利用错配碱基引物的ASO-PCR检测小麦赤霉病菌对 多菌灵中抗菌株Codon200 TTC→TAC基因型

 采用在引物3′端引入错配碱基,建立了特异性检测小麦赤霉病菌对多菌灵中抗菌株(Codon²⁰⁰ TTC→TAC)基因型的ASO-PCR分子检测技术。结果表明含有错配碱基的引物对NT-7 R1/NT-7 Err5 F能够特异性检测小麦赤霉病菌对多菌灵的中抗菌株（Codon²⁰⁰ TTC→TAC）,扩增条件为94℃预热5 min;94℃变性60 S,56℃退火60 S,72℃延伸60 S, 35个循环;最后72℃延伸15 min。并利用26种常见植物病原真菌验证了所设计引物的PCR扩增特异性。整个检测过程快速,操作简单,结果准确,在6小时内完成。     

小麦赤霉病菌多菌灵抗性群体的扩散路径分析——基于致病菌种类及所产毒素化学型鉴定和抗药性检出的时序性

通过对江苏、安徽、山东、河南、湖北、河北和四川7省小麦赤霉病菌对多菌灵抗性及敏感菌株Fusarium asiaticum和F.graminearum的鉴定、所产生毒素的化学型及多菌灵抗性菌株检出时序性的分析,初步推测了小麦赤霉病菌对多菌灵抗性群体在中国麦区的扩散路径。结果表明:江淮流域的江苏、安徽、湖北3省和四川省小麦赤霉病菌对多菌灵的抗性或敏感菌株优势群体均是F.asiaticum,而黄淮流域的山东、河南2省及河北省小麦赤霉病菌对多菌灵的敏感菌株优势群体为F.graminearum,抗性菌株优势群体则为F.asiaticum。江苏、安徽、山东和河南抗多菌灵菌株F.asiaticum产生毒素的化学型为3-AcDON和NIV,并以3-AcDON为主。江苏省连续使用多菌灵防治小麦赤霉病长达20多年后才检测到田间抗性菌株,而近年来检测到田间抗性菌株的山东、河南2省用多菌灵防治赤霉病的历史较短,且为偶尔使用,药剂的选择压力相对较小,因此推测山东和河南麦区出现的小麦赤霉病菌抗多菌灵菌株可能是通过种子调运及联合收割机跨区作业等方式从抗药性发生较早的江淮麦区流入的。     

抗苯并咪唑的小麦赤霉病菌β-tubulin基因序列分析与特性研究

 本研究用真菌U-微管蛋白基因的通用寡聚核苷酸引物B1和B3,扩增并克隆了一段821 bp的小麦赤霉病菌Fusarium graminearum的U-微管蛋白基因片段,并进行了序列测定。根据该序列设计了F.graminearum U-微管蛋白基因的特异性测序引物,测定了赤霉病菌对多菌灵不同抗感菌株的U-微管蛋白基因核苷酸序列,结果表明不同F.graminearum菌株的U-微管蛋白的165,198,200和257位氨基酸未发生突变,在克隆的片段内也未发现核苷酸突变引起的氨基酸改变。表明该菌对多菌灵产生抗性的分子机制与目前已知的其它真菌有所不同,有待进一步研究。     

基于URP-PCR多态性片段的苦瓜枯萎病菌特异性检测技术的建立

 通过URP(Universal Rice Primers)-PCR分析尖孢镰孢菌苦瓜专化型基因组DNA扩增片段多态性,筛选检测尖孢镰孢菌苦瓜专化型的特异性引物,并建立了基于该引物的PCR检测方法。结果表明,特异性引物为FOMM-SPF/FOMM-SPR, PCR检测体系为25 SymbolmAL,包括2SymboltB Green Taq Master Mix 12.5 SymbolmAL,10 mmol·L^-1 的上下游引物各1 SymbolmAL,模板DNA 1 SymbolmAL,灭菌去离子水补足至25 SymbolmAL;PCR程序为95℃预变性3 min,94℃变性15 s,57℃退火30 s,72℃延伸20 s,共30个循环,循环结束后72℃延伸5 min;特异性扩增片段大小294 bp,检测灵敏度为2 ng·μL^-1 DNA或50个孢子·500 mg^-1土壤。该引物及其检测方法对尖孢镰孢菌苦瓜专化型的检测特异性好、灵敏度高,可以从土壤和植物样品中快速准确地检测出苦瓜枯萎病菌,无需病原菌的分离培养和致病性检测,对苦瓜枯萎病的早期诊断和预警及有效防控具有重要的指导意义。     

2018年我国小麦赤霉病菌对多菌灵抗性检测

以多菌灵为主的苯并咪唑类杀菌剂一直是小麦抽穗扬花期防控赤霉病的主要手段之一。本研究对2018年我国主要麦区采集的1 464株赤霉病菌菌株进行多菌灵抗性分子检测。共检测出多菌灵抗性菌株97株,抗性频率为6.63%,同时发现抗性菌株以F167Y突变频率最高,其次为E198Q和F200Y。通过比较不同省份间多菌灵抗性发生频率发现,长江中下游麦区赤霉病菌群体抗性频率明显高于黄淮麦区群体。本研究相比之前研究中的抗性频率大幅度上升,表明在多菌灵的选择压力下,多菌灵抗性种群发展迅速。为防止抗性群体的进一步发展,致使多菌灵防治赤霉病失效,应采用混配、复配药剂、不同作用机理的杀菌剂交替轮换使用来防治小麦赤霉病。     

小麦条锈菌水源11类群的RAPD分析及SCAR标记的建立

鉴于水源11类群近年来一直处于优势地位,为简化其检测手段,本研究利用RAPD技术对该类群的8个主要致病类型进行了多态性分析,以寻找其中主要流行类型的特异性分子标记。结果如下:共筛选出10个碱基随机引物190条,其中94条可得到稳定清晰的扩增图谱,用该94条引物进行RAPD分析,发现各致病类型间遗传变异丰富;以引物S1410扩增得到了水源11-4的特异性DNA条带;以引物S1412和S1304扩增得到了水源11-14的特异性DNA条带;对引物S1304扩增得到的特异性DNA条带回收、克隆和测序,设计了1对19bp/18bp的引物,并成功地将其转化为对水源11-14特异的SCAR标记。以上结果表明,通过规模筛选来寻找小麦条锈菌生理小种的特异性DNA片段,并将其转化为稳定的SCAR标记,有可能建立起中国小麦条锈菌流行生理小种的快速分子鉴定体系。     

山东省小麦赤霉病菌种群组成及其致病力分化

由禾谷镰孢菌群Fusarium graminearum clade引起的赤霉病是小麦的重要病害。为明确山东省小麦赤霉病菌的种群组成及其致病力,于2011年和2012年从山东省15地市分离了95株小麦赤霉病菌,在形态和分子生物学鉴定种的基础上,采用鉴定B型毒素化学型的特异性引物进行毒素化学型分析。在95个菌株中,93株分离物为禾谷镰孢菌F.graminearum,2株为燕麦镰孢菌F.avenaceum。94株分离物为脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol,DON)化学型,1株为雪腐镰孢菌烯醇(nivalenol,NIV)化学型。在94株DON毒素化学型菌株中,90株为15-乙酰脱氧雪腐镰孢菌烯醇(15-acetyldeoxynivalenol,15-AcDON)化学型,4株为3-乙酰脱氧雪腐镰孢菌烯醇(3-acetyldeoxynivalenol,3-AcDON)化学型。在小麦扬花期,采用单花滴注接种法对29个菌株进行了致病力测定,供试菌株的致病力分化明显。表明在山东省冬小麦产区,产15-AcDON毒素的F.gra-minearum是小麦赤霉病菌的优势种群。     

利用Tri8基因区分中国小麦赤霉病菌的毒素化学型

由镰孢菌(Fusarium spp.)引起的小麦赤霉病在全世界均有发生,我国小麦赤霉病主要由禾谷镰孢菌复合种(Fusarium graminearum species complex,FGSC)所引起,根据产生单族毒素种类分为三种化学型,分别为3-乙酰脱氧雪腐镰孢菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰脱氧雪腐镰孢菌烯醇(15-AcDON)和雪腐镰孢菌烯醇(NIV)化学型。为了更方便地对禾谷镰孢菌复合种进行化学型的区分,本研究利用三对引物分别扩增了三种化学型菌株的Tri8基因并进行了序列测定,根据不同化学型菌株的基因序列差异,进行了特异性引物设计和筛选。利用设计的引物同时扩增三种化学型的Tri8基因并用AvaI内切酶进行酶切,根据酶切片段的大小区分三种化学型。研究表明该方法可准确有效地区分我国小麦赤霉病菌的化学型。     

基于ISSR标记开发的一种用于小麦矮腥黑穗病菌的分子鉴定方法

 小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn, 简称TCK)是小麦上的一种重要检疫性真菌。本研究利用内部简单重复序列(Inter-simple sequence repeat, ISSR)技术研究TCK及其近缘种的DNA多态性,开发了一种可靠而简单的方法用于TCK的分子鉴定。用ISSR引物P4从TCK中扩增出一条1 113 bp的特异性条带,据此设计了一对特异性引物TCKF/TCKR,在12个TCK菌株中均能扩增得到一条882 bp的特异性条带,而其他近缘种包括小麦网腥黑穗病菌(T. caries)和小麦光腥黑穗病菌(T. foetida)及相关黑粉菌的14个菌株均无扩增条带。用该特异性引物检测TCK的下限为25 μL反应体系中可检测到1 ng DNA模板。本研究开发的种特异性引物,可将TCK与其形态上相似的近缘种尤其是小麦网腥黑穗病菌准确区分开,本研究基于ISSR标记建立的小麦矮腥黑穗病菌的分子鉴定方法为腥黑粉菌的检疫提供了一种便捷的方法,是对现有分子鉴定方法的一个补充。     

小麦纹枯病菌的分子检测

小麦茎基部可寄居多种真菌,并可导致发褐、坏死等症状,与小麦纹枯病相混淆.为准确诊断小麦纹枯病,根据江苏省小麦茎基部常见寄居菌禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、长蠕孢菌Helminthosporium spp.、交链孢菌Alternaria spp.、小麦全蚀病菌Gaeumannomyces graminis var.tritici和禾谷镰刀菌Fsarium graminearum rDNA的ITS区段序列差别,设计合成了2对特异性扩增引物(DNF77 DNR554,DNF81 DNR564)用于小麦纹枯病菌检测.2对引物均能从小麦纹枯病菌株扩增到特异性的分子片段,说明设计的特异性引物可以用来检测小麦纹枯病菌.采集田间具有小麦纹枯病症状、茎基部变褐及健康麦苗,进行病原菌分离,同时提取这些麦苗茎基部DNA,利用上述2对引物进行扩增.结果表明,仅从能分离到禾谷丝核菌的麦组织中扩增到约480bp的特异性条带.说明设计的特异性引物可以对田间小麦纹枯病进行早期、快速分子诊断.     

油菜菌核病菌对多菌灵和乙霉威的抗药性机理

生物测定结果表明,油菜菌核病菌田间菌株对多菌灵(MBC)敏感性表型呈多样性,即存在MBCS、MBCLRLR、MBCHRHR和MBCVHR表型.而对乙霉威(DIE)则只检测到DIES和DIEHR表型.MBCS、MBCLR和MBCHR菌株中除JD2-3菌株为DIES外,其余菌株均为DIEHR,MBCVHR菌株对DIE表现为DIES.MBC和DIE之间存在典型的负相关交互抗性.序列分析结果表明,表型为MBCVHRDIES菌株的β-微管蛋白基因,第198位氨基酸由Glu(GAG)突变为Ala(GCG);表型为MBCHRDIEHR菌株的β-微管蛋白基因的突变位点在第200位,由Phe(TTC)突变为Tyr(TAC);而表型为MBCSDIES和MBCLRDIEHR的菌株在所扩增的β-微管蛋白基因片段中未发生突变.初步表明,β-微管蛋白基因198和200位氨基酸的突变是引起油菜菌核病菌对多菌灵抗药性呈多样性的分子机理.     

小麦白粉菌环介导等温扩增检测技术体系的建立与应用

为建立简便、快速和灵敏的小麦白粉菌Blumeria graminis f.sp.tritici(Bgt)分子检测技术体系，基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术，以BGT96224V316＿LOCUS1725基因(GenBank:VCU40465.1)为靶标序列，设计并筛选特异性引物，建立小麦白粉菌的LAMP检测方法，并对其特异性、灵敏度和应用效果进行测定。结果表明，基于筛选出的1套特异性引物建立的LAMP方法能够从8种白粉菌属菌株和1种腐生菌中特异性地检测到小麦白粉菌；对小麦白粉菌DNA样品的检测灵敏度可达到300 fg/μL;对发病叶片的检测显示该LAMP方法能从人工接种的小麦叶片中准确检测出小麦白粉菌，检出时间为接种4 h及以上。综上，本研究建立了一种小麦白粉菌的LAMP检测方法，具有简便快捷、灵敏度高等特点，丰富了小麦白粉菌的检测体系。     

小麦印度腥黑穗病菌PCR检测

应用PCR方法对小麦印度腥黑穗病菌及其近似种或相关种包括黑麦草腥黑粉菌、狼尾草腥黑粉菌、水稻腥黑粉菌等10种腥黑粉菌共14个菌株进行了检测研究。根据线粒体DNA的序列分别设计了扩增小麦印度腥黑穗病菌的特异性引物和扩增黑麦草腥黑粉菌的特异性引物，根据核糖体内转录区（ITS）DNA片段设计了扩增腥黑粉菌属真菌的引物，应用PCR方法能将小麦印度腥黑穗病菌与黑麦草腥黑粉菌及其它近似种或相关种加以区分。本方法稳定、可靠、重复性强，已分别在不同实验室的不同型号PCR仪上得到验证。     

腐食酪螨ISSR最佳反应体系的设计

本文以腐食酪螨基因组DNA为模板,采用逐个参数优化法,探讨腐食酪螨ISSR实验的最佳反应体系。实验结果表明,腐食酪螨ISSR-PCR最佳反应体系:总体积25μL,其中Mg2+1.5 mM;10×Buffer 2.5 mM;dNTPs 0.2 mM;ISSR引物0.2μM;模板DNA 50 ng;Taq DNA聚合酶0.75 U。扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1 min,(48℃、50℃、52℃)复性1 min,72℃延伸1.5 min,循环35次,结束后72℃延伸5 min,4℃保存。同时通过梯度退火实验,确定不同引物的最佳退火温度。     

大麦云纹斑病菌中抗多菌灵乙霉威株系及其抗药性对致病性作用的分子分析

 田间抗性监测发现了大麦云纹斑病菌新型的抗性菌株,这类菌株对苯并咪唑类(多菌灵)、Phenylcarbamate(乙霉威)及三唑类(三唑醇)表现多重抗性,先前发现的多菌灵抗药性菌株均是在β-维管蛋白基因的198位点出现等位基因的突变,而新发现的菌株则仅在200位点(TTC)由苯并氨酸转变成赖氨酸(TAC)而导致对3种药剂的抗性。温室试验证明,这类菌株的致病性和野生敏感菌的致病性几乎一致,说明大麦云纹斑病菌对杀菌剂抗药性的发展与致病性之间没有相关性。     

西瓜细菌性果斑病菌的16S rDNA序列分析及特异性引物的设计

 利用细菌16S rDNA基因的通用引物对16个供试菌株进行PCR扩增,把扩增产物进行核苷酸序列测定。将获得的序列与GenBank中相关菌株的16S rDNA序列进行同源性分析。以此设计出检测A.a.c的特异性引物,并利用最大简约法构建了16S rDNA系统演化树。系统演化关系分析表明,6~9号供试菌株的16S rDNA序列与A.a.c标准菌株仅有3个位点的差异,其同源性均在99.8%以上,在构建的系统演化树上,它们聚为同一个族群。利用设计的一对特异性引物(BFB64/65),对各供试菌株进行PCR检测,结果只有A.a.c相关菌株产生扩增条带,产物大小与预期一致。     

针茅属植物RAPD条件优化

本试验以针茅属 ( Stipa L.)植物为材料 ,使用 CTAB法提取其基因组 DNA,通过对 RAPD( Random amplified polymorphic NDA,随机扩增的多态性 )条件优化分析 ,初步确定了针茅属植物 RAPD的最佳方案 ,即在 PCR扩增程序为 94℃预变性 3min,94℃变性 1 min,37℃复性 1 min,72℃延伸 1 .5 min,设 45个循环 ,最后 72℃保温 5 min时 ,2 5μL反应体系中包括 :0 .2 μL( 1 0 mmol/L) d NTPs,2 .0 μL( 1 0 mmol/L) Mg2 + ,0 .5 μL( 1 0 0 pmol/μL)引物 ,模板DNA80 ng,Taq酶 ( Sangon) 1 .0 U,2 .5 μL1 0×buffer缓冲液 ,其余部分用无菌三蒸水补平可以得到较好的扩增结果。     

小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性研究

测定了1976 年从江苏南京采集的54 株小麦赤霉病菌菌株对多菌灵的敏感性,EC50值在0. 2617～ 0. 6544 μg. mL - 1 之间, 1983 年在同一地点采集的76 株, EC50 值相应为0. 2517～ 0. 7050 μg. mL- 1 , 而1998 年从浙江、湖北、上海、福建、安徽、江苏各地采集的104 株菌株EC50值为0. 2478～ 6. 4574 Lg. mL- 1 , 表明湖北、上海、浙江等地田间已检测到小麦赤霉病菌抗多菌灵菌株。紫外光诱导分生孢子也获得了该病菌抗多菌灵突变株, 其EC50 值为14. 1993 Lg. mL - 1 。抗药性突变体JPR 与敏感亲本菌株JPS 相比, 在菌丝生长、产孢量方面无明显差异, 但JPR 孢子萌发率为57. 1% , 而JPS 为100% , 而且50% 孢子萌发的时间较野生亲本菌株滞后12 h。JPR 产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON 毒素) 3. 90 μg mL - 1 , 而JPS 产生的DON 毒素为9. 28μg. mL - 1 。     

马铃薯青枯病的PCR检测

以我国11个省(市、区)和6种不同寄主植物的43个青枯菌Ralstonia solanacearum代表性菌株和4个国外青枯菌菌株为试材,采用15条随机引物进行了RAPD分析,筛选到了1条青枯菌所特有的DNA片段,根据其碱基序列,设计了特异PCR引物,对不同青枯菌DNA进行扩增,并以马铃薯的其它病原细菌为对照,只有青枯菌可获得773bp的DNA扩增产物.经过对PCR反应模板制备程序的简化和优化,利用本研究设计的特异引物,直接对马铃薯病块茎的DNA粗提液进行扩增,获得了773bp片段.此技术可望用于马铃薯种薯青枯病菌的检测,大大缩短检测时间,提高检测效率.     

向日葵黄萎病病原菌轮枝菌的多重DPO-PCR检测方法

为建立可同时快速检测引起向日葵黄萎病害的2种检疫性病原菌大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.和黑白轮枝菌V.albo-atrum Reinke et Berthold的方法,根据2种病原菌的β-tubulin基因分别设计特异性DPO引物,建立多重DPO-PCR检测方法,并对其特异性和灵敏度进行评价。结果表明,所设计的DPO引物特异性强,仅大丽轮枝菌和黑白轮枝菌可分别扩增出225 bp与151 bp的特异性条带,其它向日葵病害的7种病原菌及阴性对照均无目的条带;反应体系中引物终浓度为0.2μmol/L、退火温度为60℃时,30个扩增循环的检测灵敏度均可达0.05 ng菌丝DNA量;在45~65℃退火温度范围内均可高效扩增靶基因片段,表明该方法退火温度范围宽。所建立的检测方法能够准确、高效地检测引起向日葵黄萎病的大丽轮枝菌和黑白轮枝菌,可用于向日葵种子带菌筛查及田间病害诊断检测。