“单克隆抗体”及其在植物病理学中的应用

植物病害的诊断和病原物的鉴定常采用血清学方法,尤其是酶联免疫吸附技术具有特异性强、灵敏度高、简便易行等优点,更被广泛应用。但在制备抗血清过程中需要高纯度的抗原,且每只动物所产生的抗血清数量有限,难以获得对病原物种以下株系、菌系或亚型特异性的抗体,以致在科研和生产应用上受到一定限制。     

应用酶联免疫吸附法鉴定粘虫的捕食性天敌

试验采用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定捕食性天敌的消化道内容物。ELISA 方法敏感、快速、便于应用。用此法鉴定粘虫低龄幼虫抗原的最小检出量为0.1mg(虫重)/ml,经吸附处理的抗血清对粘虫幼虫具有高特异性而与麦蚜和天敌无交叉反应。粘虫幼虫被丁纹豹蛛取食后的最长可测时间为9.5小时(食1头)和23.5小时(食3头)。对麦田中12种天敌的鉴定结果表明:七星瓢虫和蜘蛛是粘虫低龄幼虫的主要捕食性天敌。ELISA 结果与室内测定的天敌捕食量作了比较。     

一种新的适用于ELISA的抗血清纸片保存法

用特异性抗血清制备的抗血清纸片应用于酶联免疫吸咐实验（ＥＬＩＳＡ），取得了良好的结果。目前已将抗血清纸片用于南芥菜花叶病毒（ＡｒＭＶ）、番茄环斑病毒（ＴｏｍＲＳＶ）、烟草环斑病毒（ＴＲＳＶ）、南方菜豆花叶病毒（ＳＢＭＶ）等进境植物危险性病毒的检测，取得与使用冻干保存抗血清相同的效果。应用抗血清纸片方便、经济、便于保存和邮寄。     

酶联免疫技术检测玉米弯孢菌叶斑病的研究

本文通过提取玉米弯孢菌叶斑病病原菌蛋白质，免疫家兔制备抗血清，用不等弯孢菌、玉米小斑病菌，玉米圆斑病菌和玉米大斑病菌（与弯孢菌相似或相近）蛋白吸附除去抗血清中的交叉反应抗体，提高了抗体的特异性，建立了酶联免疫检测玉米弯孢菌叶斑病的技术，应用ABC-ELISA和间接ELISA检测玉米弯孢菌叶斑病，比较了两种方法的灵敏性和特异性。结果显示ABC-ELISA较间接ELISA检测灵敏度高2到5倍。     

ELIA—异种动物抗体双夹心法检测玉米细菌性枯萎菌的研究

前言酶联免疫吸附技术(Enzyme Linked Immunosorbent assay简称ELISA)自1976年在植物界问事以来,已获得日益广泛的应用,方法也逐渐改进和完善,充分体现出它灵敏度高、特异性强、快速、准确之优越性。本试验试图利用同种抗原免疫两种动物制备特异抗体,和市售优质廉价的酶标记物合组ELISA-异种动物抗体双夹心试验,既保持双抗体法灵敏度高、特异性强的特点,又省去制备标记抗体的烦琐手续,也降低了成本,使ELISA检测技术更易于推广应用。     

除草剂酶联免疫吸附测定研究进展

酶联免疫分析技术具有方便快速、特异性强、灵敏度高等优点,近年来广泛应用于农药残留检测.本文介绍了酶联免疫分析技术在除草剂残留检测中的应用研究进展,分别介绍了各类除草剂的半抗原合成方法以及抗体的灵敏度,探讨了酶联免疫吸附分析法存在的问题和应用前景.     

应用血清学技术研究捕食者与猎物关系的现状及问题

本文介绍近40年来国内外学者应用血清学技术,研究捕食者与猎物之间的关系;并评价了几种试验方法,认为酶联免疫吸附试验技术的灵敏度及特异性较高。     

捕食性天敌控害能力评价方法进展

生物防治在害虫治理中的作用日益凸显,捕食性天敌对害虫猎物的捕食作用作为生物防治的主要组成部分,其捕食效果评价不可或缺。定性或定量评价捕食性天敌的控害作用是生物防治研究的一项重要内容。传统的捕食性定量方法研究大都局限于室内开展,与田间昆虫天敌的实际捕食量有所出入。昆虫分子生物学技术的发展为昆虫定量评价提供了支持,本文全面总结了农业生产科学研究中常用的捕食性昆虫定量评价方法,详细阐述了这些评价方法的原理、方法及应用实例,并进一步提出在未来的研究中应该扬长避短,根据试验对象的生物习性、试验条件的影响因素、试验目的的要求,将不同方法结合起来发挥各自优点,使捕食者捕食猎物的定量评价结果更能接近田间发生的实际情况。这些方法和技术将有助于更好地发挥自然天敌的控害作用,有效开展害虫生态调控,进一步推动生物防治相关方法的创新与应用。     

快速液相酶联法鉴定水稻细菌性条斑病带菌稻种

以海南、浙江和江西稻区的细菌性条斑病(以下简称细条病。编者)混合菌株为抗原免疫家兔,获得了效价为9000倍的抗血清。该抗血清特异性强,对常见十余种植物病原细菌基本上无交叉反应;以酶标A蛋白为关键试剂建立的液相酶联法的灵敏度约10~3cfu/ml;样品检测批间和批内的变异系数分别小于24.5％和15.2％。1990～1991年利用该方法检测了海南、浙江、江西及江苏的419份稻种,对除江苏外的363份样品的     

用毕赤酵母表达李属坏死环斑病毒外壳蛋白基因及表达产物抗血清的制备与研究

用RT-PCR的方法克隆李属坏死环斑病毒的外壳蛋白(CP)基因,然后将其连接到pGEM-T载体上,得到pGEM-T-PNRSV重组载体,然后将其克隆到真核表达载体pPIC9K上,转化毕赤酵母GS115菌株后,在甲醇的诱导下表达外壳蛋白,表达产物经过SDS-PAGE及Western-blot分析,结果表明该病毒的CP基因在毕赤酵母中得到了高效表达,回收表达蛋白并免疫家兔,获得PNRSV特异性抗血清共计40mL,经过间接酶联免疫吸附法测定其效价为3.2×104,本研究利用基因克隆的方法来制备PNRSV抗血清,完全避免了用该病毒的繁殖来制备抗血清而导致该病毒扩散蔓延的风险。     

西瓜花叶病毒抗血清制备及其应用

 西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus, WMV)是危害葫芦科作物的重要病毒。制备特异性强、效价高的抗血清对快速准确检测和鉴定WMV具有重要意义。本研究将WMV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV获得pEHISTEV-WMV-CP。将pEHISTEV-WMV-CP转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,成功表达出分子量约为36 kDa的蛋白,与预期WMV CP大小一致。切胶回收WMV CP,与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后免疫健康新西兰大白兔。Western blotting结果表明,制备的抗血清与WMV CP有反应,与同属的番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus, ZYMV)和烟草花叶病毒属的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)均无反应。酶联免疫吸附测定(PTA-ELISA)结果表明,本研究制备的WMV抗血清效价为1∶8 192,并且能够检测稀释512倍的病毒汁液。利用该抗血清对田间采集的10个RT-PCR检测为阳性的样品进行检测,全部呈现阳性。本研究利用大肠杆菌表达的CP制备的WMV抗血清具有较高的特异性和灵敏度。研究结果为WMV的快速检测和鉴定奠定了基础。     

香蕉束顶病毒海口分离物Rep基因的克隆、原核表达、抗血清制备及检测

［目的］ 对香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物起始蛋白(replication initiation proteins, Rep)基因进行克隆、原核表达、抗血清制备,为BBTV有效的检测及分子流行病学等研究奠定基础。［方法］ 以海口地区染病香蕉幼嫩假茎和叶片的总DNA为模板,通过PCR技术克隆BBTV海口分离物的起始蛋白基因,连接到表达载体并进行大肠杆菌原核表达,制备高效价特异性抗血清。［结果］ 应用PCR方法从染毒香蕉幼嫩假茎和叶片总DNA中扩增复制rep基因,回收目的片段后经酶切,获得了含BBTV Rep基因的重组质粒pET32b Rep。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3),经不同的时间、温度及IPTG浓度优化,12% SDS PAGE电泳分析,在20 ℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4h,最终获得大量的可溶性融合蛋白。将可溶性蛋白上清液经Ni2+ NTA亲和层析柱纯化,得到高纯度的融合蛋白。用纯化后的融合蛋白免疫家兔,获得了BBTV Rep蛋白抗血清。以融合蛋白做抗原,间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。以田间样品做抗原时,结果表明抗血清最佳工作浓度为1∶1 000。Western blot鉴定结果表明抗血清能与融合蛋白特异性结合。［结论］ 利用Rep基因制备的特异性抗血清在BBTV病毒粒体的组装机制研究及病毒病诊断上具有重要的应用价值。     

大豆上烟环斑病毒的塑珠酶联免疫吸附测定

 酶联免疫吸附测定法,灵敏度高,使用抗血清仅微量,是近年来用于诊断、鉴定植物病毒的先进方法之一。这一技术需要纯度高的抗血清,采用蛋白质A-琼脂糖CL-4B柱层析纯化后的抗烟草环斑病毒抗血清(抗TRSV-IgG),纯度高、灵敏,很适用于塑珠酶联免疫吸附测定法(Bead-ELISA)的抗体和酶标抗体的材料。     

苹果茎痘病毒外壳蛋白的原核表达及抗血清制备

利用基因重组技术将苹果茎痘病毒Applestempittingvirus(ASPV)完整cp基因在大肠杆菌中表达,以纯化蛋白为抗原免疫新西兰兔制备其抗血清,并采用ACP-ELISA法测定其效价和应用PAS-ELISA法对其抗血清的有效性进行初步鉴定。结果显示,cp基因获得了高效表达,表达产物与Anti-His抗体产生特异性免疫反应。制备的抗血清具有较强的特异性,效价为1:800。PAS-ELISA检测结果显示,9个苹果样品中有8个样品与RT-PCR检测结果一致,仅1个样品RT-PCR检测为阳性,而PAS-ELISA检测为阴性。表明所制备的抗血清具有一定的应用潜力。     

水稻白叶枯病菌的血清学研究

 用戊二醛固定的5个水稻白叶枯菌株制备了5个抗血清,利用琼脂双扩散、试管凝集、免疫电泳和酶联免疫吸附试验研究了107个水稻白叶枯菌株血清学反应的差异,将它们分为三个血清型。属于Ⅰ型的菌株(OS-225、F₄等)占供试菌株的95%,分布于全国各稻区;归属于Ⅱ型的菌株(OS 209、OS-109等)占5.6%,主要来自南方边远地区;Ⅱ型仅1个菌株(G₈),占0.9%,来自广西东部;其中还有两个菌株和上述抗血清均不能反应,暂不能归型,来自福建。血清型和致病型之间的相关性不用戊二醛固定、热处理等5种不同方法处理菌体后制备的抗血清之间,表现出一致的反应特异性和相似的"型"专化性。免疫电泳结果表明,不同血清型的免疫源组成是不同的,Ⅰ型仅具中性免疫源,Ⅱ型具中性及偏碱性免疫源,而Ⅱ型则具中性及偏酸性两种免疫源。
比较了反向间接血凝、酶联免疫吸附和免疫荧光反应等方法检测病菌的灵敏度,以免疫荧光试验(IF)为最灵敏,可检测到每毫升10³细胞,ELISA其次(10^4-5cell/ml),反向间接血凝法为10^6-7cells/ml,双扩散法最差,只有在高达10⁸ cells/ml时才有阳性反应。     

麦穗鱼脑AChE间接非竞争ELISA定量分析法的建立

用PEG2000双水相萃取、 DEAE-Sephadex A-50和Sephadex G-200方法分离纯化麦穗鱼Pseudorasbora parva脑中的乙酰胆碱酯酶(AChE), 并制备了兔抗麦穗鱼脑AChE抗血清。用兔抗麦穗鱼脑AChE抗体连接抗原, 建立了定量分析麦穗鱼脑AChE的间接非竞争酶联免疫吸附法(Indirect and non-competitive ELISA), 此法操作简便、灵敏度高, 适用于定量检测。该方法的建立有利于AChE在环境科学和农药学研究领域的进一步研究和应用。     

白草花叶病毒CP基因在大肠杆菌中的表达及抗血清的制备

 将白草花叶病毒(Pennisetum mosaic virus,PenMV)的外壳蛋白(CP)基因连接到表达载体pET22b (+)上,获得重组子pET-PCP。SDS-PAGE和Western blotting分析表明,经IPTG诱导后,含pET-PCP的大肠杆菌BL21(DE3) pLys产生分子量为36 kDa的融合蛋白。以Ni²⁺亲和层析柱纯化该蛋白,并以其为抗原免疫德国大白兔制备了特异性较强的抗血清。微量免疫沉淀法测其效价为1:1 024,酶联法(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)测定的效价为1:8 192。该血清可替代常规病毒粒子所制备的抗血清,用于检测PenMV。     

辣椒轻斑驳病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)属于烟草花叶病毒属,是辣椒的重要病毒种类之一。将PMMoV的外壳蛋白(cp)基因克隆至原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组PMMoV CP蛋白以可溶形式表达,纯化后获得分子量约35 kDa的融合CP蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫新西兰兔制备了PMMoV CP特异性抗血清。Western blot检测结果表明该抗血清与重组CP蛋白发生强烈的免疫反应,间接酶联免疫吸附测定(ID-ELISA)结果显示该抗血清针对重组CP蛋白的效价达1∶25 600,针对PMMoV病汁液的效价达1∶4 000,检测灵敏度为1∶3 200,且该抗血清不与PMMoV同属或不同属的其它6种病毒汁液发生免疫反应,具有较好的特异性。利用该抗血清对42份田间辣椒病样进行检测,阳性率达38%,与进口商品化试剂盒检测结果一致,说明该抗血清可用于PMMoV的ELISA诊断。     

苏云金杆菌HBF-1菌株在土壤中毒蛋白含量的ELISA检测

以苏云金芽孢杆菌HBF-1菌株中分离纯化的高特异性杀虫蛋白作为抗原，免疫新西兰白兔制备出多克隆抗体，其效价可达到16000。应用制备的特异性抗体建立了间接酶联免疫吸附测定法（ELISA），检测不同土壤样品中Bt毒蛋白含量。初步结果表明，该方法能够检测土壤中Bt毒蛋白的含量，因土壤理化特性及组成成分的不同，检测到的毒蛋白含量也略有不同，河沙中的蛋白检测量最低，只有12．53％；另一种沙壤混合物中检测量达到76.16％。     

用酶联免疫吸附技术（ELISA）检测水稻细菌性条斑病菌的研究

兔抗 Xanthomonas campestris pv.oryzicola 抗血清经提纯得特异性免疫球蛋白 IgG,用过典酸钠法标记获辣根过氧化物酶标兔抗 X.c.pv.oryzicola IgG 结合物。ELISA 双抗体夹心法和间接法的灵敏度分别为10~2～10~3个菌/ml 和10~4～10~5个菌/ml,这两种方法检测稻谷带菌的结果与用七叶苷选择性培养基分离及琼脂双扩散验证结果一致,双抗体夹心法的灵敏度和特异性比间接法高,从制样到完成检测约需40小时。检测结果不但可以目测定性,还可用酶联免疫检测仪所测得的 OD 值在本试验制作的曲线上查出稻谷带菌量。