近江牡蛎中铝的化学形态分析

为了探究近江牡蛎(Ostrea rivularis)中铝(Al)的形态分布,利用化学连续浸提法结合电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对近江牡蛎总Al质量分数及Al存在形态进行初步研究,并对4种浸提液的浸提条件进行优化。结果显示,其优化参数为0.5 mol·L~(–1)氯化钾溶液70 m L浸提2 h,去离子水70 m L浸提2 h,4 mol·L~(–1)盐酸溶液70 m L浸提2 h,浓硝酸70 m L浸提2 h。此条件下,近江牡蛎整体中Al形态存在有机铝铝离子(Al~(3+))水溶态铝氢氧化铝[Al(OH)_3]难溶态铝的分布规律,约77.36%的Al以难溶态存在,毒性较大的无机Al主要以Al(OH)_3的形态存在,占总Al的15.87%。通过模拟胃肠消化环境,测定近江牡蛎中Al的溶出率,模拟胃液可溶出Al占总Al的8.16%~32.11%,说明由于胃液的酸性和酶的作用,近江牡蛎中的Al在胃液中形态发生变化。     

海藻中铝的化学形态分析

首次对我国主要养殖海藻中的总铝含量进行调查,结果显示海藻中总铝含量差异很大,含量在53.2～2714.6 mg/kg,其中坛紫菜中总铝含量最高。利用连续平衡静态浸提法研究了海带和紫菜中铝的化学形态。研究结果表明,海藻中铝存在多种形态,主要以稳定的、不易被生物体吸收的有机铝(AlONL)形态存在,占总铝的82.0%~87.6%,而毒性较高的无机态铝含量很低,占3.75%～4.94%。本实验进一步证明,以总铝含量作为评价海藻铝食用安全的评价标准具有一定局限性,亟需针对不同形态铝建立不同限量标准,对海藻及其制品进行科学的食用安全评价,以保障海藻产业顺利发展。     

体积排阻高效液相色谱—电感耦合等离子体质谱法测定紫菜中镉(Cd)的形态

运用体积排阻高效液相色谱—电感耦合等离子体质谱联用技术(SEC-HPLC-ICP-MS)分析了紫菜中Cd的存在形态,结果发现,在紫菜水提取液中检测到3种Cd形态,根据其保留时间确定为植物螯合肽(PC)₃-Cd、谷胱甘肽(GSH)-Cd和1种未知小分子有机态Cd,结合体外全仿生消化技术,研究了在唾液、胃、肠无机物和有机物(含消化酶)作用下,紫菜中Cd的主要存在形态,分析发现在紫菜胃全仿生提取液中,检测到2种未知小分子有机态Cd,其中以保留时间为24.2 min的Cd形态为主要存在形态。在肠全仿生提取液中检测到2种Cd形态,其中(PC)₃-Cd是主要存在形态。有关(PC)₃-Cd在生物体内的代谢规律还需进一步研究。实验确证了Cd在紫菜中的主要有机形态,为紫菜食用安全风险评价提供重要依据。     

浒苔中铝的含量及存在形态分析

以浙江沿海浒苔为原料,采用连续浸提和电感耦合等离子发射光谱(ICP-OES)相结合的方法,在分析了不同海域浒苔中铝含量的基础上,重点探究了浒苔中铝的分布及存在形态,并对浸提条件进行了优化。其优化浸提参数:将浒苔粉碎至20～30目,采用0.8 mol/L的HCl溶液60°C下浸提60 min,0.8 mol/L NaOH溶液70°C下浸提60 min。结果发现,浒苔总铝含量高达1 585.25～1 776.48 mg/kg,主要以有机铝和活性铝存在。有机铝主要为可溶多糖结合态铝(Alosu)、小分子蛋白铝(Alpros)、海藻胶结合态铝(Alswg)、大分子蛋白态铝(Alpro)、纤维态铝(Alofi),分别占总铝的1.77%～2.70%、12.65%～17.11%、39.76%～42.08%、 20.31%～22.23%、 11.99%～14.51%;活性铝主要为羟基态铝[Al(OH)2+、Al3+等]、AlF和可溶性有机铝(Alosm),占总铝的8.57%～11.38%。实验结果可为浒苔的食用安全性评价和铝限量的标准制定提供科学依据。     

紫菜中无机砷含量的分析研究

本文针对紫菜中的无机砷超标问题,采用高效液相色谱—原子荧光光度法联用技术(HPLC-AFS)对紫菜中砷的形态进行分析,并测定了紫菜中的无机砷的含量。通过分析发现,紫菜中砷主要以一甲基胂酸、二甲基胂酸及砷糖、甜菜碱、砷胆碱等多种形态的有机砷化合物的形态存在于藻体中,无机砷的含量很少,仅在0.2mg/kg左右。采用HPLC-AFS能进行无机砷的分析测定时,由于三价砷的出峰时间与第1个峰的有机砷化合物出峰时间重叠,采用过氧化氢将其氧化成五价砷,可以很好地解决这一问题。通过验证,其加标回收率可达到80.19%,方法的准确性高,回收率符合检测的要求,适用于紫菜中无机砷的测定。     

镉在海藻中的化学形态

利用化学试剂逐步提取法研究了紫菜、海带、裙带菜和羊栖菜中镉的存在化学形态。研究结果表明:镉以多种化学形态存在于4种海藻中,1 mol/L氯化钠提取态镉和 2% 醋酸提取态的镉所占比例较大,两者约占总镉含量的76.3%～92.9%。0.6 mol/L盐酸提取态、去离子水提取态和80%乙醇提取态镉所占比例较小,其中乙醇提取态(离子态镉)约仅占总镉含量的0.4%～9.2%,且对于4种海藻,紫菜中的离子态镉所占比例最低(均小于1%)。实验进一步证实以海藻中总镉含量作为检测标准不能准确反映海藻及其制品的食用安全性,因此亟需建立海藻中针对毒性较强的离子态镉的检测标准限量和快速有效的检测方法,以保障我国海藻产业和出口创汇经济的顺利发展。     

条斑紫菜在不同生长周期砷形态变化规律及其对砷的富集效应

首次研究了江苏省3个主产区条斑紫菜中总砷及各种形态砷的含量从1月至4月不同收割时期的变化规律以及条斑紫菜对砷的富集系数。结果发现,条斑紫菜中不同形态砷含量差异很大,以砷糖含量最高,占总砷含量的90.40%~98.14%;二甲基砷次之,无机砷含量最低,含量在0.054~0.14 mg/kg,三者之间具有显著性差异(P＜0.05)。2月份收割的紫菜样品总砷和砷糖含量最高,之后呈逐渐下降的趋势。而无机砷含量及其占总砷百分比则从1月至4月逐渐降低。条斑紫菜对砷具有极强的富集能力,富集系数在454.4~623.8。本研究进一步证明,条斑紫菜中无机砷含量远小于我国标准规定的无机砷限量。     

福建省紫菜中砷的形态及含量

利用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用技术研究了福建省紫菜中的砷含量及其化学形态,并利用高分辨质谱对砷糖结构进行准确判断。实验表明福建省紫菜中总砷含量为12.2~50.4 mg/kg,其中主要形态为砷糖-PO4,平均含量约占可提取砷含量的60.7%,最大占到可提取砷含量的88.1%;其次为砷甜菜碱(As B),平均含量占28.4%;后续依次为砷糖-OH、砷胆碱(As C)和二甲基砷酸(DMA),平均含量分别占6.2%、2.8%和1.6%。毒性较高的无机三价砷(AsⅢ)在60个样品中均未检出,五价砷(AsⅤ)在18个样品中有检出,但含量仅为0.06~0.79 mg/kg,表明紫菜中的砷不会对其食用安全造成较大危害。紫菜干菜的加工处理方式对其中砷形态转换为砷糖有一定影响;紫菜的收割时期不同不会对砷形态分布带来显著影响。     

中、日、韩三国紫菜中总砷和无机砷的初步检测

为比较中国、日本、韩国紫菜加工品中的总砷和无机砷含量,分别用氢化物原子荧光光度法和银盐法检测2012~2013年中国、日本、韩国紫菜加工品的总砷含量和无机砷含量。结果显示:中国坛紫菜(Pyropia haitanensis)加工品、中国条斑紫菜(Pyropia yezoensis)加工品、日本条斑紫菜加工品和韩国条斑紫菜加工品的总砷含量分别为21.58~60.25 mg·kg-1、17.96~33.79 mg·kg-1、11.18~38.12 mg·kg-1、17.76~41.87mg·kg-1,其均值分别为41.74、26.39、25.81、29.09 mg·kg-1。中国坛紫菜加工品、中国条斑紫菜加工品、日本条斑紫菜加工品和韩国条斑紫菜加工品的无机砷含量分别为0.104~0.368 mg·kg-1、0.105~0.328 mg·kg-1、0.032~0.321 mg·kg-1、0.093~0.335 mg·kg-1,其均值分别为0.240、0.210、0.190、0.220 mg·kg-1。中国坛紫菜加工品的总砷和无机砷含量均明显高于中、日、韩三国条斑紫菜加工品(P0.01)。中国条斑紫菜和日本条斑紫菜加工品的总砷含量差异不显著(P0.05),均显著低于韩国条斑紫菜加工品(P0.01)。日本条斑紫菜加工品的无机砷含量最低,中国条斑紫菜加工品的无机砷含量稍低于韩国条斑紫菜加工品,但两者间的差异不显著(P0.05)。紫菜中的总砷和无机砷呈正相关关系(P0.01),且无机砷含量仅占总砷含量的0.21%~1.54%。本研究的所有紫菜加工品的无机砷含量都远低于《GB/T 23597-2009干紫菜》中无机砷的安全限量标准1.5 mg·kg-1。     

中华绒螯蟹有机和常规养殖池塘底泥氮磷溶出特性研究

采用室内模拟研究的方法,研究中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)有机和常规养殖底泥中氮、磷的溶出规律。结果显示:有机组氨态氮溶出总量明显高于常规组,覆水前期,底泥厚度是决定氨态氮溶出总量的主要因子,中后期底泥类型成为主要因素。相同厚度底泥中有机组硝态氮的污染负荷明显低于常规组。常规组较有机组更容易在短时间内溶出硝态氮和亚硝态氮。5 cm和10 cm底泥厚度下有机组溶出总磷量分别高于常规组60.5%和56.5%,但在前4 d有机组的溶出速率低于常规组,应提早换水以有效控制总磷浓度。     

大菱鲆高温胁迫应答主效QTL候选基因的表达特性分析

为研究大菱鲆高温胁迫下相关应激基因的表达影响,采用Real-time PCR对本课题组已定位到的大菱鲆高温胁迫应答主效QTL中的4个候选基因(p53、UBE2H、ZNF469和MAGI2基因)在不同温度胁迫下的肝脏、鳃、脾脏、皮肤4个组织中的表达量进行检测。以大菱鲆正常生活水温14°C为对照组,20°C、23°C、25°C和28°C为实验组,进行数据分析。结果显示,4个基因在各个组织中均有表达,且表达量具有组织和温度特异性。其中UBE2H的表达量在4个组织中均呈现出先上升后下降的趋势,在肝脏、脾脏、皮肤组织中20°C时急剧上升并达到峰值且差异显著;在鳃组织中23°C时达峰值,差异显著。p53在4个组织中的表达量均有先上升后下降的趋势,但在鳃和皮肤组织中28°C时表达量急剧升高达到峰值且差异显著。ZNF469和MAGI2在4个组织中均在20°C时大量表达,并远高于其他温度。研究表明,在大菱鲆高温胁迫应答过程中p53基因与DNA修复和细胞凋亡密切相关,而UBE2H基因参与的泛素-蛋白酶体途径对p53基因具有反馈调节作用,是维持细胞稳态的关键基因;ZNF469和MAGI2在作为鱼类应答高温胁迫的生物标志物方面具有重要研究价值。     

鲍疱疹病毒原位LAMP检测方法的建立与初步应用

为精确定位鲍疱疹病毒(HaHV-1)在宿主不同组织器官中的分布,明确HaHV-1的组织亲嗜性和侵染进程,实验基于环介导等温扩增技术(LAMP)和原位杂交技术建立了HaHV-1的原位LAMP检测方法。利用该方法研究了HaHV-1人工感染实验不同时间节点,病毒在杂色鲍主要器官的分布规律和组织亲嗜性。并对已报道的HaHV-1 LAMP扩增引物进行优化,实现对载玻片上原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,筛选最佳显色时间等原位杂交反应条件,最后通过免疫酶标技术分析HaHV-1在组织样本内的分布情况。结果显示,HaHV-1原位LAMP检测方法最适显色时间为60 min。利用该方法对攻毒后24、36、48、60和72 h,HaHV-1在杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺和腹足神经节4种样本的组织分布情况进行检测和分析。病毒阳性信号最早于36 h出现在腹足神经节,48 h在部分外套膜样本中观察到病毒阳性信号,分布局限于外周神经中。在感染实验后期,病毒阳性信号出现在肝胰腺结缔组织中。病毒阳性信号出现的部位常有大量细胞渗出和浸润,渗出的细胞中可见被病毒感染的血淋巴细胞。本研究建立的HaHV-1原位LAMP检...     

Tubercular Lesions in Two Spanish Cyprinodontid fishes

A histopathological study of tubercular lesions in Lebias (=Aphanius) ibera and Valencia hispanica (Cyprinodontidae) was carried out using conventional acid-fast staining and immunohistochemical methods. The clinical signs in diseased fish comprised exophthalmos, emaciation and melanosis. Examination of stained sections revealed a systemic granulomatous process associated with positive Zielh–Neelsen bacilli in the lesions. The immunohistochemical staining was positive in all cases and the mycobacterial antigen was detected in affected organs. This revised version was published online in August 2006 with corrections to the Cover Date.     

中华鲟、史氏鲟及达氏鳇血清免疫球蛋白的纯化及部分特性分析

采用饱和硫酸氨分步沉淀和Sephadex G200凝胶层析的方法，首次分别纯化制备了健康非免疫状态下中华鲟（Acipenser sinensis）、史氏鲟（Acipenser schrenckii）和达氏鳇（Huso dauricus）的血清免疫球蛋白（Ig） ，并采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）、蛋白免 疫印迹（Western blotting）及免疫琼扩实验等方法对其Ig及Ig亚单位的分子量和部分特性进行了分析。PAGE及SDSPAGE的结果显示：史氏鲟，中华鲟和达氏鳇IgM的相对分子量分别为867 kD， 896 kD和924 kD；3种鲟鱼Ig的重链分子量均为88 kD，都具有29 kD的轻链，其中达氏鳇还另有一分子量约为26 kD的轻链蛋白。分子量的测定及计算结果显示鲟鱼的Ig为四聚体。Western-blotting的检测结果表明，3种鲟鱼Ig的重链与其Ig具有同样的抗原性，在硝酸纤维素膜上可被兔抗鲟Ig多克隆抗体所识别，而轻链的Western blotting检测结果则呈阴性。免疫沉淀反应的结果显示，3种鲟鱼的血清及其Ig与相互之间的兔抗Ig血清有免疫沉淀反应，但与兔抗鲤Ig血清无免疫沉淀反应，这表明3种鲟科鱼类的Ig在结构和序列上是较为相似的，而与鲤鱼等高等硬骨鱼类的Ig存在较大的差别。     

罗氏沼虾不同养殖模式对水体浮游生物的影响

通过围隔实验比较罗氏沼虾不同养殖模式对水体浮游生物的影响。实验设置6种养殖模式:罗氏沼虾单养(MP)、罗氏沼虾+浮萍(水面覆盖率5%)(PP)、罗氏沼虾+鲢(PF)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+鲢(PMF)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+浮萍(PMP)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+浮萍+鲢(PMPF)。养殖64 d后,测定不同模式中浮游植物和三大类浮游动物(轮虫、枝角类及桡足类)的种类和数量。结果显示,上述6种模式中浮游植物共同优势种有4种,但优势度指数最大的浮游植物不同,MP组是锥囊藻属,有浮萍的PP和PMP组均为细小平裂藻,混养鲢的PF、PMF和PMPF组均为针杆藻。不同养殖模式无共同的浮游动物优势种。养殖模式对浮游生物密度具有显著影响,PF组浮游植物密度最高,MP组浮游植物密度最低,PF组浮游植物密度比MP、PP和PMP组分别高78%、53%和61%。相反,浮游动物密度MP组最高,PF组最低。混养鲢的PF、PMF和PMPF组浮游动物密度显著低于其他3组。研究表明,罗氏沼虾养殖中混养鲢可增加浮游植物密度而降低浮游动物密度,浮萍和鲢影响池塘优势种。     

Identification of Stress Sensitive Genes in Hyperthermic Atlantic Salmon (Salmo salar) Embryos by RAP-PCR

Deformities of skeletal structures, the heart, and other organs are a recurrent problem in species used in intensive aquaculture. Elevated egg incubation temperature appears to be a high risk factor in the development of these malformations, but the causal relation has not been established. Our aim was to identify candidate genes involved in the development of heat induced deformities in Atlantic salmon (Salmo salar). Temperature sensitive genes were isolated by RNA Arbitrarily Primed (RAP)-PCR. A total of 33 RAP-PCR products were successfully sequenced, and the expression of eight identified genes was further examined by RT-PCR from pooled samples of heat exposed embryos. Five of these genes were demonstrated to be temperature sensitive, of which four were shown to be up-regulated and one was down-regulated at elevated water temperatures. The atrial natriuretic peptide (ANP) gene, which is a promising candidate for heart deformities, showed the highest level of heat induction. Three additional RAP-PCR products identified as heterogeneous nuclear ribonucleprotein (hnRNP) A0, acyl CoA binding protein (ACBP) and mitochondrial (mt)-HSP70 showed up-regulated mRNA expression in response to elevated water temperature. The single down-regulated gene was identified as an Atlantic salmon (Salmo salar) homolog of the cysteine and tyrosine-rich 1 (CYYR1) gene. This study demonstrated that a temperature elevation of only 4 °C during the early stages of the organogenesis in Atlantic salmon induce altered expression of a number of genes, which are candidates for the development of heat induced deformities.     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268^+56 bp,且-1 308^-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224^+48 bp,且+48^+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229^-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

倒刺鲃属三个种之间种间杂交的初步研究

采用人工催产和干法授精技术,进行了以中华倒刺鲃、倒刺鲃为母本与其父本及黑脊倒刺鲃雄鱼的种间杂交实验,获得4个杂交组合和2个自交组合,在(27±0.5)℃温度条件下,对其F₁卵膜径、受精率、孵化率、孵化时间、畸形率、子代早期形态特征与成活率进行了比较,同时,观察了胚胎发育及其异常现象,结果表明:以中华倒刺鲃为母本的F₁卵膜径差异不显著;以倒刺鲃为母本的F₁卵膜径,在多细胞期时差异不显著,在耳石期时,倒刺鲃♀×中华倒刺鲃♂F₁卵膜径显著大于母本(P<0.05)。杂种F₁的受精率、孵化时间与母本差异不显著,畸形率显著高于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃杂种F₁的孵化率较高,与母本差异不显著(P<0.05)。倒刺鲃♀×中华倒刺鲃♂F₁的孵化率与母本之间差异不显著,倒刺鲃♀×黑脊倒刺鲃♂F₁的孵化率显著低于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃杂种F₁仔鱼早期发育阶段存在死亡高峰期,成活率显著低于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃种间杂交和倒刺鲃♀×黑脊倒刺鲃♂杂种F₁既具有父本特征,同时又具有母本特征,初步证明倒刺鲃属种间杂交是可行的。     

欧洲鳗短钩拟指环虫病及其鳃组织病理

报道了患短钩拟指环虫病欧洲鳗的症状、流行状况和鳃显微组织病理.游动和呼吸频率异常、鳃丝浮肿和鳃上粘液增多为该病的主要症状.该病尽管在冬季也有发生,但水温在26℃以上的春末、夏季和秋初是最易发病的流行季节,流行出现明显的季节性变化.患病欧洲鳗鳃的组织病理变化主要表现出5种类型,其一是鳃小片上皮细胞增生,使邻近的鳃小片相连;其二是鳃小片粘液细胞增生,同样使鳃小片连成一片,增生的粘液细胞经阿利新蓝(Alclan blue)和过碘酸雪夫氏(Periodic acid schiff)二者联合染色后呈蓝紫色的染色反应,属于Ⅳ型的粘液细胞;其三是鳃小片肿大,但单层扁平上皮细胞无肿大现象,上皮细胞层与毛细血管相分离,鳃小片上皮细胞坏死,上皮细胞层破裂,血细胞外溢,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,失去鳃小片原有的结构;其四是鳃小片肿大同时伴随单层扁平上皮细胞肿大,进一步发展,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,鳃小片同样失去原有的结构;其五是鳃小片毛细血管严重充血扩张,比原毛细血管扩张几倍到十几倍,形成充满红细胞的棒状到球状的动脉瘤.结果表明鳃上皮细胞增生、粘液细胞增生、鳃小片肿大、上皮细胞坏死脱落和严重充血成动脉瘤等病理变化都可导致患病欧洲鳗呼吸困难,轻者影响其生长,重者最终因呼吸衰竭而死亡.     

实时荧光定量PCR扩增特异性vapA基因检测杀鲑气单胞菌

为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.8345x+42.535,相关系数R~2为0.998,最低检测限为34拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约1000倍。应用建立的方法检测人工感染的虹鳟病样,15个被检样品呈阳性反应,与细菌常规鉴定方法结果一致。研究表明,所建立的基于实时荧光定量PCR技术的杀鲑气单胞菌检测方法快速、特异、灵敏,可用于临床诊断和疫病监测。