条斑星鲽CYP19a基因克隆及其在雄鱼生殖周期中的表达

细胞色素P450芳香化酶(P450arom)作为P450细胞色素酶超家族中的一员,是性类固醇生成途径中的末端酶,能够将雄激素转化为雌激素。在大多数脊椎动物中,P450arom由CYP19单基因编码。但是在鱼类中存在两种P450芳香化酶,分为性腺型芳香化酶(P450aromA)和脑型芳香化酶(P450aromB),它们由不同的基因(CYP19a和CYP19b)编码,分布在不同的组织。通过简并引物扩增及RACE cDNA扩增克隆,在国内外首次获得全长为2167bp的条斑星鲽CYP19a cDNA序列,并将推测的氨基酸序列与其它物种P450arom氨基酸序列进行多重比较,发现存在跨膜螺旋区、I-螺旋区、Ozol肽区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区。通过RT-PCR分析了P450aromA mRNA在条斑星鲽不同组织中的表达情况,结果表明,CYP19a基因主要在脑、卵巢和精巢中表达,其次在肠、肝脏、肾脏也有少量表达。同时也分析了P450aromA mRNA在处于不同发育期的精巢中的表达情况,发现在Ⅱ期精巢中表达量最高,在Ⅴ期精巢中表达量最低。     

黄颡鱼脑P-450芳香化酶基因的克隆和组织表达

P-450芳香化酶（P450arom）是催化雄激素生物合成雌激素的关键酶。本文采用RT-PCR和RACE法，首次分离和克隆了黄颡鱼脑P450芳香酶基因HP450aromB，并使用荧光实时定量RT-PCR对其组织表达进行了研究。结果表明HP450aromB cDNA全长2080bp（不包括poly（A）），5′端非翻译区有25bp，3′端555bp（不包含poly（A）），阅读框（open reading frame，ORF）1500bp，编码500个氨基酸，推测的蛋白质分子量为56kDa。同源性分析显示，HP450aromB的氨基酸序列与其它鱼脑P450arom具有70％以上的同源性，与其它鱼卵巢P450arom为60％左右同源，与人胚盘和鸡卵巢P450arom则为50％左右同源；但芳香化酶高保守区包括Ⅰ-螺旋区，芳香化酶特异保守区Ⅱ及血红系结合区Ⅲ和其它鱼芳香化酶相比同源性分别为83％～96％，78％～86％和85％～100％。系统发育分析表明HP450aromB与鱼类脑P450arom属于同一分支的，并且也显示了黄颡鱼和鲶鱼分类地位最近，这和传统的分类一致。实时定量RT-PCR研究显示，HP460arom B在前脑，下丘脑，垂体、卵巢、精巢均有表达，在肝脏没表达，表达量脑部高于性腺，但雌雄鱼脑部HP450aromB的表达总量没显著差异。     

奥利亚罗非鱼卵巢芳香化酶基因的克隆及其表达

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)法分离出奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)卵巢芳香化酶(P450aromA)的全序列,得到1784bp的全长eDNA,包括38bp5'非翻译区,1566 bp阅读框以及含Poly(A)信号(AATAAA)的167bp3'非翻译区[不包括Poly(A)].阅读框共编码521个氨基酸,推算的蛋白质分子量为59kD.同源性分析显示,奥利亚罗非鱼P450aromA的氨基酸序列与其他鱼类性腺芳香化酶(P450arom)具有70%以上的同源性,与其他鱼类脑P450arom有60%左右同源性,但其芳香化酶高保守区包括I-螺旋区、芳香化酶特异保守区和血红素结合区分别与其他鱼类P450arom的同源性高达83%～96%、78%~86%和85% ～100%.系统发育分析表明,奥利亚罗非鱼P450aromA属于鱼类性腺P450arom,分子系统进化树分析结果与根据传统的形态学和生化特征分类结果基本一致.生物信息学分析显示,奥利亚罗非鱼P450aromA基因编码的蛋白无信号肽,无跨膜区域,为非分泌型蛋白.同时还含有多个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基激化位点、N-肉豆蔻酰化位点及蛋白激酶C磷酸化位点.使用Taqman探针法检测P450aromA在奥利亚罗非鱼咸鱼各种组织中的表达.结果发现,P450aromA只在卵巢中表达.同时比较了鱼苗、鱼种和成鱼卵巢中P450aromA的表达差异,结果显示,鱼苗中无P450aromA的表达,成鱼中P450aromA的表达量是鱼种阶段的30倍.     

雄性黄颡鱼芳香化酶基因mRNA在性成熟期组织中表达分析

在水温分别为20(常温对照组)、25、30℃条件下,采用RT-PCR方法,研究性腺成熟期雄性黄颡鱼组织中P450芳香化酶(P450aromA和P450aromB)的mRNA表达水平,同时测定性腺成熟系数(GSI)、肝重指数(HSI)、肥满度(CF)和血浆睾酮(T),雌二醇(E2)含量。结果表明,P450aromA在性腺发育成熟期雄性黄颡鱼心脏、肝、脾、胃、肾脏、精巢、鳃、脑、头肾、肠管组织中均无表达,P450aromB只在脑和肠中有表达,在脑中表达量高于肠,表达量随着水温升高而显著下降;各组实验鱼血浆T和E2含量与芳香化酶基因表达量存在相关关系。该实验结果表明,P450aromA可能与精子发生相关,可能不参与黄颡鱼精子排放过程;P450aromB在雄鱼脑中高度表达,可能参与性腺成熟期精子活力保持与排放过程,且应激温度越高,对性腺成熟期精子活力保持与排放过程影响越大。     

暗纹东方鲀芳香化酶基因的结构及表达分析

性腺型芳香化酶基因是一种调节雌雄激素平衡的基因。为初步探究暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因的cDNA全长序列,共1786 bp,编码514个氨基酸,与红鳍东方鲀及星点东方鲀同源性最高。氨基酸序列分析显示,该基因编码的蛋白是一种稳定的亲水性蛋白,但不存在信号肽序列;性腺型芳香化酶含有38个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、2个跨膜保守结构域;其氨基酸序列在哺乳动物和鱼类中均十分保守,且含有跨膜区、Ⅰ-螺旋区、Ozol′s肽区、芳香化酶特异性保守区和亚铁血红素结合区等功能保守区。表达分析显示,暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因主要在肌肉和卵巢中表达,其次在其他组织中也有少量表达,而且在幼鱼不同发育期卵巢中的表达量呈现出逐渐升高再降低的表达趋势,在精巢中则基本不表达。研究结果表明,性腺型芳香化酶基因很可能参与了暗纹东方鲀雌鱼性腺分化后卵巢的发育、雌性特征的维持和其他组织的发育等过程。     

雄性黄颡鱼芳香化酶基因mRNA在熟期组织中表达分析

在水温分别为20(常温对照组)、25、30℃条件下,采用RT-PCR方法,研究性腺成熟期雄性黄颡鱼组织中P450芳香化酶(P450aromA和P450aromB)的mRNA表达水平,同时测定性腺成熟系数(GSI)、肝重指数(HSI)、肥满度(CF)和血浆睾酮(T),雌二醇(E2)含量.结果表明,P450aromA在性腺...     

黄颡鱼卵巢P-450arom基因的克隆及组织表达

P-450芳香化酶（P450arom）是催化雄激素生物合成雌激素的关键酶。本研究采用RT-PCR和RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法，分离和克隆了黄颡鱼（Pelteobasrus fulvidraco）卵巢P450芳香化酶基因HP450arom A，并使用荧光实时定量RT—PCR对其组织表达进行了分析。结果表明，HP450arom A cDNA全长1914bp[不包括poly（A）]，5’端非翻译区有13bp，3’端362bp[不包含poly（A）]，阅读框（Open Reading Frame，ORF）1539bp，翻译成513个氨基酸，计算的蛋白质分子量为58．7kD。同源性分析显示，HP450aromA的氨基酸序列与其他鱼卵巢P450arom具有60％～90％的同源性，与其他鱼脑P450arom为57％-60％同源，与鸡卵巢和人胚盘P450arom则为51％和52％同源；但芳香化酶高保守区包括Ⅰ-螺旋区，芳香化酶特异保守区Ⅱ和血红素结合区Ⅲ和其他鱼芳香化酶相比同源性分别高达68％～97％、78％-91％和71％～100％。系统发育分析表明，HP450arom A与鱼类卵巢P450arom属于同一分支，黄颡鱼和鲇鱼亲缘关系最近，这和传统的分类方法结论一致。荧光实时定量RT-PCR研究结果显示，HP450arom A在前脑、下丘脑、脑垂体、精巢、肝脏中不表达，只在卵巢中表达。这说明HP450arom A的表达具有组织特异性，并可推测其对卵巢发育起着重要作用。与本室分离的HP450arom B在卵巢的表达量相比，卵巢中HP450arom A的表达量是HP450arom B的18．7倍。     

黄鳝细胞质动力蛋白3基因的克隆及其在性逆转中的功能分析

为解析黄鳝(Monopterus albus)性逆转机制，实验以雌、雄、间性发育黄鳝为研究对象，分析不同组织、不同发育时期性腺、甲基睾丸酮处理性腺及Zebularine处理性腺原代细胞后dynlt3基因表达模式的变化及其在性腺中的表达定位。性腺转录组测序结果显示，基因全长1 082 bp,开放阅读框354 bp,编码117个氨基酸。生物信息学分析显示，dynlt3基因编码蛋白质的二级结构包含37.96%的α-螺旋，29.20%的β-折叠，32.85%的无规则卷曲。系统进化分析结果显示，黄鳝DYNLT3氨基酸序列与硬骨鱼纲中底鳉(Fundulus heteroclitus)同源性最高。实时荧光定量PCR结果表明，dynlt3基因在黄鳝肌肉和脑具有较高表达，心脏次之，在其它各组织表达量较低。在性腺的不同发育时期，在间性后期和雄性中表达量显著性高于雌性与间性早期。甲基睾酮处理后黄鳝卵巢组织结构发生明显退化，卵母细胞退化且数量减少，结缔组织间出现空泡结构；dynlt3基因在卵巢中表达量显著性下调。原位杂交分析dynlt3基因在性腺组织中的表达定位结果显示，在不同性腺发育时期均检测到dynlt3...     

胡子鲇脑型芳香化酶基因全长cDNA克隆及表达

采用RT-PCR和RACE法,克隆了胡子鲇(Clarias fuscus)脑型芳香化酶基因Cyp19a1b,应用荧光实时定量PCR检测其在前脑、下丘脑、脑垂体、肝、精巢和卵巢6种组织,以及性腺分化前后(出膜后12～30 d)全鱼中的mRNA表达。结果表明,Cyp19a1b cDNA全长2 347 bp,5′端非编码区219 bp,3′端[不包括poly(A)]596 bp,开放阅读框(ORF)1 503 bp,编码500个氨基酸,推测其编码蛋白质分子量为56.388 kD。序列分析及分子系统进化树结果表明,胡子鲇Cyp19a1b氨基酸序列与非洲鲇(Clarias gariepinus)Cyp19a1b同源性最高,达95.6%;与南方大口鲇(Silurusmeridionalis)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、斑马鱼(Danio rerio)、斑点叉尾(Ictalurus punctatus)、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)、鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)及稀有鲫(Gobiocypris rarus)Cyp19a1b同源性达75%以上,但与上述鱼类的性腺型芳香化酶基因(Cyp19a1a)同源性低于62%,表明其为脑型芳香化酶,同源性分析结果与根据传统形态学和生化特征分类的结果相一致。荧光实时定量PCR结果显示,Cyp19a1b在胡子鲇上述组织中均有表达,其中下丘脑中表达量最高,肝和精巢最低,在脑部的表达存在明显的性别差异(P<0.05)。此外,在胡子鲇性腺分化前(出膜后12 d)Cyp19a1b即开始表达,但分化前后表达量无显著性差异(P>0.05)。结果暗示Cyp19a1b可能不是引起胡子鲇性腺分化的直接因素,但其可能通过"下丘脑垂体性腺轴"对性腺分化过程产生间接影响。     

不同倍性鲫鲤性腺型芳香化酶cyp19a1a基因cDNA的克隆及表达

为研究性腺型芳香化酶P450aromA(cyp19a1a基因编码)在不同倍性鲫鲤卵巢发育过程中的作用,实验采用同源克隆和cDNA末端快速扩增技术(RACE),获得了二倍体红鲫、三倍体湘云鲫和四倍体鲫鲤的cyp19a1a基因cDNA全长。结果显示,3种鱼cyp19a1a基因均编码517个氨基酸残基,而且编码的蛋白都包含P450aromA特有的跨膜螺旋区、I-螺旋区、Ozol’s肽区、芳香化酶特异保守区以及血红素结合区。采用RT-PCR分析cyp19a1a基因mRNA在3种不同倍性鱼类组织中的表达情况,结果显示,cyp19a1a基因主要在实验鱼的卵巢中表达,其次在精巢、脑、脾脏有少量表达。采用实时荧光定量PCR对cyp19a1a基因mRNA在不同倍性鱼卵巢中的表达进行分析,结果发现,cyp19a1a基因在不同倍性鱼的非繁殖期卵巢的表达都高于繁殖期卵巢,并且在繁殖期和非繁殖期,cyp19a1a基因在三倍体湘云鲫的表达量高于二倍体红鲫和四倍体鲫鲤。采用免疫组织化学方法对CYP19A蛋白在不同倍性鲫鲤卵巢中的定位进行分析,结果发现,CYP19A蛋白主要定位在滤泡细胞、Ⅳ时相卵母细胞的放射膜上以及Ⅱ时相卵母细胞的卵浆中。研究表明,性腺型芳香化酶在不同倍性鲫鲤卵巢发育过程中的表达存在一定的差异性,三倍体鱼cyp19a1a基因mRNA水平表达异常,推测与其不育有关联性。     

Isolation, cloning, sequencing of brain type aromatase and its expression in male and female Wrasse, Pseudolabrus sieboldi

Pseudolabrus sieboldi, wrasse being a diurnal spawner provides a good opportunity to study the endocrine mechanism of estrogen formation in brain and gonads. Moreover, an extremely large amount of E2 was produced in serum and testis of wrasse. It is assumed that the presence of E2 may play a major role in diurnal gametogenesis in male fish. In this study brain type aromatase have been isolated, cloned and sequenced from the brain of wrasse. Further, the expression pattern of brain type aromatase in gonads and adult tissue of male and female fish have been analyzed. In addition, the diurnal expression pattern of brain type aromatase in both male and female fish brain during spawning season have been analyzed. The P450arom (br) was isolated, cloned and sequenced from both male and female bamboleaf wrasse. The P450arom (br) gene (1877 sequenced nucleotide) contains an ORF of 1470 bp, a 5′-UTR of 18 bp and at least 407 bp in 3′-UTR. The amino acid sequence homology in the coding region of wrasse P450arom (br) is high compared to that of medaka, Oryzias latipes (80%), rainbow trout type 2, Oncorhynchu mykiss (78.2%), fugu, Takifugu ribripes (78%) rainbow trout type 1, (76%), goldfish, Carassius auratus (66.8%) and zebrafish, Danio rerio (66.2%). Expression study reveals that P450arom (br) mRNA were most abundant in brains of both male and female fish throughout the day during the spawning season. RT-PCR study revealed that P450arom (br) was expressed in skin, anal fin and tail fin of both male and female wrasse. P450arom (br) was not detected at any time of the spawning day in either ovary or testis of wrasse.     

Aromatase (P450arom) and 11β-hydroxylase (P45011β) genes are differentially expressed during the sex change process of the protogynous rice field eel, monopterus albus

Steroids are known to play a crucial role in gonadal sex differentiation in many non-mammalian vertebrates, but also in the gonadal sex change of hermaphroditic teleosts. We investigated the expression of two genes encoding key steroidogenic enzymes, i.e., cytochrome P450 aromatase (P450arom) and cytochrome P45011β-hydroxylase (P45011β), during the sex change of the protogynous rice field eel, Monopterus albus. Using RT-PCR with degenerate primers, we cloned rice field eel homologous fragments for both genes (rcP450arom and rcP45011β) as indicated by the high level of homology with P450arom and P45011β sequences from various vertebrates. Gonadal expression of rcP450arom and rcP45011β mRNA levels were then assessed during the sex change by semi-quantitative RT-PCR and a real-time RT-PCR. rcP450arom was predominantly expressed in ovary, much less in ovotestis, and barely in testis. Conversely, P45011β was markedly up-regulated at the onset of testicular development. These findings underline that regulation of steroidogenesis is an important process in the sex change of protogynous rice field eel, and they clearly indicate that the concomitant down-regulation of P450arom and up-regulation of P45011β are of pivotal importance to the sex change of this species.     

Expression of cytochrome P-450aromatases in the sex-reversed Nile tilapia

Present study revealed the expression of ovarian (oP450arom) and brain (bP450arom) type cytochrome P-450 aromatases in the gonads and brains of sex reversed Nile tilapia.     

Immunolocalization of steroidogenic enzymes (P450scc, P450c17, P450arom) in gonad of Japanese eel

Antibodies against P450scc, P450c17 and P450arom were generated using recombinant proteins. In eel testis, P450scc and P450c17 were immunolocalized as clusters in Leydig cells. In vitellogenic eel ovary, P450scc and P450c17 immunoreactive cells were localized as clusters in the outer layer of the ovarian follicle. In contrast, P450arom seemed to be immunolocalized in the innermost follicle layer.     

Regulation of steriodogenic enzyme mRNAs in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) ovarian follicles in vitro

The effect of gonadotropins, forskolin and IGF-I on steroidogenic enzyme gene expression and E2 production by the rainbow trout follicle were measured. The results indicate that 3β-HSD gene expression is regulated by gonadotropins partially through the cAMP/PKA mechanism. The effect of IGF-I on P450arom mRNA levels suggests that IGF-I is a major regulator of P450arom gene expression.     

Effects of water temperature on the gonadal development and expression of steroidogenic enzymes in the gonad of juvenile red seabream, Pagrus major

The effects of water temperature on the development of hermaphroditic gonads in red seabream (Pagrus major) and on mRNA expression of cytochrome P450 aromatase (P450arom) and 11β-hydroxylase were examined. High water temperature suppressed both expression of P450arom and 11β-hydroxylase and the development of oocytes in ovarian portion of hermaphroditic gonads.