三种化合物处理对南方根结线虫生长发育及致病能力的影响

为明确不同浓度NH4HCO3、Cu SO4·5H2O和Fe Cl3·6H2O对南方根结线虫Meloidogyne incognita 2龄幼虫活性的影响,在盆栽条件下将化合物处理后的2龄幼虫接种番茄,通过根染色和根系冰冻切片法观察2龄幼虫的发育状况和根系内巨细胞的形成,并测定了番茄根系各生理指标的变化。结果表明,50mmol/L NH4HCO3、1.4mmol/L Cu SO4·5H2O和1.4 mmol/L Fe Cl3·6H2O处理南方根结线虫后,番茄根系内2龄、3龄及4龄幼虫数量均显著小于对照;根系内丙二醛、可溶性糖和游离氨基酸的含量均显著低于对照,根系活力显著增强;经NH4HCO3处理后,根系内巨细胞形成缓慢,14 d时出现巨型细胞空洞现象。3种化合物处理对南方根结线虫生长发育的抑制作用显著,处理后的线虫对番茄植株致病力减弱,表现为NH4HCO3抑制作用最强,Cu SO4·5H2O次之,Fe Cl3·6H2O最弱。     

长枝木霉菌株TL16防治南方根结线虫的作用机理

为探明长枝木霉Trichoderma longibrachiatum菌株TL16防治南方根结线虫Meloidogyne incognita的作用机理,采用原生质体转化法获得绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记菌株GFP-TL16,通过测定菌株TL16和GFP-TL16对南方根结线虫卵和2龄幼虫(2nd-stage juvenile,J2)的寄生与致死作用,其发酵液对卵孵化的抑制作用和对J2的致死作用,以及菌株GFP-TL16在黄瓜根系的定殖情况和菌株TL16对番茄根结形成的抑制作用来综合分析其作用机理。结果显示:菌株TL16菌丝对南方根结线虫卵无寄生作用,处理19 d后卵降解率为26.33%,致死作用较低;菌株TL16分生孢子悬浮液处理南方根结线虫J2后72 h的致死率为1.65%,且无寄生作用。菌株TL16发酵液处理南方根结线虫J2后48 h的校正死亡率为10.71%,处理卵15 d后对卵孵化的相对抑制率为77.11%。菌株GFP-TL16可定殖于黄瓜根系中,经菌株TL16处理后接种南方根结线虫J2,番茄根结减退率为55.88%。表明长枝木霉菌株TL16可通过抑制根结线虫卵孵化和诱导番茄产生抗病性来防治根结线虫病。     

白僵菌及其伴生菌发酵液对线虫的毒力研究

采用发酵液浸没法,以4种线虫作为靶标,对6株白僵菌、7株伴生菌菌株进行了杀线虫活性筛选,以期获得新的、高效的杀线虫生防菌资源。其中:处理24 h对南方根结线虫Meloidogyne incognita 2龄幼虫及大豆胞囊线虫Heterodera glycines 2龄幼虫校正死亡率均达80%以上的菌株仅有白僵菌Snef2598及伴生菌Snef5;供试菌株对水稻干尖线虫Aphelenchoides besseyi的毒力均较低,其中仅有1株白僵菌校正死亡率达到40%以上。处理48 h对南方根结线虫2龄幼虫校正死亡率达90%以上的菌株有白僵菌4株和伴生菌5株;对大豆胞囊线虫2龄幼虫校正死亡率超过90%的菌株有白僵菌3株和伴生菌1株;供试菌株对水稻干尖线虫毒力均较低,校正死亡率达60%以上的菌株有白僵菌3株和伴生菌2株;几乎所有供试菌株,对小杆线虫Caenorhabditis sp.的毒力均很高,处理24 h及48 h的校正死亡率均达97%以上,且被杀死的小杆线虫体壁以及虫体内部物质均被不同程度地消解。研究表明,球孢白僵菌菌株Snef2598及其伴生菌菌株Snef5对4种靶标线虫的毒力均较好,具有进一步研究的价值。     

聚多曲霉Snef210对南方根结线虫毒性的研究

蔬菜根结线虫病在我国乃至世界危害日益严重,安全防控该病害成为目前急需解决的农业生产问题。本研究筛选到一株可毒杀南方根结线虫Meloidogyne incognita的生防真菌Snef210,经形态学和分子生物学鉴定为聚多曲霉Aspergillus sydowii(Bain.et Sart.) Thom et Church。该菌株发酵液对南方根结线虫2龄幼虫(J_2)具有很强的毒杀作用,原液处理24 h后校正死亡率达90.1%,处理3 d后对卵孵化的抑制率达92.8%。盆栽试验中,与对照相比,菌株发酵液10倍稀释液土壤处理对番茄根部的根结减退率为66.7%。聚多曲霉代谢产物丰富,多用于抗菌和抗肿瘤的研究,本文首次发现其对南方根结线虫有效,是一类潜在的控制植物线虫病害的新型生防因子。     

假格里尼翁苍白杆菌A-29对南方根结线虫的防治效果及其鉴定

南方根结线虫是一种重要的植物寄生线虫，严重发生时可造成巨大的经济损失。本研究测定了菌株A-29发酵液对南方根结线虫的致死效果和盆栽防效，并对其进行了种类鉴定。结果表明，菌株A-29发酵滤液原液、5倍液和10倍液处理南方根结线虫后，2龄幼虫的致死率在24 h和48 h后达71.09%～95.45%，卵的孵化抑制率4 d时为59.25%～87.86%，其死亡率随处理浓度的提高而增加；菌株A-29发酵液处理60 d后对番茄根结线虫的防治效果达75.00%，番茄植株鲜重、根系干重和植株高度分别增加38.41%、33.52%和20.01%；根据菌株A-29的形态特征、生理生化特征、16S rRNA基因序列及其系统发育关系，将其鉴定为假格里尼翁苍白杆菌Ochrobactrum pseudogrignonense。研究表明，菌株A-29不仅对南方根结线虫具有良好的致死效果，而且对番茄植株具有明显的促生作用，是一株具有应用前景的生防菌。     

氟吡菌酰胺对南方根结线虫的作用效果

为明确琥珀酸脱氢酶抑制剂类(SDHI)杀线剂氟吡菌酰胺对南方根结线虫Meloidogyne incognita的作用效果,在室内盆栽条件下研究不同剂量、不同施药时期该药剂对线虫侵入、根结和雌虫数量以及产卵量的影响。结果显示:在黄瓜幼苗移栽前进行土壤处理,氟吡菌酰胺施用剂量为31.25μg/株时,每株2龄幼虫侵染数量和根结数量分别为11.3条和6.4个,相比对照处理显著减少;在接种南方根结线虫后0～11 d,以施药量为125μg/株的氟吡菌酰胺进行灌根时,可大幅减少根结数量,每株根结数量减少至12.8～22.5个,同时,施药后根系内未见成熟雌虫产生;在接种后15 d,以施药量为250μg/株的氟吡菌酰胺进行灌根时,可大幅减少根内成熟雌虫数量,每株雌虫数量减少至16.9条;接种后20 d施药,施药量为500μg/株时可大幅减少根部产生的根结线虫卵块数量,每株卵块数量减少至18.9个。表明氟吡菌酰胺能抑制土壤内线虫对黄瓜根系的侵染并抑制根内线虫发育,但随着施药时间的推迟,防治已侵入根系的线虫需增加施药剂量,在生产上使用氟吡菌酰胺防治根结线虫病应在作物移栽前或线虫侵染早期施药效果更好。     

活性氧与木质素对细菌Sneb825诱导番茄抵抗南方根结线虫侵染的响应

 根结线虫病严重威胁各类蔬菜作物的生产,是世界上最难防治的土传病害之一。利用生防细菌能够有效地控制蔬菜根结线虫种群数量并降低危害。荧光假单胞菌Sneb825是本实验室筛选出的对南方根结线虫病具有较高防效的生防细菌。本研究通过盆栽试验、裂根试验和温室试验验证了荧光假单胞菌Sneb825诱导番茄抗南方根结线虫侵染的防治效果;通过酶联免疫法(ELISA)和实时荧光定量PCR检测了番茄根系内活性氧与木质素含量及其相关基因表达量的变化。研究发现,Sneb825菌株发酵液不但能够有效降低南方根结线虫对番茄的侵染,而且对番茄植株有显著的促生作用。Sneb825菌株发酵液灌根处理并接种南方根结线虫二龄幼虫后,番茄根系内活性氧(10 dpi)和木质素含量(5 dpi)显著高于空白对照;活性氧合成相关基因RBOH1(10 dpi)和过氧化物酶基因Ep5C(10 dpi)以及木质素合成相关基因Tpx1(5 dpi)的表达量均达到最高值。研究结果表明活性氧和木质素的大量积累是荧光假单胞菌Sneb825诱导番茄抑制南方根结线虫侵染的防御对策之一。荧光假单胞菌可以有效的防治根结线虫病,在农业生产实践中具有潜在的应用前景。     

盐类对南方根结线虫迁移能力和侵入能力的影响

为探讨无机盐和有机盐对南方根结线虫的作用方式,在室内利用沙柱法和染色法测定了二者对南方根结线虫2龄幼虫迁移能力及侵入番茄根部能力的影响。结果表明,随着各盐处理浓度的增加,南方根结线虫2龄幼虫的迁移能力和侵入能力显著降低。在4μg/m L KSCN、C6H8O7、KCl、KH2PO4、KHCO3和Mn SO4·H2O沙柱中,15 d后2龄幼虫的平均迁移距离最小,分别为0、0.33、0.52、0.53、0.55和0.58 cm,而对照为0.94 cm。2龄幼虫在Ba NO3、K2HPO4、KHCO3、Cs Cl和KSCN各浓度沙柱中的平均迁移距离均小于0.94 cm。2μg/m L NH4NO3、KH2PO4、(NH4)2CO3、Cs Cl、(NH4)2SO4、Na SCN和NH4SCN处理15 d后,2龄幼虫对番茄根部的侵入率最低,分别为1%、2.33%、1.33%、2%、2%、1%和1.67%。表明对2龄幼虫侵入番茄根部抑制效果最明显的盐为NH4NO3、KH2PO4、(NH4)2CO3、Cs Cl、(NH4)2SO4、Na SCN和NH4SCN。     

石榴枯萎病菌拮抗放线菌对南方根结线虫的毒力

从云南蒙自万亩石榴园、建水石榴园采集的土样中分离筛选得到对石榴枯萎病菌有较强拮抗活性的放线菌,其中菌株JS1对石榴枯萎病菌的室内抑菌半径为11mm。测定了菌株JS1发酵液对南方根结线虫的抑杀活性,结果表明,50%JS1菌株发酵液处理南方根结线虫卵6d,卵孵化率与对照相比降低了51.67%;50%JS1菌株发酵液处理南方根结线虫2龄幼虫72h,2龄幼虫的校正死亡率增加了88.10%;菌株JS1兼有拮抗石榴枯萎病菌及抑杀南方根结线虫的活性。结合菌株JS1在鉴定培养基上的培养特征、形态学观察及16SrDNA序列分析,将JS1初步鉴定为壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)。     

PGPR对番茄南方根结线虫病的影响

于温室盆栽条件下初步研究了4种根围促生细菌（PGPR）对番茄植株生长和南方根结线虫Meloidogyne incognit病发生情况的影响。结果表明接种多粘芽孢杆菌Bacillus polymyxa或芽孢杆菌菌株B697的番茄植株高度、地上部和地下部干重均显著大于对照,而巨大芽孢杆菌B. megaterium和固氮螺菌Azospirillum sp.菌株A135无促生作用。接种多粘芽孢杆菌＋南方根结线虫和B697菌株＋南方根结线虫两处理的二龄幼虫数、雌虫数、线虫总数、根上卵囊数、卵囊含卵量、发病率和病情指数显著低于只接种南方根结线虫的对照。多粘芽孢杆菌、B697菌株、巨大芽孢杆菌和A135菌株对南方根结线虫的防效分别达65.4%、68.2%、53.8%和53.8%。     

红灰链霉菌HDZ-9-47对番茄生长及其防御酶的影响

 红灰链霉菌Streptomyces rubrogriseus HDZ-9-47分离自根结线虫的卵,它既可寄生南方根结线虫,又可产生具杀线虫活性的代谢产物。本研究通过田间试验评价了HDZ-9-47发酵液对南方根结线虫的防治效果,以及对番茄产量和品质的影响;并测定了施用HDZ-9-47对番茄根部几种防御酶的影响。结果表明,在番茄移栽90 d后,穴施HDZ-9-47发酵液处理的防效达61.5%,并且促进番茄增产17.9%,增加了番茄果实中可溶性糖的含量,但对番茄茎粗无显著影响。此外,施用HDZ-9-47发酵液可提高番茄根部多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,进而诱导番茄产生抗性。     

南方根结线虫Me3毒性与非毒性群体对寄主趋向性和侵染能力的比较

 探究南方根结线虫Me3毒性与非毒性群体对抗感寄主趋向性和侵染能力,为揭示毒性群体致病机理及防治根结线虫策略提供理论依据。使用以水琼脂为介质的研究方法,通过对比分析辣椒抗病品种HDA149和感病品种茄门根尖附近聚集的2龄幼虫(J2)数量,来揭示南方根结线虫对抗感辣椒品种根尖的趋向性效应,并利用实时荧光定量 PCR 检测侵入到辣椒根系的毒性与非毒性线虫数量,对其侵染能力进行比较。J2 趋向性试验结果显示,在相同的时间点,HDA149 和茄门辣椒根尖处附近聚集的毒性群体 J2 数量总是显著多于非毒性群体的 J2数量;J2 对抗感辣椒的选择性结果表明,不论是毒性群体还是非毒性群体的 J2,在相同的时间点,茄门根尖附近聚集的线虫数量显著多于HDA149根尖附近的线虫数量;荧光定量 PCR 检测线虫侵染结果显示,毒性群体 J2侵入到辣椒根系的数量相对非毒性群体的 J2 更多。总之,相比南方根结线虫Me3非毒性群体,毒性群体的 J2 对寄主根系有较强的趋向性,并且侵染效率更高;相比于抗性寄主,Me3毒性群体和非毒性群体的 J2 对感病寄主有更强的选择性。     

响应面法优化根结线虫生防真菌Snef5的发酵工艺

为提高生防真菌Simplicillium chinense Snef5的杀线虫活性,本研究采用响应面法对其发酵条件进行优化。首先,采用Plackett?Burman法筛选出有显著效应的3个因素：初始pH值、蔗糖和MgSO₄·7H₂O用量,而后通过Box?Benhnken设计和响应面分析法对其进行分析,获得了优化的最佳初始pH值为6.74,蔗糖含量4.19%,MgSO₄·7H₂O含量0.04%。经摇瓶和发酵罐发酵验证,该理论预测值与实测值无显著差异;优化后的发酵液杀线虫活性与原始发酵液相比,摇瓶发酵与30 L发酵罐产出的发酵液对南方根结线虫2龄幼虫的致死率分别提高了20.6%和21.3%,显示出较好的优化效果。试验结果对生防真菌的发酵及实际应用具有重要指导作用。     

青枯雷尔氏菌无致病力hrpB突变菌株的纯化分离及其异质性研究

获得纯度高的青枯雷尔氏菌无致病力菌株,是研发青枯病植物疫苗和防治青枯病害的一种新途径。作者以青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91为出发菌株,通过对hrpB基因敲除,获得无致病力突变菌株FJAT-91ΔhrpB。高效离子交换色谱分离结果表明:FJAT-91和FJAT-91ΔhrpB色谱峰型不同,主要表现在峰的保留时间上,FJAT-91只有单一色谱峰,保留时间为6 min;FJAT-91ΔhrpB有P_1和P_2 2个色谱峰,保留时间分别为0.6 min和4.5 min。利用高效离子交换色谱对FJAT-91ΔhrpB进行纯化,获得只有P_1峰的高纯度菌株FJAT-91ΔhrpB-P。FJAT-91ΔhrpB和FJAT-91ΔhrpB-P与其出发菌株FJAT-91的菌落和菌体形态差异明显。致病力测定结果表明:FJAT-91接种4 d番茄植株开始发病,10 d发病率达100%;FJAT-91ΔhrpB和FJAT-91ΔhrpB-P接种20 d均未发病。防效试验结果表明:纯化后的菌株FJAT-91ΔhrpB-P对番茄青枯病的防效(81.64%)比未纯化FJAT-91ΔhrpB防效(61.04%)提高了33.75%。本研究获得一株高纯度的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株FJAT-91ΔhrpB-P具有良好的生防潜力。     

日本曲霉ZW1发酵滤液的杀线虫活性和发酵条件优化

根结线虫是一类严重为害作物的寄生线虫，分布于世界各地，且寄主范围广。前期试验表明，日本曲霉Aspergillus japonicus ZW1发酵滤液对南方根结线虫Meloidogyne incognita 2龄幼虫（J2）具有毒杀作用，发酵过程中产生表面光滑球形菌丝体和表面辐射状球形菌丝体，且两种菌丝体发酵滤液的杀线虫效果具有显著差异。表面光滑球形菌丝体的发酵滤液处理南方根结线虫J2的校正死亡率在24 h达100%，显著高于表面辐射状球形菌丝体发酵滤液处理的死亡率（12.7%）。本研究通过对菌株ZW1发酵的温度、转速、培养基、光照和黑暗等条件优化表明，菌株ZW1的最优培养温度25℃和转速150 r/min，以Czapek培养基为基础培养基的最优碳源为蔗糖30 g/L和氮源KNO₃3 g/L，光照和黑暗条件下培养不影响菌株ZW1杀线虫活性；评价煮沸和4℃保存发酵滤液的杀虫效果结果表明，发酵液杀线虫活性随着贮藏时间发生变化，发酵液煮沸对菌株ZW1发酵液的杀线虫活性无影响，4℃保存1年的发酵滤液处理J2的校正死亡率仍保持87.8%。菌株ZW1代谢产物对南方根结线虫J2具有良好的毒杀作用，值得进一步研究和开发利用。     

防治南方根结线虫的根瘤内生细菌的筛选及鉴定

根结线虫的严重发生给农作物生产造成巨大经济损失，生物防治是控制该病的一种安全有效措施。本研究从448株根瘤内生细菌分离株中筛选出3株对南方根结线虫有较好防效的生防细菌Sneb1994、Sneb1995和Sneb2000，3个菌株发酵滤液对南方根结线虫2龄幼虫（J2）均有高毒杀活性，处理24 h校正死亡率达85%以上，同时对卵孵化具有抑制作用，并可促进番茄种子生长。盆栽试验结果表明，3个菌株发酵液灌根处理均能显著减少根结数和卵囊数，相对防效为37.95%~44.51%，同时促进番茄植株的生长。经形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，鉴定菌株Sneb1994、Sneb1995和Sneb2000分别为氧化微杆菌Microbacterium oxydans、油菜假单胞菌Pseudomonas brassicacearum和蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus。氧化微杆菌为首次报道对根结线虫有效的生防菌株。这些根瘤内生细菌菌株的发掘，为植物线虫病害的生物防治提供了新的微生物资源。     

寄生于南方根结线虫卵的长梗木霉几丁质酶基因TlChi46的克隆

为进一步筛选高效寄生线虫真菌和阐明其寄生线虫卵的机理,本研究从湖北省烟草南方根结线虫雌虫分离到1株具高效生防潜力的菌株HBF1。形态学、rDNA-ITS和翻译延长因子tef1-α序列分析鉴定该菌为长梗木霉菌Trichoderma longibrachiatum,其对南方根结线虫卵第10 d寄生率为80.45%。通过简并引物设计和RACE技术克隆其几丁质酶基因,分析该基因序列及与其他几丁质酶的同源性。该菌是1株可以产生几丁质酶的南方根结线虫卵寄生真菌,第10 d几丁质酶的活性达到高峰,为24.88μmol/h/mL。本研究首次从长梗木霉HBF1菌株中克隆到1个几丁质酶基因TlChi46,该基因DNA全长1 793 bp,含3个内含子和1个1 272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸,理论分子量45.9 kDa,等电点5.23。同源性比对表明和昆虫寄生菌几丁质酶的亲缘关系较远。从长梗木霉HBF1中克隆得到的几丁质酶基因编码的几丁质酶的功能域可供进一步研究,高效产几丁质酶并有效寄生南方根结线虫卵的长梗木霉对南方根结线虫具有良好的生防潜力。     

象耳豆根结线虫对抗病番茄品种VFNT的致病性研究

 象耳豆根结线虫是近年在我国发现的一种扩散迅速、寄主广泛、致病性强的根结线虫。为探究象耳豆根结线虫的强致病性原因,本研究用象耳豆根结线虫和南方根结线虫分别接种抗线虫番茄品种VFNT和感病番茄品种Rutgers,30 d后象耳豆根结线虫对VFNT和Rutgers的累计侵入率分别为14.1%和19.2%、虫瘿率为62.5%和81.6%,而此时南方根结线虫累计侵入率为0%和18.8%、虫瘿率为0%和68.5%,象耳豆根结线虫的侵染力和致病力显著强于南方根结线虫;通过侵染抗病番茄品种VFNT的病理切片以及根尖侵染早期胼胝质、活性氧染色发现象耳豆根结线虫的侵染不会激活Mi-1基因诱导的特异性抗性,在侵染早期南方根结线虫引起的胼胝质沉积量在72 h最大,是象耳豆根结线虫的2.0倍;体外H₂O₂应激测试发现,H₂O₂浓度为10～80 μmol·L^-1象耳豆根结线虫对H₂O₂的耐受性显著强于南方根结线虫。象耳豆根结线虫具有强致病性的原因可能是:具有更强的侵染力和活性氧耐受力;侵染不会激活Mi-1基因诱导的特异性抗性且侵染引起的胼胝质的积累量较低。