西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长克隆、序列分析及其作为内参基因的应用研究

采用同源克隆和RACE技术获得西伯利亚鲟(Acipenser baerii)β-actin基因cDNA全长,序列分析表明西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长1322bp,其包括的137bp的5′端非翻译区,57bp的3′端非翻译区和编码375个氨基酸残基的1128bp开放阅读框。与其他物种比对,该基因具极高的保守性。同时也利用同源克隆技术获得了西伯利亚鲟Sox2基因的同源保守区,该序列长768bp,编码256个氨基酸,也具较高的保守性,与其他物种的相似性在70%以上。以β-actin作为内参基因,对Sox2基因在西伯利亚鲟成鱼各组织及胚胎发育各时期进行实时荧光定量PCR检测,发现Sox2基因在不同组织中均有表达。其中,在肝、胰、肾、脑4个组织中表达量差距不大,均处于相对较低的水平,在肌肉组织中表达量最高,达到了肝脏的10.4倍。同时Sox2基因虽在西伯利亚鲟胚胎发育各时期均有表达,但表达也具明显的时间差异性。在受精卵期、囊胚期Sox2基因的相对表达量较低,在原肠期、神经胚期、视泡形成期和心脏形成期Sox2基因相对表达量较高,且在心脏形成期达到最高点。本研究为量化西伯利亚鲟发育分化过程中相关基因提供了坚实的参照工具,增加了后续试验的可信度,同时可为今后深入研究西伯利亚鲟Sox2在侧线神经节分化发育、细胞迁移过程中的作用提供基础参考依据。     

西伯利亚鲟Sox17基因cDNA全长的克隆及其表达分析

采用RACE技术获得西伯利亚鲟(Acipenser baerii)Sox17基因cDNA全长,序列分析表明,西伯利亚鲟Sox17基因cDNA全长2 671 bp,包括588 bp的5'端非翻译区,901 bp的3'端非翻译区和编码393个氨基酸残基的1 183 bp开放阅读框。氨基酸序列比对显示,该基因具较高的保守性,与塞内加尔多鳍鱼(Polypterus senegalus)的相似度最高为72%。系统进化分析表明,西伯利亚鲟与塞内加尔多鳍鱼聚为一支,且支持率为95%。以延伸因子efla(elongation factor 1-alpha)作为内参基因,对Sox17基因在西伯利亚鲟各组织的相对表达量进行分析,发现Sox17基因在不同组织中均有表达,但表达具有明显的组织差异性。在脑中表达量最高,而在肾、血液、眼、肠和胸鳍5个组织中表达量均较低。同时,Sox17基因在西伯利亚鲟不同发育时期均有表达,但表达具有一定的时间差异性。在宽神经板期的表达量高,相当于表达量最低点11日龄仔鱼的167倍。本研究为量化西伯利亚鲟胚胎发育分化过程中相关基因提供了参照工具,同时可为今后深入研究西伯利亚鲟Sox17在胚胎发育过程中的作用提供基础参考资料。     

西伯利亚鲟CXCR7基因cDNA全长的克隆及其表达分析

采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),首次克隆了西伯利亚鲟(Acipenser baerii)的CXCR7a和CXCR7b基因的全长cDNA。CXCR7a的cDNA全长为2 325 bp(登录号为:JQ034508),包括207 bp的5'端非翻译区(UTR)、可编码362个氨基酸的1 086 bp的开放阅读框(ORF)及包括poly(A)尾巴在内的大小为1 032 bp的3'端非翻译区(UTR);CXCR7b的cDNA全长为2 423 bp(登录号为:JQ034509),包括209 bp的5'端非翻译区(UTR)、可编码370个氨基酸的1 110 bp的开放阅读框(ORF)及包括poly(A)尾巴在内的大小为1 104 bp的3'端非翻译区(UTR),并对它们编码的蛋白质序列的分子特征进行了分析。氨基酸序列相似性(similarity)分析表明,CXCR7a与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、斑马鱼(Danio rerio)的CXCR7相似性分别为82.6%、81.4%、80.9%、81.0%;CXCR7b与人、小鼠、非洲爪蟾、斑马鱼的CXCR7相似性分别为82.9%、82.3%、80.8%、82.5%;西伯利亚鲟CXCR7a与其CXCR7b的相似性最高为96.5%。系统进化树分析显示,西伯利亚鲟与斑马鱼聚为一簇,两栖类聚为一簇,其它高等脊椎动物再进行聚类。对CXCR7a和CXCR7b在各发育时期胚胎及仔鱼的表达状况分别进行定性分析表明,CXCR7a在除卵裂期、囊胚期的胚胎外,其在原肠胚中期至出膜1 d的仔鱼的各时期中均具有表达,CXCR7b在卵裂期至出膜1 d的仔鱼的各时期中均具有表达。另外,从基因组DNA水平上表明CXCR7a和CXCR7b来自不同的基因拷贝。这些结果为进一步研究CXCR7在西伯利亚鲟侧线系统发育中的作用提供了新的基础资料。     

中华鲟热休克蛋白hsp30基因cDNA的克隆及其在高温胁迫下的表达分析

实验克隆了中华鲟(Acipenser sinensis)热休克蛋白hsp30基因cDNA的全长、分析了其分子结构与特征,并研究了其在高温胁迫下的表达水平。结果显示,中华鲟hsp30基因cDNA序列全长为1 037 bp,其中开放阅读框(ORF)636 bp,5′端非编码区(5′UTR)38 bp,3′端非编码区(3′UTR)363 bp,共编码211个氨基酸。氨基酸多序列比对发现含有一个保守的α晶状体结构;系统进化分析显示,中华鲟HSP30与鱼类HSP30聚为一支,与小体鲟HSP30氨基酸序列相似性最高,为79%。荧光定量PCR结果表明,中华鲟hsp30基因在皮肤中的表达量最高,肝脏次之,在肠中的表达量最低。高温胁迫后,心脏、脾脏、肾脏和皮肤中hsp30基因表达量均显著增加,表明这些器官在中华鲟应对高温胁迫中可能起着重要作用。     

青虾高血糖激素基因全长cDNA序列的克隆及表达分析

本研究首次克隆了青虾(Macrobrachium nipponense)高血糖激素(crustacean hyperglycemic homone,CHH)基因全长cDNA序列,并使用荧光定量PCR技术首次检测了CHH基因在青虾不同组织中的表达。青虾CHH基因cDNA全长1 017 bp,包括241 bp的5′UTR,408 bp的开放阅读框(ORF),355 bp的3′UTR,开放阅读框编码135个氨基酸。成熟肽包含6个CHH家族中位置保守的Cys残基。青虾CHH成熟肽C端为GK,确定为ES型CHH基因。蛋白相似度比对显示,所分离的青虾CHH被归为CHH家族I型肽。系统进化树分析表明,青虾CHH多肽与罗氏沼虾聚在一起,具有最近的亲缘关系。荧光定量PCR检测显示,CHH基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量由高到依次为眼柄、精巢、腹神经节、脑、肠、肝、心脏、卵巢。以卵巢为参照其表达量设为1时,眼柄与精巢CHH基因表达量分别为卵巢的500倍和250倍,由此推测CHH基因可能与雄性生殖过程相关。     

圆斑星鲽促性腺激素释放激素基因克隆及表达特性

采用RACE技术,在圆斑星鲽(Verasper variegatus)脑中克隆到3种GnRH基因的cDNA序列: cGnRH-Ⅱ、sGnRH和sbGnRH.每种GnRH都包括1个信号肽、1个Gly-Lys-Arg连接序列和1个GnRH相关肽.其中, cGnRH-Ⅱ的cDNA全长为568 bp,编码85个氨基酸, ORF为255 bp,5′UTR为141 bp,3′UTR为169 bp.sGnRH的cDNA全长为457 bp,编码90个氨基酸, ORF为270 bp,5′UTR为41 bp,3′UTR为143 bp.sbGnRH的cDNA全长为381 bp,编码98个氨基酸, ORF为294 bp,5′UTR为48 bp,3′UTR为36 bp.分析了3种GnRH基因的编码氨基酸序列与其他脊椎动物的同源性,圆斑星鲽 GnRH 与鲽形目鱼类氨基酸同源性最高,其次为鲈形目鱼类.对3种 GnRH 基因的系统进化分析表明,圆斑星鲽 GnRH 基因与其他鲽形目鱼类亲缘关系最近,其次为鲈形目、鲑形目和鳗鲡目鱼类.荧光定量PCR分析表明,3种GnRH基因都在脑中表现出最高表达水平且具有性别特异性表达模式:雌性中不同组织的 GnRH mRNA 表达水平都相应高于雄性.组织表达分析表明, cGnRH-Ⅱ的 mRNA 仅在脑中表达,而sbGnRH在各个组织都有表达, sGnRH仅在脑、垂体和性腺中表达.脑中sbGnRH mRNA的表达水平在卵巢成熟过程中变化显著(P<0.05),而其他两种GnRH的mRNA表达水平变化不显著(P>0.05).本研究首次在圆斑星鲽脑中克隆到3种GnRH基因,其组织和季节表达水平变化表明sbGnRH可能是圆斑星鲽生殖调控的关键GnRH类型,本结果可为圆斑星鲽生殖调控机制和人工繁育技术研究提供理论支撑.     

花刺参钙调蛋白cDNA克隆及组织分布

钙调蛋白（ calmodulin,CaM）是一种钙离子（ Ca2＋）结合蛋白,在钙信号传导过程中起重要作用。文章扩增到花刺参（Stichopus monotuberculatus）钙调蛋白（命名为StmCaM）cDNA全长序列。StmCaM cDNA全长1394 bp,其中5＇UTR长138 bp,3＇UTR长806 bp,ORF为450 bp。ORF推导出的StmCaM含149个氨基酸（包含起始蛋白酸）,其预测分子量约为16.7 kDa,理论等电点为4.1。StmCaM氨基酸序列与其他物种的钙调蛋白高度相似,相似度百分比为95.9%~98.0%。采用realtime PCR分析StmCaM基因在花刺参不同组织中的表达,结果显示其在呼吸树中表达量最高,体腔细胞、肠次之,而体壁中表达量最低,几乎检测不到。     

三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

采用RTPCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1 483 bp,由长92 bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),257 bp的3′非翻译区,和1 134 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为41.9 ku,理论等电点为5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178,Ser305,Ser321,Pro325,Val331,Pro346等6个氨基酸残基具有特异性,此外还发现3个特殊的氨基酸残基位点以及2个软体动物特有的氨基酸残基。三角帆蚌β-actin氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达98%~99%。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。RT-PCR显示β-actin基因在外套膜、血液、肝、肾、胃、肠、鳃、斧足共8个组织的表达基本一致,具有良好的稳定性。     

文蛤Clq基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究

利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤Clq基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316 bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸.在文蛤Clq(MmClq)蛋白中,Clq结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的Clq结构域均具有较高的同源性.通过荧光实时定量PCR,MmClq mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高.在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,Clq相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmClqmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍.包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmClq重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性.     

草鱼C1qC基因的克隆及表达分析

为了研究C1qC基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)免疫过程中所起的作用,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得了C1qC基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆的C1qC cDNA全长为916 bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)735 bp,5′端非编码区(untranslated region,UTR)89 bp和3′端非编码区(UTR)92 bp。735 bp的ORF共编码244个氨基酸,相对分子量为26 162.5 U。同源性分析表明,草鱼与斑马鱼(Danio rerio)的相似度最高,达到71%。经草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)诱导后,草鱼C1qC基因在鳃、皮肤、肌肉、肝、中肾、心脏、头肾等组织中的mRNA表达水平均显著上调。在草鱼胚胎发育的各个阶段都能检测到C1qC mRNA的表达,说明该基因可能在草鱼胚胎和鱼苗的免疫反应和早期发育中起重要作用。本研究将为今后在草鱼免疫功能方面深入研究C1qC基因提供基础资料。     

缘管浒苔rbcL全长cDNA克隆与序列分析

对缘管浒苔光合作用第一关键酶Rubisco大亚基基因(rbcL)全长cDNA序列进行了克隆分离。首先应用RT-PCR方法获得了rbcL大片段cDNA序列,序列长度为1101bp,并进行了测序分析。然后分别应用5′RACE方法和3′RACE方法获得2个克隆序列,其序列长度分别为371bp和579bp,并进行了测序分析。在此基础上,将3个片段序列进行拼接,获得了Rubisco大亚基全长cDNA序列(1472bp),其中包括1425bp的编码区序列及47bp的前导序列(NCBI登录号:DQ813496),并推断出蛋白质序列(474个氨基酸)。对序列进行了相关生物信息分析和同源性比对,结果显示与已克隆出全长rbcL基因的7种绿藻比较具有较高同源性,核苷酸序列和蛋白质序列同源性分别达到了82.07%～85.78%和88.00%～94.11%,其中与蛋白核小球藻蛋白质序列同源性最高,为94.11%。在此基础上,使用生物信息学软件对缘管浒苔rbcL氨基酸序列与其它植物或藻类进行了多序列比对,并且进一步应用在线软件程序进行了蛋白质的二级结构分析和三级结构预测。     

虾夷马粪海胆性腺cDNA文库构建及部分EST序列分析

应用Gubler-Hoffman cDNA文库技术.构建虾夷马粪海胆(Strongylocentrotus intermedius)性腺cDNA文库.测试结果表明.其库容量为2.10x 106 PFU/mL.长度范围在0.54.2 kb.插人片段平均长度为1.4 kb.达到建库要求.对虾夷马粪海胆cDNA克隆测序.将获得的819条EST序列与NCB1数据库进行BLAST比对.获得了65个有研究价值的EST序列和cDN^克隆.其EST序列已提交到GenBank.序列号分别为G0448010-GO448016,GR410172-GR410229.虾夷马粪海胆性腺cDNA文库的成功构建.使短期内获得大量调控海胆性腺生长和营养性状的关键基因表达信息成为可能.为进一步开发海胆的生物资源提供参考.     

草鱼胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)的序列克隆及分析

以实验室构建的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道cDNA文库苹果酸脱氢酶(cMDH)EST序列为基础,采用末端快速扩增法(RACE),从健康雌性草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道细胞RNA中获得1391 bp的草鱼肠道cMDH的cDNA序列(NCBI登录号:EU569765)。结果显示:该序列包含62 bp的5′非编码区(5′-UTR),330 bp的3′非编码区(3′-UTR),典型加尾信号AATAA位于polyA起点上游16 bp。开放阅读框ORF长999 bp,共编码333个氨基酸,预测蛋白等电点为6.67,大小为36 kDa。多序列比对显示草鱼胞质苹果酸脱氢酶具有典型的苹果酸脱氢酶功能区保守序列,该酶与斑马鱼cMDH相似度最高达到95.5%,与模式植物拟兰介的相似度为57.8%,其预测三级结构具有典型cMDH功能区。Southern杂交结果表明草鱼cMDH属于多拷贝基因家族。     

鱼类肠道小肽转运载体PepT1的研究进展

从生理特性,cDNA序列和蛋白质分子结构,组织分布与表达这三个方面叙述了欧洲鳗鲡(An-guilla anguilla),罗非鱼(Oreochromis mossambicus),rockfish(Sebastes caurinus),银鱼(Chionodraco hama-tus),斑马鱼(Danio rerio),亚洲泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus),大西洋鳕鱼(Gadus morhua)和欧洲黑鲈(Dicentrarchus labrax)中有关肠道Ⅰ型肽转运载体(PepT1)方面的研究进展情况。     

15种鱼转铁蛋白cDNA序列保守性分析

运用计算机分析软件,对克隆的鲫鱼血清转铁蛋白cDNA序列与14种鱼进行了碱基组成、序列同源性和一级结构保守性分析。鱼类转铁蛋白cDNA序列一级结构中,根据序列保守性可以划分为从A至G的7个区域,分别命名为:受体结合区(1个)、铁离子结合区(2个)、次易变区(2个)和易变区(2个)。     

圆斑星蝶MHC ⅡB基因结构、多态性及组织表达分析

通过表达序列标签法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,分离和克隆了圆斑星鲽(Verasper variegatus)主要组织相容性复合体(MHC)IIB的全长cDNA序列,该cDNA全长为1 144 bp,5'UTR(untranslated region)为7 bp,3'UTR为450 bp,开放阅读框(ORF)长度为687 bp,可编码228个氨基酸,包含信号肽、抗原结合域(β1),IGC区(β2),跨膜区和胞质区5个结构域.同源分析表明,圆斑星鲽MHC IIB氨基酸序列与其他硬骨鱼具有49%-79%的同源性,与鼠、人、红原鸡和护士鳖的相似性较低,分别为34%,33%,31%和30%.圆斑星鲽MHC IIB基因含有5个内含子,与其他硬骨鱼不同,其β2结构域编码区内存在I个109 bp的内含子.根据获得的MHC IIB基因组序列设计特异性引物,在10尾野生圆斑星鲽中扩增了包括完整内含子1和外显子2的长度约388 bp的DNA片段,PCR产物直接测序后发现在270 bp的抗原结合域中共有23个位点发生变异,密码子第1位和第2位的变异明显高于第3位.利用荧光定量PCR分析组织表达发现,MHC IIB基因在健康圆斑星鲽9种组织中均有表达,但表达量存在差异,肾的表达量最高,肌肉的表达量最低,肾、心、脾脏和鳃的表达量显著高于肝、皮肤、脑、血和肌肉.本研究旨在为MHC基因家族的遗传进化分析、结构与功能的解析提供基础,同时为圆斑星鲽的分子免疫学和标记辅助育种研究提供参考依据.     

海带雄配子体抑制消减cDNA文库的生物信息学分析

对海带(Landnaria japonica Axesch.)雄配子体抑制消减cDNA文库进行生物信息学分析,并通过Northern印迹杂交进一步验证了雄配子体2个优先表达的基因.结果表明,(1)由627个克隆产生的618条高质量cDNA可聚类成187条非冗余序列(NRS);其中93条Contig由524条cDNA拼接而成,剩下的94条为Singleton(只有单条cDNA),冗余率达69.74%.(2)5条NRS因与rRNA基因相匹配而不进行分析;60条NRS与GenBank中注释蛋白基因显著匹配;122条NRS无显著匹配.(3)大部分已知功能的基因与物质和能量代谢(26.7%)、生长发育(13.3%)有关,其中与叶绿体光捕获蛋白复合体有关的基因有106条cDNA,所涉及的有lhcf6基因(62条cDNA)与fcp基因(12条cDNA)等.(4)经Northern印迹杂交证实lhcf6和fcp2个基因在处于营养生长期的雄配子体中优先表达.(5)90条Contig的总G+C含量平均值为52.58%,表明了密码子的使用对G、C有明显的倾向性;20个推测功能蛋白(1520密码子)密码子第三位碱基的使用偏好C(40.7%),其次是G(33.9%);终止密码子的使用偏好TGA(54.5%).本研究为海带雌、雄配子体差异表达基因克隆、分析和功能基因组学等研究提供了信息.     

鳜胃蛋白酶原基因cDNA全长的克隆与序列分析

利用RT–PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆鳜(Siniperca chuatsi)胃蛋白酶原基因cDNA全长序列，并对该基因的结构特征和系统进化关系进行了分析。鳜胃蛋白酶原基因cDNA序列全长1367 bp，5′端非翻译区43 bp，3′端非翻译区187 bp，开放阅读框(ORF)1137 bp，共编码378个氨基酸。鳜胃蛋白酶原氨基末端存在信号肽和激活肽序列，序列中含有催化活性必需的2个天冬氨酸残基和构成二硫键的6个半胱氨酸残基。鳜胃蛋白酶原氨基酸序列与其他脊椎动物胃蛋白酶原氨基酸序列的同源性为59.9%～91.2%，表明胃蛋白酶原基因在脊椎动物的长期进化中比较保守。鳜胃蛋白酶原基因的成功克隆不仅为进一步研究该基因的时空表达奠定基础，而且为鱼类胃蛋白酶原的分子特征和进化提供了新的资料。     

大菱鲆T淋巴细胞酪氨酸激酶(LCK)基因全长cDNA的克隆及表达分析

本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)从大菱鲆(Scophthalmus maximus)脾脏cDNA文库中克隆得到T淋巴细胞酪氨酸激酶(LCK)全长cDNA序列.该序列包含193 bp的5'末端非编码区(5'UTR),1 506 bp的开放阅读框(ORF)和300 bp 3'UTR,整个开放阅读框编码502个氨基酸.系统发生分析表明,大菱鲆LCK基因与红鳍东方纯(Fugu rubripes)和黑青斑河纯(Tetraodon nigroviridis)的亲缘关系最近.在大菱鲆正常组织、胚胎细胞(TEC)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染的免疫器官组织中对LCK基因进行了RT-PCR表达分析.结果表明,大菱鲆LCK基因只在正常脾脏组织中表达;在用鳗弧菌感染12 h后,大菱鲆胚胎细胞LCK基因表达增强;在鳗弧菌感染的大菱鲆免疫组织中,只在脾脏中检测到LCK基因表达,鳗弧菌感染48 h后,LCK基因在脾脏中表达最强.这些结果表明,LCK基因在大菱鲆脾脏免疫应答中起着重要作用.