MoRAD26参与稻瘟病菌的胁迫应答和致病过程

 稻瘟病菌引起的稻瘟病是水稻三大病害之一。DNA修复对维持基因组的完整性具有重要作用,为了解析DNA修复基因在稻瘟病菌致病过程中的功能,本试验对稻瘟病菌DNA损伤检控点蛋白MoRad26进行了功能分析。首先我们利用同源重组的方法获得了MoRAD26基因的稻瘟病菌敲除突变体。表型观察发现MoRAD26缺失突变体的致病力下降,对DNA损伤胁迫和H₂O₂胁迫更加敏感,但是对稻瘟病菌的生长、产孢以及分生孢子萌发和附着胞的形成没有明显影响。进一步分析表明,敲除MoRAD26基因降低了稻瘟病菌侵染菌丝的扩展能力进而影响稻瘟病菌的致病力,但其具体机制还有待深入研究。     

稻瘟病菌几丁质结合蛋白MoChtbp1的功能初步研究

 稻瘟病是一种由子囊真菌稻瘟病菌引起的危害粮食安全的世界性病害。多数效应蛋白对于稻瘟病菌的毒力起到重要作用,在与寄主植物的相互作用中至关重要,因此,筛选并鉴定稻瘟病菌效应蛋白,阐释其基因功能对于稻瘟病的防治具有重要意义。本研究根据已有的稻瘟病菌效应蛋白相关研究方法以及生物信息学软件筛选出了一个几丁质结合蛋白MoChtbp1,进一步利用叶鞘细胞—效应子分泌荧光表达观察体系确定MoChtbp1是一个质外体效应子。利用同源重组的方法敲除MoChtBP1,发现MoChtBP1的缺失不会影响稻瘟病菌在生长、产孢以及附着胞形成等方面的能力,但会导致其致病能力明显减弱。本文结果将为新的抗病水稻选种育种提供实验材料及理论依据。     

水稻VQ37基因的克隆及其在病原侵染下的表达

 VQ蛋白作为转录辅助蛋白,在植物的生长、发育和抗逆等生理过程中发挥重要的调节功能。本研究采用RT-PCR从水稻叶片中克隆了VQ37基因的完整cDNA序列。VQ37 cDNA长622 bp,具有长为546 bp的完整开放读码框,编码蛋白质长181个氨基酸,具有FxxxVHxVTG的VQ基序变体。系统进化分析表明,水稻VQ37与短花药野生稻(Oryza brachyantha)、大麦(Hordeum vulgare)和Dichanthelium oligosanthes等禾本科植物亲缘关系近;除水稻旁系同源物VQ39外,VQ37与短花药野生稻中的XP 015699121亲缘关系最近。原生质体瞬间表达实验证实VQ37定位在细胞核中。荧光定量PCR分析显示,VQ37基因的组织特异性表达和诱导表达结果与启动子顺式元件预测基本一致。VQ37在叶片中的表达丰度最高,其次是叶鞘、茎、穗、根和花,在胚和胚乳中无表达。VQ37受纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和稻瘟病菌(Magnaporthe oryza)显著诱导,而不受白叶枯细菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)诱导;与此一致的是,VQ37受真菌病原相关模式(PAMP)分子几丁质寡糖快速诱导,而不受细菌鞭毛蛋白flg22影响。茉莉酸甲酯和乙烯利能显著诱导VQ37的表达,而水杨酸对其表达无明显影响。上述结果提示,VQ37可能调控水稻对稻瘟病菌和纹枯病菌防御反应,这种调节作用可能依赖于茉莉酸/乙烯介导的信号途径,而与水杨酸信号途径无关。该研究为阐释水稻VQ37基因在水稻抗病反应中的调节功能提供了基础。     

水稻和稻瘟病菌互作中的信号传导及防御反应基因诱导表达的研究

 水稻和稻瘟病菌互作是研究植物与病原菌互作的模式体系。本文利用3个水稻抗稻瘟病近等基因品系(CO39、C101LAC和C101A51)和2个特异性菌株(M209和M210)构成不同亲和程度的互作关系,研究了稻瘟病菌对3个水稻信号传导途径关键酶合成基因、5个防御反应病程相关蛋白基因和1个防御反应转录因子调控基因诱导表达的作用。结果表明:稻瘟病菌诱导了各种互作关系中水稻OsLOX、OsAOS和OsPAL酶合成基因的表达,水稻启动了茉莉酸和水杨酸防御反应信号传导途径。在不亲和的互作反应中,稻瘟病菌能不同程度地诱导水稻OsPR1a、OsPR2、OsPR3-1、OsPR3-2和OsPR4基因的表达,从而有效激活了防御反应系统,使水稻植株表现为抗病;而在亲和的互作反应中,多数OsPR基因的表达水平低、时间短或没有表达,水稻植株表现为感病。OsMyb基因在各种互作关系中有不同的诱导表达。说明这些防御相关基因的诱导表达可能与水稻抗稻瘟病性相关。     

2002年江苏省水稻稻瘟病菌致病性及遗传多样性研究

 由稻瘟病菌(Magnaporthe grisea,无性世代为Pyricularia grisea)引发的水稻稻瘟病是目前水稻生产上的重要病害之一,存在着品种专化性和致病性的分化.一些抗病品种推广3~5年后即丧失抗病性,给生产带来很大危害.目前选育和利用抗病良种仍是防治该病最经济有效的措施^[1].由于稻瘟病菌的多样性及易变性直接导致了品种的抗病性丧失,因此研究稻瘟病菌的致病性和群体遗传结构组成等具有重要意义.     

云南罗平田间稻瘟菌株性状及无毒基因研究

 稻瘟菌和水稻是研究禾本科作物病原-寄主互作机制的模式病理系统。云南罗平县不仅是云南省水稻主产区,栽培水稻品种多样,同时也是稻瘟病易发区,田间稻瘟菌群体组成复杂,信息流强度大。田间单孢菌株的分离和无毒基因的研究,是揭示稻瘟菌毒性变异机制和制定田间稻瘟病综合防控策略的重要基础。本研究通过单孢分离,从2017年云南罗平田间病样上分离和保存了有效单孢菌株120份,系统地进行了菌株培养性状、产孢能力、7个无毒基因存在/缺失多态性及无毒基因变异与致病性相关性的研究。研究结果表明:菌株间培养性状、产孢能力差异较大,但培养性状和产孢能力与菌株的病样源无关;ACE1、Avr-Pizt、Avr-Pita1、Pwl2、Avr-Pik、Avr-Pii和Avr-Pia 7个无毒基因在云南罗平120个田间菌株中的存在/缺失频率不同,ACE1、Pwl2和Avr-Pizt存在频率最高(100%),Avr-Pia最低(5%),Avr-Pita1、Avr-Pik和Avr-Pii分别是99%、99%和89%,并首次分离和鉴定了33个包含3个Avr-Pik等位基因拷贝的菌株;部分代表菌株接种单基因系水稻的致病性鉴定结果显示,菌株中无毒基因的完全缺失或变异能使携带相应抗病基因的单基因系水稻材料感病,表明病原通过丢弃或修饰其无毒基因逃避寄主的免疫识别,克服寄主的抗性。研究结果不仅丰富了稻瘟病菌的遗传资源,奠定了水稻-稻瘟菌互作机制研究的重要基础,而且也为云南罗平稻瘟病的综合防治提供了参考。     

稻瘟病菌无毒蛋白AvrPiz-t半胱氨酸残基的功能分析

 稻瘟病菌无毒基因AvrPiz-t编码了一个包含108个氨基酸的未知功能的预测分泌蛋白,其与对应的水稻抗稻瘟病基因Piz-t介导了基因对基因的抗病反应。序列分析发现AvrPiz-t的预测成熟蛋白AvrPiz-t₉₀含有4个半胱氨酸残基,推测它们可能参与了AvrPiz-t蛋白分子内或分子间的相互作用。为了检测这4个半胱氨酸对AvrPiz-t功能的影响,利用定点突变技术对4个半胱氨酸残基分别进行了位点突变并构建了相应的稻瘟病菌互补载体。功能互补分析发现,上述4个突变体都丧失了AvrPiz-t无毒基因的功能。由此推断,半胱氨酸对AvrPiz-t蛋白功能的表达是非常重要的。     

尖孢镰刀菌番茄专化型中SNARE蛋白FolSso1的功能分析

 SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白保守存在于丝状真菌中,在膜泡转运的过程中起着关键的作用。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,Fol)引起的,严重威胁着番茄的生产。我们使用反向遗传学的方法来研究番茄枯萎病菌中SNARE蛋白FolSso1的功能,实验结果发现FolSSO1的基因缺失突变体菌丝生长速率降低,且产孢数量减少。另外,FolSSO1基因的缺失导致突变体相较于野生型菌株对细胞壁压力与细胞膜压力更加敏感。然后,在番茄果实和番茄植株的致病性实验中,我们发现FolSSO1的缺失并没有引起Fol致病性显著的变化。综上所述,本研究发现FolSSO1可以调控Fol营养生长,繁殖和对环境压力的响应过程,然而对Fol的致病过程并没有显著的调控作用。     

尖孢镰刀菌番茄专化型中SNARE蛋白FolSso1的功能分析

 SNARE(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白保守存在于丝状真菌中,在膜泡转运的过程中起着关键的作用。番茄枯萎病是由尖孢镰刀菌番茄专化型(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,Fol)引起的,严重威胁着番茄的生产。我们使用反向遗传学的方法来研究番茄枯萎病菌中SNARE蛋白FolSso1的功能,实验结果发现FolSSO1的基因缺失突变体菌丝生长速率降低,且产孢数量减少。另外,FolSSO1基因的缺失导致突变体相较于野生型菌株对细胞壁压力与细胞膜压力更加敏感。然后,在番茄果实和番茄植株的致病性实验中,我们发现FolSSO1的缺失并没有引起Fol致病性显著的变化。综上所述,本研究发现FolSSO1可以调控Fol营养生长,繁殖和对环境压力的响应过程,然而对Fol的致病过程并没有显著的调控作用。     

稻瘟病菌效应蛋白MoIEEP1功能初探

由稻瘟病菌引起的稻瘟病是全球最严重的植物真菌病害之一, 严重威胁水稻生产安全?效应蛋白是病原菌与植物对抗过程中分泌产生的一种蛋白质, 可作为毒力因子促进侵染或作为无毒因子触发防御反应?本研究对实验室前期筛选到的在稻瘟病菌侵染早期诱导表达的效应蛋白(infection-induced expression effector protein 1, MoIEEP1)进行了功能验证与分析?结果表明: MoIeep1 在稻瘟病菌侵染初期8 h表达量最高; 信号肽和亚细胞定位分析验证该蛋白N端含有17个氨基酸的信号肽且在水稻原生质体中呈明亮点状的定位信号, 初步推测该定位信号为过氧化物酶体或线粒体等细胞器; 与野生型菌株Guy11相比, MoIeep1 基因敲除突变体菌丝生长无明显差异, 但其致病性受到影响?以上研究结果为进一步探究该蛋白质的作用机理打下良好基础, 也为揭示其他效应蛋白在稻瘟病菌侵染水稻过程中的功能提供新的理论依据?     

GTP酶激活蛋白MoGcs1参与调控稻瘟病菌的无性繁殖,附着胞分化及对外界胁迫的应答

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻上的一种毁灭性真菌病害,每年导致的稻谷产量损失可养活6千万人口。从分子水平了解该病菌的致病机理,对新型药剂靶标的挖掘和病害防控策略的制定具有重要的理论和实践指导意义。生物体存在两类GTP结合蛋白,一类是异三聚体G蛋白,另一类是小G蛋白。小G蛋白分子量为20~30 KD,具有GTP酶活性,在多种细胞反应中具有分子开关作用。小G蛋白结合GTP时被激活,可作用于下游分子使之活化。当GTP水解成为GDP时,则恢复为非活化状态。细胞中存在一些专门控制小G蛋白活性的调节因子,如鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)和GTP酶激活蛋白(GTPase activating protein,GAP)。GEF能够催化GTP的转换,而GAP的作用是加速GTP的水解,使小G蛋白向失活的状态转变。本研究在稻瘟病菌中鉴定到一个GAP蛋白MoGcsl,并对该蛋白编码基因的生物学功能进行了研究。对MoGCS1基因进行敲除突变发现,△Mogcsl突变体产孢量显著下降,分生孢子形态异常且附着胞形成加快,但突变体的营养生长和致病能力与野生型比较无明显变化。进一步研究发现,突变体对外界盐胁迫敏感性升高,对细胞壁胁迫敏感性降低。上述结果表明,MoGcsl是稻瘟病菌生长发育过程中一个重要的蛋白,参与调控病菌的无性繁殖、附着胞分化及对外界胁迫的应答。     

源于水稻品种空育163的稻瘟病菌菌株致病性分析

 为分析相同遗传背景下稻瘟病菌致病性变化情况,利用24个水稻单基因系品种为评价体系,通过喷雾接种的方式,对36个以空育163为哺育品种的稻瘟病菌株进行了分析,得出以下结论:1、供试菌株致病力强,对24个抗瘟基因的致病率在36.11%~100%之间,平均致病率77.51%,逐年增强趋势明显。2、供试菌株致病性分化严重,相似系数在0.00~1.00之间,在相似系数0.50水平上,共划分为29个类群,优势类群菌株占总菌株的13.89%。3、24个抗瘟基因对供试菌株抗谱在5.56%~56.48%之间,Pi-k^m抗谱最窄, Pi-9(t)抗谱最宽;在基因搭配前提下,Pi-9(t)& Pi-12(t)组合和 Pi-9(t)& Pi-11组合效果略好。总体分析,供试菌株致病力和致病性分化都处于较高水平,目前缺少高效抗源加以控制。     

辽宁省稻瘟病菌对肟菌酯敏感性监测

 为了明确稻瘟病菌对肟菌酯的敏感性,利用菌丝生长速率法测定了2018~2019年辽宁省11个水稻产区分离的220株稻瘟病菌对肟菌酯的敏感性,并在此基础上对供试菌株的抗药性水平进行了分析。结果表明:稻瘟病菌对肟菌酯的EC₅₀值分布范围为0.011 1～0.498 3 μg·mL^-1,敏感性差异达44.89倍。220株稻瘟病菌对肟菌酯的敏感性分布频率不符合正态分布,说明已经出现对肟菌酯敏感性降低的分化群体,根据野生敏感型病原群体对药剂敏感性呈正态分布的原理,将供试群体中91.82%符合正态分布菌株的平均EC₅₀值(0.043 0±0.017 9) μg·mL^-1作为稻瘟病菌对肟菌酯的敏感性基线。辽宁省稻瘟病菌对肟菌酯的抗性倍数分布范围为0.256 9~11.493 8,平均抗性指数为0.27,抗性菌株出现频率为6.82%。目前菌群以敏感性群体为主,肟菌酯可作为防治稻瘟病的主要药剂,但在多地发现抗性菌株,应注意与不同作用机制药剂轮换使用。     

稻瘟菌群体中dsRNA的多样性及稻瘟菌菌株QSP5中病毒对寄主生物学性状影响的研究

 真菌病毒在真菌中广泛存在,一些真菌病毒可以影响病原真菌营养生长、产孢和色素形成等性状。本文研究了真菌病毒在水稻稻瘟菌中的多样性以及其对寄主生物学性状的影响。采用单孢分离的方法从发病水稻叶片上分离获得了120个稻瘟菌菌株,其中约52%携带dsRNA片段。菌株QSP5被2个基因组为dsRNA的病毒即产黄青霉病毒1-C(Magnaporthe oryzae chrysovirus 1-C, MoCV1-C)和稻瘟菌病毒3(M. oryzae virus 3, MoV3)所侵染。对菌株QSP5进行单个的分生孢子纯化,获得了仅携带MoV3的菌株QSP5-9。菌株QSP5与QSP5-9的产孢量、菌丝形态以及菌落形态存在明显差异,经研究推测MoCV1-C与菌株QSP5 的产孢能力衰退、菌丝生长和产色素异常相关。同时对MoV3的稳定性进行了初步的研究。从稻瘟菌菌株QSP5获得了100个单孢分离物,通过对随机挑选的40个单孢分离物进行检测,结果表明这些分离物100%携带MoV3,只有部分单孢分离物携带MoCV1-C。另外,从稻瘟菌菌株QSP5-9获得了94个单孢分离物,对随机挑选的45个单孢分离物进行检测,结果表明这些分离物中均含有与菌株QSP5-9大小相同的dsRNA片段。根据以上结果推定MoV3在稻瘟菌菌株QSP5和QSP5-9及其无性后代中具有一定的稳定性。     

特基拉芽胞杆菌JN-369抗菌粗蛋白的理化性质和抑菌效果

特基拉芽胞杆菌Bacillus tequilensis JN-369是1株对稻瘟病菌Magnaporthe oryzae有较好拮抗作用的植物内生细菌，其发酵液经硫酸铵沉淀后得到抗菌粗蛋白。为明确菌株JN-369抗菌粗蛋白的抑菌机理，首先确定了该抗菌粗蛋白抑菌谱、热稳定性、酸碱稳定性、紫外稳定性以及酶稳定性，并观察研究了抗菌粗蛋白对稻瘟病菌菌丝和分生孢子的抑制作用。并采用针刺离体接种法测定了40%稻瘟灵EC、25%三环唑WP及不同浓度JN-369抗菌粗蛋白对水稻稻瘟病的拮抗效果。结果表明：菌株JN-369抗菌粗蛋白抑菌谱广，对葡萄灰霉病菌、草莓灰霉病菌和水稻稻瘟病菌等13种植物病原真菌及卵菌表现出抑制作用，而对油菜菌核病菌没有抑制作用；该粗蛋白理化性质相对稳定，具有应用于粮食作物生物防治的潜力；对稻瘟病菌的菌丝生长和分生孢子萌发有双重抑制作用，能使病原菌菌丝细胞膨大，并可抑制病菌分生孢子的萌发；离体防效试验显示，供试杀菌剂对水稻稻瘟病均有显著的拮抗效果，菌株JN-369抗菌粗蛋白在浓度为50～100 μg/mL时对稻瘟病的拮抗效果最好，该菌株有望开发为防治稻瘟病的生防菌株。     

沼泽红假单胞菌Atp2蛋白的原核表达及稻瘟病菌的互作蛋白初步筛选

光合细菌沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonas palustris PSB06是对稻瘟病具有良好防效的生防菌株。为进一步挖掘其生防代谢产物，前期通过蛋白层析分离技术，从PSB06培养液中鉴定到一个ATP合成亚基Atp2蛋白，ATP2基因编码序列为1431 bp。构建了pET32a（+）-ATP2重组表达载体，原核表达纯化后获得的Atp2蛋白产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。试验证明Atp2蛋白显著抑制稻瘟病菌的附着胞形成和在水稻寄主上的致病力。为阐明Atp2蛋白抑菌机理，通过酵母双杂交技术，以Atp2为诱饵筛选稻瘟病菌cDNA文库，获得了7个与Atp2有相互作用的蛋白质，分别是E3泛素连接酶复合物（MGG_04978），两个核糖体蛋白（MGG_16204、MGG_04977）和4个假定蛋白（MGG_09168、MGG_01034、MGG_03543、MGG_00718），研究结果为揭示Atp2蛋白抑制稻瘟病菌的作用机制提供理论基础。     

来源于中药的稻瘟病菌拮抗解淀粉芽胞杆菌鉴定及其活性成分特性

为寻找新的水稻稻瘟病拮抗微生物资源,本研究从中药提取液中分离纯化到一株性能优良的拮抗细菌CWJ2。平板对峙试验显示该菌株对水稻稻瘟病菌丝生长抑制率为69.51%。根据菌落、菌株形态、16S rDNA和gyrB基因序列,鉴定该菌株为解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens。该菌株发酵滤液能明显抑制稻瘟病菌菌丝生长和孢子萌发,10%的发酵滤液能100%抑制菌丝生长;2%的发酵滤液能导致菌丝分支明显减少,菌丝变短、膨大或畸变。菌株CWJ2的发酵液在高温、蛋白酶K、紫外和酸碱处理下,抑菌活性无显著变化。试验结果表明,菌株CWJ2对稻瘟病菌拮抗效果好,且抗菌活性成分稳定,有望作为生防菌株开发防治稻瘟病制剂。