抗病毒转基因木瓜的分子检测

本研究测定了抗病毒转基因木瓜品系55-1、GM YK和华农1号的结构特征序列,并根据测序结果设计、合成了结构特异性检测引物,建立了55-1、GM YK和华农1号的结构特异性检测方法.为提高检测效率,将结构特异性检测引物和内源基因检测引物置于同一反应体系之中,建立了转基因木瓜品系的两重PCR检测方法.本研究建立的PCR检测体系可用于进口木瓜的检测,从中发现未经我国批准的转基因木瓜品系,为转基因产品的标识管理提供技术支持.     

云南文山州首次在感病西葫芦上检测到番木瓜环斑病毒

为明确引起云南文山州广南县西葫芦发生蕨叶、斑驳、泡状斑等症状的病原,从采集的西葫芦病样中提取总RNA,利用RT-PCR扩增后经电泳检测及测序获得大小为887bp的片段;经过BLAST序列同源性比对分析,该病原与番木瓜环斑病毒Papaya ringspot virus(PRSV)(KY996464)基因序列同源性达87%。由此可知,侵染文山州西葫芦的病毒病原是番木瓜环斑病毒。     

番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因的构建

 以番木瓜环斑病毒黄斑分离物(PRV-YS) RNA为模板,在人工合成的两端引物引导下,反转录合成了外壳蛋白(CP)基因cDNA第一链并通过PCR扩增获得双链cDNA。用重组有cDNA的pUC19转化E.coli DH52,采用双脱氧链终止法进行了cDNA序列分析,结果表明CP基因为861nt,与文献^[1]报道的相比,同源率90%,且少连续的6nt。     

从进境印度尼西亚辣椒种子中截获番茄环斑病毒

本文利用DAS-ELISA方法从印度尼西亚进境的辣椒种子中初步筛选出疑似感染有番茄环斑病毒(ToRSV)的样品,利用IC-RT-PCR(immune capture RT-PCR)扩增特异性片段,进而对扩增的PCR产物进行了测序和序列比对,确认我们在进境的辣椒种子中检出了我国关注的检疫性有害生物——番茄环斑病毒。此前该病毒未有在印度尼西亚辣椒上危害的报道,是系统内首次在蔬菜种子上截获该病毒。     

烟草环斑病毒RT-Realtime PCR检测方法

烟草环斑病毒(Tobacco ringspotvirus,TRSV)是我国公布的二类检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大。受该病毒侵染的一些寄主植物出现隐症,并伴随病毒浓度降低,给检测工作造成困难。根据TRSV外壳蛋白基因序列设计合成了一对引物及一条MGB探针,优化了反应条件,建立了TRSV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与常规的DAS-ELISA方法和RT-PCR方法相比,灵敏度分别提高了200倍和4倍,并且对不同寄主上的TRSV均有较好的检测效果。     

吉林局从进口葵花种子中截获烟草环斑病毒

2006年6月吉林局从塞尔维亚和国诺维萨特大田与蔬菜作物研究所进口的3批葵花种子中截获我国禁止进境的二类危险性有害生物——烟草环班病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）。该病毒寄主范围很广，检疫人员已对该批货物及时销毁。     

多重PCR检测转基因菜籽粕中的转基因成分

以油菜内源基因PEP、抗除草剂基因(BAR、PAT)、筛选基因NPTII、常见启动子(CaMV35S、FMV35S)和终止子NOS为检测对象,通过研究不同引物终浓度的配比以及退火温度对转基因菜籽粕多重PCR检测的影响,建立了菜籽粕转基因成分7重PCR检测体系。结果表明,本研究所建立的检测体系能有效检测出菜籽粕以及其他作物(大豆、玉米、大米、棉花籽)中的转基因成分,检测过程简便、准确,值得推广应用。     

实时荧光PCR定性检测菜籽粕中转基因成分的研究

本文针对使用实时荧光PCR对深加工的饲料菜籽粕进行转基因检测的研究,就DNA抽提、纯化和实时荧光PCR过程中使用样品DNA的最适浓度等方面,对检测方法进行了适当的改进,并探讨了如何根据所得荧光曲线的Ct值判定菜籽粕中是否含有转基因成分.     

番木瓜抗环斑病毒突变体抗性遗传及RAPD标记

 ⁶⁰Coγ-射线处理番木瓜种子,从诱变一代中筛选到1株耐环斑病毒(PRSV)的变异植株(M₁),其侧芽组培后代(VM₁)部分植株也表现出了耐病性,以VM₁为母本进行回交,人工接种病毒鉴定回交后代(BM₂)的抗病性,结果为:在出自部分回交果实的BM₂群体中,包含有对PRSV Ys和Vb株系具抗性的植株,抗感分离比为1:1,但未发现抗Sm株系的植株;BM₂抗病两性株自交或以其为母本进行回交,分别获得诱变第三代(M₃)及回交诱变第三代(BM₃),人工接种PRSVYs株系,结果表明,BM₃抗感分离比也为1:1,因而认为辐射处理突变产生了具PRSV株系专化性的显性抗病基因,命名为Rys;但M₃抗感分离比不符合显性单基因3:1理论值,认为是单倍体选择的结果。运用BSA法,在BM₂中寻找到一个与抗病性密切相关的RAPD标记,经在BM₂、M₃及BM₃抗感群体中检验,可作为抗病育种的辅助选择标记。Rys是番木瓜栽培种中发现的第一个抗PRSV基因。     

3种转基因成分检测蛋白芯片的研制

为研制一种可同时检测3种转基因成分BTCry1Ac蛋白、植酸酶蛋白、BTCry1Ah蛋白的蛋白芯片。本文将3种转基因成分蛋白质的单克隆抗体点于化学修饰的基片上,对芯片的表面修饰材料、点样缓冲液成分、封闭液种类、标记二抗使用浓度、反应时间进行优化,并对芯片检测的特异性、灵敏度进行测定。结果表明:研制芯片的表面为环氧修饰,使用含0.1%BSA和30%甘油的点样缓冲液和含1%BSA的封闭液,每次反应时间为30min时,有最佳反应结果;其检测灵敏度为:BTCry1Ac蛋白35ng/mL、植酸酶蛋白20ng/mL、BTCry1Ah蛋白30ng/mL,信号稳定;本研究建立的抗体蛋白芯片检测法可同时检测3种转基因蛋白,并具有较高的灵敏性、特异性和可靠性。     

大豆制品转基因成分检测和定量标识分析

分别以大豆凝集素(Lectin)和5-莽草酸-3磷酸合成酶(CP4-EPSPS)为内源和目标基因,对28种大豆制品进行实时荧光PCR检测.检测结果表明,4种大豆制品的CP4-EPSPS扩增结果为阳性,含有转基因大豆成分.转基因成分的定量检测在贸易和可操作性方面要优于定性检测.     

转基因植物的检测策略和检测技术

目前转基因植物的安全性在全球范围内引起激烈的争论与普遍关注。一些国家正在努力制定相应的法律和法规,对转基因产品实行标识制度,加强对转基因植物及其产品的管理。为了在世界贸易活动中保证本国经济利益不受侵害,加强转基因植物及其产品的检测技术研究是必不可少的。转基因植物的检测主要有两种方法:一种是DNA水平上的检测,另一种是蛋白质水平上的检测。     

转基因延熟番茄"华番一号"的品系特异性检测方法

本文使用反向PCR方法克隆了转基因延熟番茄"华番一号"(Bioscein)的外源基因和番茄基因组之间的一段边界序列,并依据此段序列设计了具有品系特异性的引物和荧光探针,以实时荧光PCR技术建立了华番一号的品系鉴定检测方法,扩增片段长108bp,横跨在Nos启动子和番茄基因组之间.以转基因大豆(RR)、转基因玉米(Mon810)、转基因抗草甘膦油菜、转基因棉花(保龄棉)、非转基因番茄、马铃薯、茄子、大椒、大米、小麦、烟草等为试材,证明本方法同其它转基因作物及其它蔬菜无非特异性反应.本方法在检测华番一号番茄时,相对检测灵敏度可达到0.1%,绝对灵敏度达到20个拷贝.由于本方法的PCR扩增产物长度只有108bp,因此该方法也可以用于检测加工产品中的转基因成分,或作为常规PCR定性检测后的确证实验方法.     

二重荧光定量PCR检测转基因大豆DAS81419

本文针对大豆内源基因Lectin和转基因大豆DAS81419品系的5′端插入位点序列,设计特异性引物及探针,建立了同时检测转基因大豆DAS81419品系和大豆内源基因Lectin的二重荧光定量PCR方法,运用15种转基因大豆、3种转基因玉米、1种转基因油菜、1种转基因水稻和非转基因大豆对该方法进行了特异性评价,并分析了该方法的灵敏度和稳定性。结果显示,该方法能准确从20种转基因样品和1种非转基因样品中检出靶目标,检测结果与待检样品信息一致,表明本方法具有良好的特异性;灵敏度高达0.01%;并具有良好的重复性。该方法特异性强、灵敏度高、稳定性强,适用于各口岸实验室进行转基因大豆DAS81419的快速、准确的检测。     

Persistence of naturally occurring and genetically modified Choristoneura fumiferana nucleopolyhedroviruses in outdoor aquatic microcosms

BACKGROUND: To assess the persistence of genetically modified and naturally occurring baculoviruses in an aquatic environment, replicate (three) outdoor, aquatic microcosms were spiked with spruce budworm viruses [Ireland strain of Choristoneura fumiferana multiple nucleopolyhedrovirus (CfMNPV) and the recombinant CfMNPVegt(-)/lacZ(+)] at a rate of 1.86 x 10(10) occlusion bodies (OBs) m(-2) of surface area. The presence of virus in water samples collected at various times after inoculation was determined by PCR amplification of baculoviral DNA extracted from OBs.RESULTS: Although UV radiation rapidly degrades baculoviruses under natural conditions, both viruses persisted above the level of detection (>100 OBs 450 microL(-1) of natural pond water) for at least 1 year post-inoculation, with little difference between the viruses in their patterns of persistence.CONCLUSION: The present microcosm study suggests that occlusion bodies of baculoviruses can persist in the flocculent layer of natural ponds. On disturbance, OBs could re-enter the main water column and thus be available for transport to new locations. Implications for environmental risk assessment are discussed. (c) 2008 Her Majesty the Queen in Right of Canada. Canadian Forestry Service. Published by John Wiley & Ltd.     

番木瓜环斑病毒株系的分子生物学方法鉴定

 以PRSV株系特异性引物对PRSV的PRSV126(PRSV日本分离物)、Ys、Vb和Sm等株系进行RT-PCR方法鉴定,引物PR21/PR22能把Ys从Vb和Sm中鉴定出来,PR300/PR301则能把Vb从Ys、Sm和PRSV126中鉴定出来;用限制性内切酶Hae Ⅱ、Sau3A I和Hinf I对PRSV的PRSV126、Ys、Vb和Sm等株系进行单酶切RT-PCR-RFLP分析,Hinf I能把PRSV126与Ys、Vb和Sm鉴别开来,Sau3A I能把Ys与Vb和Sm鉴别开来,Hae Ⅱ则能把Ys与PRSV126、Vb和Sm鉴别开来;以P1/P2为引物,对Vb、Ys和Sm株系进行RT-PCR-RFLP-SSCP分析,结果能一次把三者较好地区别开来。     

超声波处理对水稻种子转基因成分荧光PCR检测的影响

以转基因水稻科丰6号含量0.1%(m/m)与0.01%(m/m)的水稻种子为样品,对影响检测结果的DNA提取过程中样品CTAB裂解缓冲液常规温育与超声波温育处理进行比较分析。结果表明,在不同样品颗粒细度的样品中,无论温育时间10 min、30 min还是1 h,CTAB缓冲液超声波温育处理与常规温育处理比较,获得的DNA质量浓度有明显提高,转基因成分NOS、Cry1Ab、Kf6(Ub-C)的荧光PCR检测Ct值差异达到极显著,超声波温育处理30 min、1 h可基本达到常规温育处理4 h或8 h的样品荧光PCR检测效果,使得水稻种子转基因成分荧光PCR检测时间至少节省3~7 h,大幅度提高了检测效率。     

转基因大豆外源基因的漂移风险

转基因作物外源基因的漂移已为国内外学者所证实。我国每年进口转基因大豆的数量巨大,转基因大豆外源基因的漂移对我国传统的大豆作物和生态环境是一个潜在威胁。本文论述了转基因大豆的概况和外源基因漂移的风险,并对进境转基因大豆的检测监管进行了思考。