雄性黄颡鱼芳香化酶基因mRNA在熟期组织中表达分析

在水温分别为20(常温对照组)、25、30℃条件下,采用RT-PCR方法,研究性腺成熟期雄性黄颡鱼组织中P450芳香化酶(P450aromA和P450aromB)的mRNA表达水平,同时测定性腺成熟系数(GSI)、肝重指数(HSI)、肥满度(CF)和血浆睾酮(T),雌二醇(E2)含量.结果表明,P450aromA在性腺...     

黄颡鱼脑P-450芳香化酶基因的克隆和组织表达

P-450芳香化酶（P450arom）是催化雄激素生物合成雌激素的关键酶。本文采用RT-PCR和RACE法，首次分离和克隆了黄颡鱼脑P450芳香酶基因HP450aromB，并使用荧光实时定量RT-PCR对其组织表达进行了研究。结果表明HP450aromB cDNA全长2080bp（不包括poly（A）），5′端非翻译区有25bp，3′端555bp（不包含poly（A）），阅读框（open reading frame，ORF）1500bp，编码500个氨基酸，推测的蛋白质分子量为56kDa。同源性分析显示，HP450aromB的氨基酸序列与其它鱼脑P450arom具有70％以上的同源性，与其它鱼卵巢P450arom为60％左右同源，与人胚盘和鸡卵巢P450arom则为50％左右同源；但芳香化酶高保守区包括Ⅰ-螺旋区，芳香化酶特异保守区Ⅱ及血红系结合区Ⅲ和其它鱼芳香化酶相比同源性分别为83％～96％，78％～86％和85％～100％。系统发育分析表明HP450aromB与鱼类脑P450arom属于同一分支的，并且也显示了黄颡鱼和鲶鱼分类地位最近，这和传统的分类一致。实时定量RT-PCR研究显示，HP460arom B在前脑，下丘脑，垂体、卵巢、精巢均有表达，在肝脏没表达，表达量脑部高于性腺，但雌雄鱼脑部HP450aromB的表达总量没显著差异。     

条斑星鲽CYP19a基因克隆及其在雄鱼生殖周期中的表达

细胞色素P450芳香化酶(P450arom)作为P450细胞色素酶超家族中的一员,是性类固醇生成途径中的末端酶,能够将雄激素转化为雌激素。在大多数脊椎动物中,P450arom由CYP19单基因编码。但是在鱼类中存在两种P450芳香化酶,分为性腺型芳香化酶(P450aromA)和脑型芳香化酶(P450aromB),它们由不同的基因(CYP19a和CYP19b)编码,分布在不同的组织。通过简并引物扩增及RACE cDNA扩增克隆,在国内外首次获得全长为2167bp的条斑星鲽CYP19a cDNA序列,并将推测的氨基酸序列与其它物种P450arom氨基酸序列进行多重比较,发现存在跨膜螺旋区、I-螺旋区、Ozol肽区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区。通过RT-PCR分析了P450aromA mRNA在条斑星鲽不同组织中的表达情况,结果表明,CYP19a基因主要在脑、卵巢和精巢中表达,其次在肠、肝脏、肾脏也有少量表达。同时也分析了P450aromA mRNA在处于不同发育期的精巢中的表达情况,发现在Ⅱ期精巢中表达量最高,在Ⅴ期精巢中表达量最低。     

黄鳝脑芳香化酶基因cDNA的克隆及组织表达特异性分析

根据NCBI数据库报道的黄鳝芳香化酶基因的gDNA序列,设计了一对特异性引物.用Trizol试剂盒提取黄鳝脑总RNA,反转录获得cDNA第一条链,进行PCR扩增.扩增产物经过回收、连接、测序后得到了一条长1514 bp的芳香化酶基因cDNA序列.同源性比较表明该基因属于脑型P450aromB,与其他鱼类脑型P450aromB的同源性较高(>70%),与性腺型P450aromA的同源性较低(<60%),与自身性腺型芳香化酶同源性为59.5%.采用RT-PCR的方法对该基因在雄性黄鳝的各组织表达情况进行了分析,结果表明,该基因的转录本较高的表达于脑和精巢中,较低的在皮肤中表达,而在肝脏、心脏、小肠、肌肉等组织中没有检测到该基因的表达.     

奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶基因的克隆及其表达

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)法分离出奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)卵巢芳香化酶(P450aromA)的全序列,得到1784bp的全长eDNA,包括38bp5'非翻译区,1566 bp阅读框以及含Poly(A)信号(AATAAA)的167bp3'非翻译区[不包括Poly(A)].阅读框共编码521个氨基酸,推算的蛋白质分子量为59kD.同源性分析显示,奥利亚罗非鱼P450aromA的氨基酸序列与其他鱼类性腺芳香化酶(P450arom)具有70%以上的同源性,与其他鱼类脑P450arom有60%左右同源性,但其芳香化酶高保守区包括I-螺旋区、芳香化酶特异保守区和血红素结合区分别与其他鱼类P450arom的同源性高达83%～96%、78%~86%和85% ～100%.系统发育分析表明,奥利亚罗非鱼P450aromA属于鱼类性腺P450arom,分子系统进化树分析结果与根据传统的形态学和生化特征分类结果基本一致.生物信息学分析显示,奥利亚罗非鱼P450aromA基因编码的蛋白无信号肽,无跨膜区域,为非分泌型蛋白.同时还含有多个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基激化位点、N-肉豆蔻酰化位点及蛋白激酶C磷酸化位点.使用Taqman探针法检测P450aromA在奥利亚罗非鱼咸鱼各种组织中的表达.结果发现,P450aromA只在卵巢中表达.同时比较了鱼苗、鱼种和成鱼卵巢中P450aromA的表达差异,结果显示,鱼苗中无P450aromA的表达,成鱼中P450aromA的表达量是鱼种阶段的30倍.     

黄颡鱼卵巢P-450arom基因的克隆及组织表达

P-450芳香化酶（P450arom）是催化雄激素生物合成雌激素的关键酶。本研究采用RT-PCR和RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法，分离和克隆了黄颡鱼（Pelteobasrus fulvidraco）卵巢P450芳香化酶基因HP450arom A，并使用荧光实时定量RT—PCR对其组织表达进行了分析。结果表明，HP450arom A cDNA全长1914bp[不包括poly（A）]，5’端非翻译区有13bp，3’端362bp[不包含poly（A）]，阅读框（Open Reading Frame，ORF）1539bp，翻译成513个氨基酸，计算的蛋白质分子量为58．7kD。同源性分析显示，HP450aromA的氨基酸序列与其他鱼卵巢P450arom具有60％～90％的同源性，与其他鱼脑P450arom为57％-60％同源，与鸡卵巢和人胚盘P450arom则为51％和52％同源；但芳香化酶高保守区包括Ⅰ-螺旋区，芳香化酶特异保守区Ⅱ和血红素结合区Ⅲ和其他鱼芳香化酶相比同源性分别高达68％～97％、78％-91％和71％～100％。系统发育分析表明，HP450arom A与鱼类卵巢P450arom属于同一分支，黄颡鱼和鲇鱼亲缘关系最近，这和传统的分类方法结论一致。荧光实时定量RT-PCR研究结果显示，HP450arom A在前脑、下丘脑、脑垂体、精巢、肝脏中不表达，只在卵巢中表达。这说明HP450arom A的表达具有组织特异性，并可推测其对卵巢发育起着重要作用。与本室分离的HP450arom B在卵巢的表达量相比，卵巢中HP450arom A的表达量是HP450arom B的18．7倍。     

饲料中不同维生素E添加量对黄颡鱼幼鱼生长性能及免疫功能的影响

本研究探讨了饲料中不同维生素E添加量对黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)幼鱼生长和免疫的影响。在以鱼粉、豆粕为蛋白源的基础饲料中分别添加0mg/kg(对照组)、25mg/kg、75mg/kg、125mg/kg和175mg/kg的维生素E配成5种实验饲料。在水温(24.0±3.0)℃下,用上述实验饲料分别饲喂平均体质量约为5.1g的黄颡鱼幼鱼50d。实验结果表明,饲料中维生素E的添加量对黄颡鱼的特定生长率和饲料效率的影响不显著(P0.05);而添加量为175mg/kg时,黄颡鱼摄食率显著降低(P0.05);随着饲料中维生素E添加量的增高,黄颡鱼血浆超氧化物歧化酶(SOD)的活性未产生显著变化(P0.05);添加量为125mg/kg和175mg/kg时,血浆中丙二醛(MDA)的含量显著降低(P0.05);白细胞吞噬指数随添加量升高显著上升(P0.05),而吞噬百分率没有显著变化(P0.05)。综合以上结果,饲料中添加适量的维生素E可适当改善黄颡鱼的摄食,增强黄颡鱼的非特异性免疫力和抗氧化能力,从而提高动物的健康状况。推荐在黄颡鱼幼鱼饲料中添加125mg/kg的维生素E。     

黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)性腺分化的组织学观察

每天采样观察3~60日龄人工养殖的黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco性腺分化和发育的组织学。结果表明:在水温(20±4)℃下,黄颡鱼卵巢的分化明显早于精巢,性腺的分化型为雌性异体型。孵出后14d卵巢开始分化,原始性腺在横切面出现组织突起,逐步形成卵巢腔;雄性分化始于孵出后54d,主要标志是形成输精管原基,进而形成输精管。本研究成果为黄颡鱼的人工繁殖提供了理论依据。     

不同倍性鲫鲤性腺型芳香化酶cyp19a1a基因cDNA的克隆及表达

为研究性腺型芳香化酶P450aromA(cyp19a1a基因编码)在不同倍性鲫鲤卵巢发育过程中的作用,实验采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE),获得了二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤的cyp19a1a基因cDNA全长。结果显示,3种鱼cyp19a1a基因均编码517个氨基酸残基,而且编码的蛋白都包含P450aromA特有的跨膜螺旋区、I-螺旋区、Ozol’s肽区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区。采用RT-PCR分析cyp19a1a基因mRNA在3种不同倍性鱼类组织中的表达情况,结果显示,cyp19a1a基因主要在实验鱼的卵巢中表达,其次在精巢、脑、脾脏有少量表达。采用实时荧光定量PCR对cyp19a1a基因mRNA在不同倍性鱼卵巢中的表达进行分析,结果发现,cyp19a1a基因在不同倍性鱼的非繁殖期卵巢的表达都高于繁殖期卵巢,并且在繁殖期和非繁殖期,cyp19a1a基因在三倍体湘云鲫的表达量高于二倍体红鲫和四倍体鲫鲤。采用免疫组织化学方法对CYP19A蛋白在不同倍性鲫鲤卵巢中的定位进行分析,结果发现,CYP19A蛋白主要定位在滤泡细胞、Ⅳ时相卵母细胞的放射膜上以及Ⅱ时相卵母细胞的卵浆中。研究表明,性腺型芳香化酶在不同倍性鲫鲤卵巢发育过程中的表达存在一定的差异性,三倍体鱼cyp19a1a基因mRNA水平表达异常,推测与其不育有关联性。     

杂交黄颡鱼、雄性瓦氏黄颡鱼和黄颡鱼的形体指数及肌肉营养组成比较分析

为评估商品规格杂交黄颡鱼的食用营养价值,对杂交黄颡鱼[Pelteobagrus fuividraco(♀)×P.vachelli(♂)]、雄性瓦氏黄颡鱼和黄颡鱼商品鱼的形体指数、出肉率和肌肉的营养组成、氨基酸含量及脂肪酸组成进行了比较分析。结果表明,杂交黄颡鱼的肥满度与雄性黄颡鱼无显著差异;杂交黄颡鱼的胴体率、含肉率和脏体比均与雄性瓦氏黄颡鱼及雄性黄颡鱼无显著差异(P0.05)。杂交黄颡鱼肌肉水分含量最高,脂肪含量最低,而蛋白质和灰分含量与雌、雄黄颡鱼均无显著差异;雄性瓦氏黄颡鱼肌肉中水分、蛋白质和灰分的含量较低,脂肪含量最高;杂交黄颡鱼肌肉的氨基酸总量和7种人体必需氨基酸与黄颡鱼无显著差异(P0.05),但均显著高于雄性瓦氏黄颡鱼(P0.05);杂交黄颡鱼肌肉脂肪中C22:6n3的比例和n3系列不饱和脂肪酸总量的比例与雌性黄颡鱼无显著差异(P0.05),但均高于雄性瓦氏黄颡鱼,均低于雄性黄颡鱼。试验表明,杂交黄颡鱼的体形和出肉率与雄性黄颡鱼一致,其肌肉为低脂蛋白食品,营养价值与黄颡鱼接近。     

黄颡鱼肌细胞生成素基因cDNA克隆及其在雌雄个体中的差异表达

为了探究黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)肌细胞生成素(Myogenin,MyoG)基因的组成结构、功能特性以及在雌雄个体组织中的表达差异,本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆获得黄颡鱼MyoG基因1346 bp全长cDNA序列,其中序列包括63 bp的5′非翻译区、521 bp的3′非翻译区和762 bp的开放阅读框(ORF),ORF编码253个氨基酸。氨基酸序列包含MRFs基因家族的Basic结构域和螺旋–环–螺旋(HLH)结构域,不含信号肽,没有跨膜结构,定位于细胞核内。氨基酸序列与蓝鲇(Ictalurus furcatus)同源性高达94.1%,基于氨基酸序列构建的NJ进化树显示黄颡鱼MyoG基因与同属鲇科鱼类关系最近,表明MyoG基因在物种间比较保守。实时荧光定量PCR检测显示,MyoG基因在雌雄个体心脏、肌肉等8种组织中均有表达,但在肌肉中的表达量显著高于其他组织(P0.05),且在雄性中的表达量显著高于雌性(P0.05);Western blot检测MyoG蛋白在雄性肌肉中的表达量高于雌性,推测其可能是造成黄颡鱼雌雄生长差异的因素之一。本研究不仅为黄颡鱼雌雄生长差异和肌肉发育调控提供了研究基础,也为黄颡鱼快速生长新品种(系)选育提供理论参考。     

Effects of aromatizable and nonaromatizable androgens on the sex inversion of red-spotted grouper (Epinephelus akaara)

The effects of aromatizable 17α-methyltestosterone (MT) and non-aromatizable 17α-methyldihydrotestosterone (MDHT) on sex inversion in red-spotted grouper, Epinephelus akaara, were investigated. Fish were implanted with MT, MDHT and MT+AI (aromatase inhibitor, AI) respectively for one month. The results showed that the three treated groups turned into transitional stage with intersex gonads, which contained atretic oocytes and spermatogenic germ cells at all stages of spermatogenesis. The controls did not change sex. The gonads of more than half MT-implanted fish were in early transitional stages of sex inversion, whereas those of more than half MDHT and MT+AI-implanted fish were in late transitional stages of sex inversion. No difference in serum estradiol-17β (E₂) levels between the controls and the treated groups were observed, whereas 11-ketotestosterone (11-KT) and testosterone (T) levels increased in all treated groups. Significantly lower gonadosomatic index (GSI) and gonadal aromatase activity were observed in the treated groups, which were in accordance with the lower mRNA expression of P450aromA. However, P450aromB mRNA expression increased in the MT group, while it did not change in the MDHT group. These results suggest that the sex inversion of red-spotted grouper by MT and MDHT implantation might be due to the suppression of P450aromA gene expression, and resulting in both the decrease of the ovarian estrogen –secretion, as well as the increase in the 11-KT levels. Furthermore, the main reason for MT being less effective than MDHT might be due to partial aromatization of MT to estrogen.     

黄颡鱼的规模人工繁殖试验

１９９８年５月４日至５月３０日在湖北省孝感市猪湖和武汉市大舒特各水产养殖场进行了黄颡鱼较大规模的人工繁殖试验，共进行７次人工催产，其中催化雌鱼６１２尾，计４５．８ｋｇ、雄鱼３８３尾，计４５．９ｋｇ，获鱼卵１５０万粒左右。本文对黄颡鱼的繁殖季节，雌雄比例，注射方法，几种催产激光对黄颡鱼催产效果，流水孵化与静水孵化的效果，人工鱼巢的设置，苗种培育等进行了分析和比较。最后总结了这次黄颡鱼规模人工繁殖４     

3种■体内微量元素测定与比较

测定了3种■(白缘■Liobagrus marginatus、拟缘■Liobagrus marginatoides、黑尾■Liobagrus nigricauda)肝、肾、肌肉和尾鳍4种组织中铬、锰、铁、铜和锌的含量,并将其与鲫(Carassius auratus)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)进行了比较分析。结果显示:鱼体5种微量元素总量由高到低依次为:白缘■、黑尾■、拟缘■、鲫、黄颡鱼;肌肉中5种元素含量由高到低依次为拟缘、黄颡鱼、鲫、黑尾■、白缘■;白缘■对铬和锌的富集作用比较突出,在上述几种组织中肝脏的富集作用最强。     

黄颡鱼甘露糖受体基因的克隆和功能分析

甘露糖受体(MR)隶属凝集素超家族,主要表达于巨噬细胞和未成熟的树突状细胞表面。MR不仅在先天免疫防御中发挥重要作用,还通过参与抗原呈递,激活T淋巴细胞,启动获得性免疫应答过程。本研究采用同源克隆技术获得黄颡鱼甘露糖受体(pf MR)基因,采用荧光定量PCR技术检测MR在正常黄颡鱼体内的分布情况,采用鲖爱德华菌感染黄颡鱼头肾巨噬细胞和甘露聚糖封闭MR方法研究黄颡鱼MR在抗细菌感染中的作用。结果显示,pf MR同团头鲂、草鱼、斑马鱼和尼罗罗非鱼的MR聚为一支。pf MR在所检测的12个组织中均有分布,其在肾脏、脾脏和肌肉组织中表达量较高,在血液中表达量较少。鲖爱德华菌感染黄颡鱼头肾巨噬细胞后,pf MR、IL-1β和TNF-a均被细菌诱导表达,超氧阴离子和一氧化氮的含量也上升,超氧阴离子在感染30 min后即显著上升,一氧化氮在感染12 h后才显著上升。甘露聚糖竞争结合MR,显著抑制巨噬细胞内化GFP标签的鲖爱德华菌,加入EDTA减少内化的荧光强度,加入Ca~(2+)使内化的荧光强度回升。研究表明,黄颡鱼头肾巨噬细胞MR参与鲖爱德华菌的识别和内吞过程,而且依赖Ca~(2+)。     

Promoter analysis of two aromatase genes in the serial-sex changing gobiid fish, Trimma okinawae

Despite numerous endocrine studies on sex change in teleost, no general mechanism that mediates sex change has emerged. The gobiid fish, Trimma okinawae, can change sex in both directions repeatedly. This phenomenon of sex change in goby assigns it as an excellent animal model to elucidate the understanding mechanisms of sex change. In hermaphrodite fishes, estrogen plays a particularly important role in natural and experimentally induced sex change. To investigate the role of estrogen in the serial-sex changing fish T. okinawae, we cloned and analyzed the 5′-flanking regions of P450arom genes from goby genome DNA. Both regions have consensus sequences of TATA, CRE and ERE. Ad4 binding site was restricted in the region of P450aromA. These findings indicate that different regulators control the expression of the two P450arom genes.     

Molecular cloning, characterization expression of P450c17-I and P450c17-II and their functions analysis during the reproductive cycle in males of barfin flounder (Verasper moseri)

P450c17, a key steroidogenic enzyme, plays important roles in the production of sex steroid and cortisol. In teleost, there are two types of P450c17, P450c17-I possessing 17α-hydroxylase and 17, 20-lyase activities, and P450c17-II only possessing 17α-hydroxylase activity. This work describes the molecular cloning of the cDNA encoding the barfin flounder (Verasper moseri) P450c17-I and P450c17-II by means of RT-PCR and 5' and 3' rapid amplification of cDNA ends (RACE) analyses and mRNA expression profiles analyzing by semiquantitative RT-PCR. Respectively, P450c17-I and P450c17-II mRNA levels in the testes correlated with serum testosterone (T) level, as well as gonadosomatic index (GSI) of males during specific stages of spermatogenesis. P450c17-I and P450c17-II mRNA were expressed in the testis and ovary, suggesting that both of them participate in the production of sex steroid in barfin flounder gonads. P450c17-I mRNA was undetectable; in contrast, P450c17-II mRNA was detected at the highest level in the head kidney, meaning that only P450c17-II is involved in the production of cortisol in barfin flounder. The results demonstrated that both of P450c17-I and P450c17-II participate in the production of sex steroid in male barfin flounder gonads.     

通过核基因ITS2片段研究四种鲇形目鱼类进化

采用鲇形目鱼鱼类通用引物扩增了鲇形目鱼类4种鱼,长吻(Leiocassi longirostris)、南方南方大口鲇(Si-lurus meridionalis)、黄颡鱼(Pseudobagrus fulvidraco)、斑点叉尾(Ictalurus punctatus)核DNA的ITS2片段,并构建UPMGA,NJ,ME和MP系统树。结果显示:根据遗传距离,斑点叉尾和黄颡鱼的亲缘关系最近(D=0.0661),接下来是黄颡鱼和南方大口鲇(D=0.1100),南方大口鲇和长吻(D=0.1184),斑点叉尾和南方大口鲇(D=0.1266),黄颡鱼和长吻(D=0.1490),斑点叉尾和长吻的亲缘关系是最远的(D=0.1503)。结果表明:长吻最早分化,其次是南方南方大口鲇和黄颡鱼,而斑点叉尾分化最晚。     

两种免疫增强剂对黄颡鱼生长、消化及免疫性能的影响

将180尾黄颡鱼随机分成3组,即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,每组3重复,Ⅰ组为对照组,投喂基础日粮,Ⅱ、Ⅲ为试验组,分别在投喂基础日粮中添加0.01%的芽孢杆菌与0.01%低聚糖复合制剂(Ⅱ)和1%中草药免疫增强剂(Ⅲ),连续投喂60天,测定了黄颡鱼增重率,成活率及胃肠消化酶,肝胰,血清免疫酶活性。结果显示:与对照组相比,Ⅱ,Ⅲ组均显著提高了黄颡鱼的增重率,成活率(P<0.05)。Ⅱ组胃消化酶,肠蛋白酶和和Ⅲ组胃消化酶活性与对照相比提高显著(P<0.05),但Ⅱ组和Ⅲ组肠淀粉酶活性有所下降。与对照组相比,试验组肝胰ACP,肝胰AKP,肝胰SOD,血清ACP,血清AKP活性均不同程度提高。结果表明:在饲料中添加免疫增强剂,能够提高黄颡鱼的生产性能及消化免疫能力。