计的特异性引物F8/R8进行PCR,特异扩增获得约381 bp的目标条带,检测灵敏度为454 pg·μL^-1,利用该引物对带菌生姜幼苗和土壤进行检测验证,证实可从发病生姜幼苗和带菌土壤中特异性检测到腐皮镰刀菌(F. solani)。本研究明确了引起湖北生姜枯萎病的病原菌为腐皮镰刀菌(F. solani),并建立了PCR快速检测方法。该检测方法简便、灵敏、高效,可用于生姜枯萎病的早期诊断与预防。     

大白菜枯萎病病原镰刀菌种类的初步研究

2014～2016年,由于栽培管理及重茬等原因,大白菜枯萎病在我国大面积发生,造成了巨大的经济损失。为了明确引起大白菜枯萎病的病原菌,本课题组从山东、内蒙古、河北、甘肃等大白菜主产区采集了具有典型枯萎病症状的病样,并对样品中的病原菌进行了分离和鉴定。形态学鉴定结果表明:分离物分别具有尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(F. solani)和木贼镰刀菌(F. equiseti)的形态学特征。柯赫氏法则验证结果表明:3种病原菌均能使大白菜发病,且发病症状与田间症状一致。此外,基于病原菌的r DNA-ITS和mt SSU序列的测序比对,3种病原菌与尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和木贼镰刀菌的同源性分别达99%～100%,这与形态学鉴定结果相一致。尖孢镰刀菌引起白菜枯萎病为国内首次报道,而茄病镰刀菌和木贼镰刀菌引起白菜枯萎病为国内外首次报道。     

甜瓜种子携带的镰刀菌种类鉴定及其致病性研究

 采用洗涤检验法和马铃薯葡萄糖琼脂培养基法,从甜瓜种子上分离得到23个镰刀菌分离物。采用形态观察和分子生物学方法对其进行鉴定,并研究其致病性以及对甜瓜种子发芽的影响。通过观察菌落形态和色素颜色,以及大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子形态,同时分析ITS-rDNA序列和翻译延伸因子-1α(TEF-1α)基因序列,以确定真菌分离物的分类属性。结果表明,4个分离物为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),5个分离物为层生镰刀菌(F. proliferatum),5个分离物为木贼镰刀菌(F. equiseti),9个分离物为轮枝样镰刀菌(F. verticillioides)。这4种镰刀菌均对甜瓜幼苗有致病性,其分生孢子悬浮液对甜瓜种子发芽有抑制作用。这是我国首例开展甜瓜种子携带致病性镰刀菌的研究报道。     

甜瓜种子携带的镰刀菌种类鉴定及其致病性研究

 采用洗涤检验法和马铃薯葡萄糖琼脂培养基法,从甜瓜种子上分离得到23个镰刀菌分离物。采用形态观察和分子生物学方法对其进行鉴定,并研究其致病性以及对甜瓜种子发芽的影响。通过观察菌落形态和色素颜色,以及大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子形态,同时分析ITS-rDNA序列和翻译延伸因子-1α(TEF-1α)基因序列,以确定真菌分离物的分类属性。结果表明,4个分离物为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),5个分离物为层生镰刀菌(F. proliferatum),5个分离物为木贼镰刀菌(F. equiseti),9个分离物为轮枝样镰刀菌(F. verticillioides)。这4种镰刀菌均对甜瓜幼苗有致病性,其分生孢子悬浮液对甜瓜种子发芽有抑制作用。这是我国首例开展甜瓜种子携带致病性镰刀菌的研究报道。     

中国番木瓜枯萎病病原菌的首次鉴定

从发病的番木瓜茎基部组织分离培养得到纯分离物,采用形态学和分子生物学方法进行分离物鉴定。经过致病性测定证实,分离物确定为番木瓜枯萎病的病原菌;通过形态学观察表明,与茄腐镰刀菌(Fusarium solani)形态一致。根据真菌的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)的保守性和变异性,采用通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增,然后将PCR产物纯化后直接测序,对测试菌株与10株来自GenBank中的菌株ITS序列进行聚类分析,结果表明,测试菌株与GenBank上注册的茄腐镰刀菌GU134886、GQ451337、EU625405、EF534183和GQ376115聚在同一分枝上,分子鉴定结果与形态学观察结果一致,此为国内首次报道。     

河北廊坊大豆枯萎病病原镰刀菌的分子鉴定

为明确河北廊坊中国农科院植保所试验基地大豆孢囊线虫病田内大豆枯萎病病原镰刀菌的种类,对362份罹病枯萎大豆植株进行病原真菌分离,得到335株真菌;使用镰刀菌通用引物鉴定出镰刀菌(Fusarium spp.) 279株,占分离菌株83.3%;镰刀菌特异性引物、测序等分子生物学技术结合形态学特征进一步鉴定镰刀菌种类,鉴定出尖孢镰刀菌(F. oxysporum) 189株,占分离菌株56.4%;茄病镰刀菌(F. solani) 67株占20.0%、禾谷镰刀菌(F. graminearum) 16株占4.8%、木贼镰刀菌(F. equiseti) 3株、层出镰刀菌(F. proliferaum) 2株、燕麦镰刀菌(F. avenaceum)和厚孢镰刀菌(F. chlamydosporum)各1株;致病性测试结果表明数量最多的尖孢镰刀菌(F. oxysporum)中约92.8%菌株具有不同程度的致病力;这些结果表明该试验基地大豆枯萎病的优势病原菌为尖孢镰刀菌(F. oxysporum);研究结果可为大豆枯萎病的防治提供科学依据,并为大豆孢囊线虫与尖孢镰刀菌复合侵染大豆的研究奠定基础。     

宁夏回族自治区马铃薯镰刀菌根腐病病原菌的分离鉴定与致病性测定

为明确宁夏回族自治区马铃薯镰刀菌根腐病的病原菌种类,2015—2018年从宁夏回族自治区固原市、吴忠市、中卫市和石嘴山市4个市12个区县采集马铃薯病样,采用组织分离法对病样进行分离纯化,利用形态学鉴定方法和基于rDNA-ITS与EF-1α序列分析的分子鉴定方法对分离物进行鉴定,并按照柯赫氏法则对其致病性进行测定。结果显示,经组织分离法共获得真菌菌株347株,其中230株镰刀菌属真菌菌株引起马铃薯镰刀菌根腐病,这些镰刀菌分属于5个种,分别为尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum、茄病镰刀菌F. solani、锐顶镰刀菌F. acuminatum、木贼镰刀菌F. equiseti、接骨木镰刀菌F. sambucinum,这5种镰刀菌分别为67、29、50、39和45株,分离频率分别为29.13%、12.61%、21.73%、16.95%和19.56%;这5种镰刀菌的致病性有差异,其中接骨木镰刀菌和茄病镰刀菌的发病率分别为91.81%和99.99%,病情指数分别为69.56和82.23,均高于其它3种镰刀菌,是引起宁夏回族自治区马铃薯镰刀菌根腐病的优势病原菌。     

浙江省铁皮石斛根腐病病原真菌的鉴定

为明确铁皮石斛根腐病病原真菌,于其主产地浙江省金华市武义县收集铁皮石斛根腐病病株,采用平板分离方法对病原真菌进行分离,使用镰刀菌种特异性引物并结合ITS和TEF序列分析及形态学鉴定确定该镰刀菌的分类地位。结果表明,共分离纯获得真菌117株,其中有105株镰刀菌;经分子生物学分析及形态学鉴定结果显示,分离出的镰刀菌为层出镰刀菌Fusarium prolife‐mum、茄病镰刀菌F. solani、尖孢镰刀菌F. oxysporum和厚垣镰刀菌F. chlamydosporum四个种,其中层出镰刀菌在数量上具有优势地位,占总镰刀菌数的44.8%;茄病镰刀菌、尖孢镰刀菌、厚垣镰刀菌分别占总镰刀菌数的21.0%、15.2%和19.0%。在致病性测定中发现层出镰刀菌和茄病镰刀菌并不具备致病性,尖孢镰刀菌的致病性明显弱于厚垣镰刀菌,表明厚垣镰刀菌为浙江省金华市武义县铁皮石斛根腐病的主要致病菌。     

甘肃定西地区甘蓝枯萎病病原菌的分离与鉴定

自2009年起,甘肃定西地区出现了甘蓝植株矮化、叶片黄化、枯萎甚至死亡的现象。2015年8月,我们采集了田间病株样本,使用常规组织分离法对病原菌进行了分离和纯化,依据柯赫氏法则进行了病原菌确认,并通过形态学和分子生物学方法对病原菌进行了鉴定。结果表明病原菌的形态学特征与尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum一致,其rDNA-ITS、rDNA-IGS以及EF-1α序列与尖孢镰刀菌F.oxysporum相似性达99%,基于病原菌及尖孢镰刀菌各代表专化型EF-1α序列构建的系统发育树将该菌与尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp.conglutinans聚为一类,故引致甘肃定西地区甘蓝枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌黏团专化型F.oxysporum f.sp.conglutinans。     

芝麻枯萎病病原菌致病力室内鉴定方法

 芝麻枯萎病(Sesame Fusarium wilt, SFW)是由尖孢镰刀菌芝麻专化型(Fusarium oxysporum Schl. f. sp. sesami (Zap.), FOS)引起的一种土传真菌病害, 是世界芝麻生产上的主要病害之一。为测定FOS致病力, 本文选用郑芝98N09等4个芝麻品种, 在苗期对15个FOS菌株的致病力强弱进行了室内鉴定和评价。结果表明, 采用1×10⁶个/mL分生孢子悬浮液与无菌蛭石和无菌土壤按V1∶V2∶V6比例混合接菌(即最终接菌浓度为1.4×10⁵孢子/g土壤), 在接菌后第7 d幼苗开始出现枯萎病症状, 调查菌株致病性的最佳时间为接菌后第25 d~28 d;在供试15个FOS菌株中, 对4个品种均表现为强致病力的菌株有8个(DI>50), 均表现为弱致病力的菌株有5个(DI<20);不同芝麻品种对不同菌株的抗性有一定差异。该方法可应用于芝麻枯萎病病原菌致病性测定和芝麻种质抗枯萎病特性评价, 并为后续的机理研究提供了技术支持。     

番茄枯萎病致病镰刀菌种类鉴定及优势种群的研究

<正>镰刀菌(Fusarium spp.)是真菌的一个重要属,分布极为广泛,是多种重要植物的病原菌。其中,由致病性尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)侵染引起的植物枯萎病是一种世界性的土传真菌病害。病菌从植物根部侵入,扩展进入维管束,造成植株枯死,在植株的全生育期均可发生,给生产带来了巨大的损失。国内外已报道的被严重为害的作物有棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黄瓜、哈密瓜、西瓜、大     

3种瓜类枯萎病菌Fusarium oxysporum的分子检测

 Fusarium oxysporum is one of the most important phytopathogens and cause Fusarium wilt disease in cucumber, watermelon and melon, etc.In this study, a pair of species-specific primers Fc-1 and Fc-2 was synthesized based on differences in internal transcribed spacer sequences of Fusarium genus.With the primers, a specific 315 bp PCR product was amplified from five F.oxysporum isolates isolated from cucumber, watermelon and melon, infected cucumber and watermelon tissues, while no product was obtained from other fourteen fungi, healthy cucumber and watermelon tissues.The detection sensitivity is 100 fg for genomic DNA of F.oxysporum and 1 000 spores/g soil for the soil pathogens.In contrast, the nested PCR with two pairs of primers(ITS1/ITS4 and Fc-1/Fc-2) increased the sensitivity by 100-fold.In addition, one-step PCR could also detect F.oxysporum in symptomless cucumber root of 7 dpi(days post inoculation) and in infected cucumber and watermelon tissues at the early stage of disease development.Therefore, the developed PCR-based method enabled rapid, sensitive and reliable detection of F.oxysporum.It also provides the detection method for early monitoring and diagnosis of the pathogen as well as the plant disease management guidance.     

杭白菊枯萎病的病原菌分离鉴定及淀粉酶产色链霉菌对其防治效果

杭白菊枯萎病是杭白菊重要病害之一，枯萎病的爆发对杭白菊产量造成了巨大的影响。为了明确杭白菊枯萎病的病原菌及其生防菌的防治效果，本文通过形态学和ITS序列分析方法，初步鉴定杭白菊枯萎病病原菌为半裸镰刀菌Fusarium incarnatum。进一步采用菌丝生长速率法和孢子萌发法，测定了淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochramogenes 1628代谢产物对该病原菌的抑制效果。结果发现，链霉菌1628代谢产物对菌丝生长和孢子萌发的EC₅₀分别为2.22%和4.70%（体积浓度）。盆栽试验结果表明，施用淀粉酶产色链霉菌代谢产物原液14和28 d后，其对杭白菊枯萎病的保护效果、治疗效果分别为52.84%和42.85%、19.23%和30.16%。说明淀粉酶产色链霉菌1628的代谢产物对杭白菊枯萎病具有明显的保护和治疗作用。     

陕西省大葱叶部镰刀菌枯萎病病原菌的鉴定

<正>0引言大葱(Allium fistulosum L. var. giganteum Makino)为石蒜科(Amaryllidaceae)葱属(Allium)植物，是常见的调味品，具有杀菌祛痰、强心降压等多种功效。已报道的大葱叶枯病病原菌包括匍柄霉属(Stemphylium)、泛菌属(Pantoea)、疫霉属(Phytophthora)^[1-3]等。调查发现陕西乾县漠西大葱种植基地一种大葱叶部枯萎病发病率较高，成为影响当地大葱生产的主要病害之一。     

引起河北省保定市白术根腐病的病原镰刀菌种类鉴定

In order to identify the pathogenic fungi of Atractylodes macrocephala root rot in Baoding, Hebei Province, eighty strains of Fusarium species were isolated from 120 A. macrocephala plants with root rot symptoms with the isolation frequency at 66.7%. Fusarium species were identified by molecular techniques with specific primers, TEF-1α gene sequencing together with morphological characteristics. Thirty-nine F. solani strains were identified with the highest percentage at 48.8%, and 32 F. oxysporum strains were isolated with the percentage at 40.0%. Seven F. equiseti and two F. brachygibbosum strains accounted for 8.8% and 2.5%, respectively. The pathogenicity test on A. macrocephala showed that F. solani and F. oxysporum caused the typical symptoms of root rot. Koch's postulates were fulfilled following re-isolation and identification of the isolates of F. solani and F. oxysporum. Taken together, the results showed that F. solani and F. oxysporum were the pathogens of A. macrocephala root rot in Baoding, Hebei Province.     

海南玉米穗腐病病原菌分离鉴定及优势种的遗传多样性分析

为了阐明海南省玉米穗腐病病原菌的种类,结合形态学和分子生物学方法对83份病样进行了病原菌的分离和鉴定,最终获得12种病原菌,包括拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)、层出镰孢(F.proliferatum)、亚粘团镰孢(F.subglutinans)、木贼镰孢(F.equiseti)、新知镰孢(F.andiyazi)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、拟康宁木霉(T.koningiopsis)、卵孢木霉(T.ovalisporum)、喙刚毛球腔菌(Exserohilum rostratum)、玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)和可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)。其中,拟轮枝镰孢分离频率占65.06%,为优势种。以拟轮枝镰孢的EF-1α、histone 3和β-tubulin基因序列为基础进行多基因家系分析,以明确海南省与内陆部分省份不同菌株之间的遗传关系。结果表明,海南省内菌株之间具有丰富的遗传多样性,而且海南省和内陆省份菌株之间存在高频率的基因交流。     

西瓜种传镰刀菌形态和分子鉴定及其对种子发芽的影响

 采用洗涤检验法和PDA培养基法,从京欣一号和新京欣一号西瓜种子的种壳上分离得到镰刀菌,通过形态学观察和分子检测进行了鉴定,并研究了其对种子发芽的影响。通过菌落形态、色素颜色、菌落生长速率、大型分生孢子、小型分生孢子、厚垣孢子以及分生孢子梗等形态学观察,初步认为其为尖孢镰刀菌;采用真菌rDNA ITS区的通用引物、镰刀菌属特异性引物和尖孢镰刀菌特异性引物对其DNA进行PCR扩增,PCR产物经连接转化并验证后测序,将测序结果登录GenBank进行BLAST分析,分子检测结果与形态学观察结果一致,表明西瓜种子种壳携带的镰刀菌为尖孢镰刀菌,此结果为国内首次报道。用种传尖孢镰刀菌孢子悬浮液处理西瓜种子后,发芽势、发芽率和发芽指数均显著降低。     

杨浦链霉菌WLU210的筛选、鉴定及其对苦瓜枯萎病的生防作用研究

本研究从河南黄河湿地采集土壤样品,采用梯度稀释涂布平板法分离和平板对峙培养法筛选获得一株对苦瓜枯萎病菌具有稳定拮抗活性的链霉菌WLU210。在形态学鉴定和生理生化特征测定的基础上,对菌株WLU210的16S rRNA基因序列进行比对分析,将WLU210鉴定为杨浦链霉菌Streptomyces yangpuensis;拮抗谱测定结果表明,杨浦链霉菌WLU210对苦瓜枯萎病菌、苹果轮纹病菌、小麦茎基腐病菌、辣椒疫霉病菌、西瓜炭疽病菌、小麦全蚀病菌和玉米大斑病菌等7种植物病原菌均具有一定的拮抗活性;盆栽试验和田间试验结果表明,杨浦链霉菌WLU210发酵液具有有效防治苦瓜枯萎病和促进苦瓜生长的作用,田间防治效果达68.89%。由此可见,杨浦链霉菌WLU210具有作为防治苦瓜枯萎病生防菌剂研发的潜力。