中国对虾不同凝集素基因应答WSSV侵染的表达差异

本研究探讨了7种细胞凝集素基因在中国对虾中应答白斑综合征病毒(WSSV)感染上的生物学功能差异.结果显示,LT1 (DQ167572.1)、LT2(EU834289.1)、LT3 (EU834292.1)和LT5(EU834290.1)是肝胰腺组织特异、受WSSV感染诱导表达的基因,其他3种基因主要在肌肉、肠和腮中表达,与WSSV感染诱导无明显相关;在应答WSSV感染不同时间段的表达特征上,7种凝集素基因各不相同;在各组织中的表达量上,方差分析表明7种凝集素基因除在肝胰腺中的表达上存在显著差异外,其他组织中不存在显著差异.这些结果显示这7个凝集素基因在应答WSSV侵染的表达特征上存在较大差异,推测其在中国对虾体内免疫防御功能上的作用也各不相同.     

WSSV感染对中国明对虾bantam及其候选靶基因的影响

Bantam能够调控细胞增殖、细胞凋亡等过程,影响生物的免疫过程。本研究利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对感染WSSV的中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)肝胰腺和鳃组织内bantam表达水平进行检测,发现感染WSSV后6、12、24和48 h,中国明对虾肝胰腺中的bantam表达水平分别是对照组的(0.16±0.03)(P<0.05)、(0.63±0.26)、(0.32±0.06)(P<0.05)和(0.41±0.13)倍;中国明对虾鳃中的bantam表达水平分别是对照组的(0.30±0.17)(P<0.05)、(1.88±0.26)(P<0.01)、(0.84±0.36)和(0.51±0.25)倍。利用miRanda软件进一步对中国明对虾bantam靶基因进行预测分析,评分最高的靶基因是泛素缀合酶E2。中国明对虾泛素缀合酶E2包含UBCc功能域。多序列比对显示,UBCc功能域氨基酸残基序列在不同物种间保守性较高。进化树分析显示,分类学地位相近的物种的泛素缀合酶E2聚为一类。qRT-PCR检测感染WSSV的中国明对虾肝胰腺和鳃中的泛素缀合酶E2表达水平,结果显示,在感染WSSV后6、12、24和48 h,中国明对虾肝胰腺中泛素缀合酶E2的表达水平分别是对照组的(0.54±0.10)、(1.19±0.62)、(3.69±0.51) (P<0.01)和(1.94±0.07)(P<0.05)倍;中国明对虾鳃中泛素缀合酶E2的表达水平分别是对照组的(0.22±0.05)、(1.34±0.38)、(4.29±0.52)(P<0.01)和(1.28±0.79)倍。研究表明,bantam和泛素缀合酶E2的表达都受WSSV侵染的影响,可能与中国明对虾和WSSV之间的互作相关。但bantam和泛素缀合酶E2表达水平的变化是对虾抵抗WSSV侵染过程的免疫反应,还是宿主基因被病毒胁迫后的结果,需要进一步验证。     

中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis) Tetraspanin-3与WSSV的体外相互作用

Tetraspanin-3是四跨膜蛋白超家族的一员,在信号转导和免疫等过程中起到重要作用。本研究将中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis) Tetraspanin-3 (FcT3)的大胞外环区(Large extracellular loop, LEL)基因片段克隆,与原核表达载体pBAD/gⅢA连接,获得重组表达载体pBAD/gⅢA-T3L,转化入大肠杆菌TOP 10中,用L-阿拉伯糖(L-Arab)诱导并经钴离子亲和层析纯化得到重组蛋白。质谱分析显示,纯化的重组蛋白为FcT3。用地高辛将FcT3L标记并与WSSV作用,Far-western分析显示,FcT3L与VP26结合。ELISA实验结果显示,FcT3L与VP26蛋白的相互作用随VP26量的增加而增强。推测FcT3通过与VP26作用介导病毒核衣壳的入胞过程。     

中国明对虾caspase2基因克隆及其在抗白斑综合征病毒中的表达分析

采用RACE技术克隆获得中国明对虾caspase2基因cDNA序列全长,并对该序列进行分析。结果显示,中国明对虾caspase2基因全长为1517 bp,开放阅读框长924 bp,5'非编码区长78 bp,3'非编码区长515 bp,命名为FcCasp2。推测该基因编码307个氨基酸,预测分子量为34.21 ku,理论等电点为7.62。同源性和系统进化分析发现,FcCasp2基因与凡纳滨对虾caspase2和斑节对虾caspase的相似性分别为88%和80%,与其他节肢动物caspase家族基因聚为一类。荧光定量RT-PCR结果显示,FcCasp2基因在肝胰腺中的相对表达量最高,在肌肉中表达量最低。WSSV感染后该基因在中国明对虾肌肉、肝胰腺和鳃丝中的表达量有不同的时空表达趋势,表明FcCasp2基因可能参与中国明对虾生物胁迫的应答反应。     

中国明对虾BMP-7基因的克隆及表达模式分析

为探明转化生长因子-β (TGF-β)超蛋白家族的成员之一骨形态发生蛋白7 (BMP-7)基因在中国明对虾肌肉发生和生长过程中的表达模式,通过cDNA末端快速扩增技术得到了中国明对虾BMP-7基因(FcBMP-7基因)2003 bp的全长cDNA,包含466 bp的5′非翻译区和295 bp的3′非翻译区,1242 bp的开放阅读框共编码413个氨基酸。利用实时荧光定量PCR技术分析FcBMP-7基因在中国明对虾幼体原肠期、无节幼体期、溞状幼体期、糠虾幼体期、仔虾期5个不同发育时期肌肉组织中的表达规律,结果显示,该基因在幼体发育的各时期均有表达,原肠期表达量最低,从无节幼体期开始表达量显著增加(P<0.05),糠虾期表达水平最高,表明FcBMP-7基因参与了幼体肌肉的发生过程。此外,进一步分析FcBMP-7基因在中国明对虾2种规格幼虾[(3.95±0.08) g和(1.55±0.12) g]的8种组织中的表达模式,结果显示,FcBMP-7基因具有组织表达广泛性,且两组间的大部分组织的表达量均存在显著差异(P<0.05)。试验结果表明,FcBMP-7基因可能作为调节因子参与了...     

不同温度下凡纳滨对虾和中国明对虾对白斑综合征病毒(WSSV)耐受性比较

本研究分别对凡纳滨对虾"壬海1号"(Litopenaeus vannamei"Renhai No.1")和中国明对虾"黄海2号"(Fenneropenaeus chinensis"Huanghai No.2")在3种温度条件下(24℃、28℃和32℃),采用单尾定量口饲感染白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的方法进行感染实验,比较2种对虾在不同温度情况下对WSSV的耐受性差异(L代表凡纳滨对虾,F代表中国明对虾)。结果显示,L-24℃和F-24℃组的平均存活时间分为(184.05±69.56)h和(101.68±38.45)h;L-28℃和F-28℃组的平均存活时间分别为(100.25±26.79)h和(73.38±22.22)h,相同温度组内均存在显著性差异(P0.05);截至第15天,L-32℃和F-32℃组的存活率分别为45.74%和23.47%。3个温度组对虾在50%的死亡率时的存活时间分别为178 h和98 h、98 h和74 h、292 h和78 h;死亡高峰时间分别为第5天和第4天、第5天和第4天、第10天和第4天。另外,分别在感染后的12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d、15 d共9个时间点对每组对虾进行活体取样,利用实时荧光定量RT-PCR技术对其进行病毒载量检测,从对虾体内肌肉组织病毒载量的角度探寻不同对虾抗病性能的差异。6 d时,L-24℃和F-24℃组对虾肌肉内病毒载量分别达到(2.97×10~6±7.44×10~6)和(8.08×10~6±3.22×10~6)copies/ng DNA,差异极显著(P0.01),L-28℃和F-28℃组分别达到(6.73×10~6±1.49×10~6)和(1.20×10~7±6.15×10~5)copies/ng DNA,差异极显著(P0.01);15 d,L-32℃和F-32℃组分别达到(5.18×10~4±4.32×10~4)和(3.78×10~4±8.97×10~4)copies/ng DNA,差异显著(P0.05)。研究表明,2种对虾在3种温度环境下感染WSSV后,凡纳滨对虾耐受WSSV能力要高于中国明对虾;不同温度下同种对虾肌肉体内WSSV的增殖能力从强到弱依次为28℃组、24℃组和32℃组。     

中国明对虾酚氧化酶原基因cDNA的克隆与表达特征

利用3′和5′RACE技术从中国明对虾血细胞中克隆了一个酚氧化酶原基因FCproPO,FCproPO基因cDNA全长为2311bp,其中开放阅读框2061bp,编码687个氨基酸,预测分子量为78.71ku。推测的序列与凡纳滨对虾同源性为84%,与日本囊对虾同源性为71%。RT-PCR实验结果表明,FCproPO在血细胞中的相对表达量最高,在心脏和精巢中几乎不表达。序列分析发现FCproPO含有两个保守的铜离子结合位点;进化分析发现FCproPO与斑节对虾、日本囊对虾、凡纳滨对虾等海水虾的酚氧化酶原亲缘关系最近。该基因在被鳗弧菌和对虾白斑病毒(WSSV)感染后的对虾肝胰腺中的表达量显著增加,并具有不同的时空表达趋势,提示中国明对虾FCproPO基因在免疫反应中具有重要作用。     

显微介导中国对虾基因鲤肌肉蛋白差异表达分析

本文通过显微注射方法,将中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）总DNA直接导入鲤（Cyprinus carpio L.）受精卵内,获得显微介导中国对虾基因鲤。为了研究显微介导中国对虾基因鲤蛋白质的表达变化,利用i TRAQ技术定量蛋白质测序分析了未进行显微介导和显微介导中国明对虾基因的2种鲤的肌肉组织,寻找与氨基酸和脂肪酸相关的差异表达蛋白,并分析了差异表达蛋白GO功能注释和KEGG代谢通路。结果共鉴定蛋白质999个,表达差异蛋白92个,其中上调蛋白58个,下调蛋白34个。差异蛋白Pathway富集分析表明,显著富集于脂肪酸和氨基酸等代谢通路上的差异蛋白有13个,其中在精氨酸和脯氨酸代谢通路中发现的上调7.51倍的肌酸激酶（creatine kinase）有促进鱼类肌肉发育的作用;而在脂肪酸代谢通路中发现的下调0.59倍的线粒体三功能蛋白（mitochondrial trifunctional protein）,有提高鱼体内多种饱和与不饱和脂肪酸含量的作用。同时对筛选到的两个蛋白进行实时荧光定量PCR验证,证实了蛋白质组的分析结果。     

中国明对虾MKK3 基因cDNA 克隆及其在氨氮胁迫下的表达

采用RACE技术克隆获得中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)丝裂原活化蛋白激酶激酶3(MKK3)基因全长c DNA序列,并对该序列进行分析。结果表明,该基因全长为1434 bp,开放阅读框长1011 bp,5′非编码区长33 bp,3′非编码区长390 bp,将该基因命名为Fc MKK3。推测该基因编码336个氨基酸,分子量为37.89 k D,理论等电点为6.08。同源性和系统进化分析表明,Fc MKK3基因与丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)和地中海实蝇(Ceratitis capitata)的相似性分别为69%和68%,与其他节肢动物MKK3聚为一类。荧光定量RT-PCR结果表明,Fc MKK3基因在肌肉中的相对表达量最高,其次为鳃。氨氮胁迫后该基因在中国明对虾肠、鳃、胃、心脏、肝胰腺、肌肉和血细胞中的表达量均显著增加,并有不同的时空表达趋势,表明Fc MKK3基因可能在中国明对虾应对非生物胁迫反应的过程中起着重要的作用。     

中国明对虾WSSV携带量、生长和抗WSSV育种值的相关性分析

为评估中国明对虾生长及抗WSSV能力与中国明对虾WSSV携带量之间的相关性,实验对130个中国明对虾家系进行生长及抗WSSV性能测试,对收集到的中国明对虾生长和抗病数据,输入“水产动物育种分析与管理系统”数据库,利用综合选择指数法估计中国明对虾各个家系的育种值。根据分析结果,选择出生长育种值最大的5个家系和最小的5个家系、抗WSSV育种值最大的5个家系和最小的5个家系,分别检测上述20个家系的亲虾、养殖50 d及170 d中国明对虾的WSSV携带量。结果显示,亲虾、50 d中国明对虾及170 d中国明对虾的WSSV携带量分别为0.190 8、0.286 6和0.232 9 copies/ng DNA,三者之间差异均不显著。亲虾、50 d中国明对虾和170 d中国明对虾的WSSV携带量与中国明对虾的生长育种值相关系数分别为 0.021、0.363和0.185,亲虾、50 d中国明对虾和170 d中国明对虾的WSSV携带量与抗WSSV育种值相关系数分别为0.033、0.048和0.019。研究表明,中国明对虾的生长育种值和抗WSSV育种值与中国明对虾体内的WSSV携带量均无显著的相关性。     

Three tetraspanins from Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis, may play important roles in WSSV infection

Three members of the tetraspanin/TM₄SF superfamily were cloned from Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis . The deduced amino acid sequences of the three proteins have typical motifs of the tetraspanin/TM₄SF superfamily. Phylogenetic analysis of the proteins, together with the known tetraspanins of invertebrates and vertebrates, revealed that they belong to different tetraspanin subfamilies: CD9, CD63 and tetraspanin-3. The three cloned genes of CD9, CD63 and tetraspanin-3 showed apparently different tissue distributions. The CD9 gene ( FcCD9 ) was specifically expressed in the hepatopancreas. While for the CD63 gene ( FcCD63 ), the highest expression was detected in nerves, epidermis and heart, with low expression in haemocytes, ovary, gill, hepatopancreas and stomach and no expression in intestine, muscle and lymphoid organ. Compared with FcCD9 and FcCD63 , the tetraspanin-3 gene ( FcTetraspanin-3 ) was more broadly expressed and its highest expression was detected in the intestine. Its expression in nerves was lower than in the intestine, but was higher than in other tissues. Expression in haemocytes, ovary and muscle was much lower than in other tissues. The expression profiles of FcCD9 , FcCD63 and FcTetraspanin-3 in different tissues, including haemocytes, lymphoid organ and hepatopancreas, were compared by real-time PCR when shrimp were challenged by live white spot syndrome virus (WSSV) and heat-inactivated WSSV. All three tetraspanins were markedly up-regulated in the live WSSV-challenged shrimp tissues. The data suggested that the three cloned members of TM₄SF superfamily in Chinese shrimp may play a key role in the route of WSSV infection.     

中国对虾雄性生殖系统感染WSSV在其垂直传播中的作用

通过人工感染实验,对中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)雄性亲虾进行投喂感染。在确定其携带WSSV粒子后,将被WSSV感染的精荚人工移植到健康的雌虾纳精囊内。在无其他病源的情况下,促其产卵繁殖,统计各组子代的受精率、孵化率及无节幼体至溞状幼体的变态率贸?式PCR技术对亲虾及子代进行WSSV检测。结果表明,受WSSV感染的精荚能够把病毒传播给健康雌虾,雌虾能产出携带WSSV的卵子,培育出带毒幼体。各组子代的受精率、孵化率及变态率的统计结果表明,感染组和对照组在受精率上没有明显区别,受WSSV感染的精卵细胞可以正常结合。对照组受精卵的孵化率明显高于感染组,差异显著(P=0.045<0.05)。对照组无节幼体的变态率也高于感染组。说明WSSV的入侵对受精卵及幼体的发育有影响,WSSV感染导致部分受精卵及幼体不能正常发育或死亡。     

控制环境养殖下近交对中国对虾早期体重和抗WSSV性状的影响

过量的捕捞和不合理的人工育种措施,使中国对虾野生和养殖群体的遗传多样性均遭到不同程度的降低。本试验在相似的环境条件下养殖了40个野生对虾产生的家系和3个兄妹交产生的家系,定量测定了平均体重(1.43~1.58) g 1 460尾中国对虾早期体重和感染白斑综合征病毒（WSSV）后存活时间的近交衰退系数。结果显示,野生对虾家系组的平均体重和平均存活时间分别为(1.58±0.01) g和(100.43±0.68) h,而兄妹交家系组平均体重和平均存活时间分别是(1.43±0.04) g和(85.84±1.70) h,平均体重和平均存活时间在两组间均存在极显著差异（P<0.01）。野生对虾家系组体重和存活时间的表型相关系数为0.16±0.00,而兄妹交家系组两者间的表型相关系数为0.20±0.00,但是两组间表型相关系数差异不显著（P>0.05）。近交系数每增加10％,体重和感染WSSV后存活时间分别衰退-3.80%±0.17%和-5.81%±0.11%,与近交能够降低生长和疾病抗性的观点相一致。实验结果表明,在选择育种和种质资源保护过程中都应该保证基础群体遗传背景最大化,从而有效控制近交。图0表2参39     

中国明对虾抗白斑综合症病毒分子标记的筛选

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对经过连续4代选育的抗白斑综合症病毒(WSSV)中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)(174)及未经选育的与174来源相同的中国明对虾野生群体(HB)进行分析,以期筛选出与抗病性状相关的分子遗传标记,为进一步的基因定位以及中国对虾的种质资源保护和分子标记辅助育种提供有力的技术支撑和理论依据。共进行220个RAPI)单引物和114对双引物的检测,产生标记数目共计2439个。依据标记在群体中出现的频率和变化规律,共筛选出5个可能与抗病相关的特异性标记,对这些特异性标记进行测序并将测序结果进行BLAST分析,发现测得片段的序列与数据库中序列的相似性较低,未能找到与所测序列同源性较高的功能基因。这与利用AFIP技术分析的结果一致。由于选育过程施加人工选择,推论这些特异性标记虽不是抗WSSV分子标记,但可能与抗病性状密切相关。     

对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP110在中国明对虾鳃细胞中结合蛋白的鉴定与特性

为了鉴定对虾白斑病综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP110在中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞中的结合蛋白, 运用pET-32(a)+载体构建了1段含RGD模体的截短VP110原核重组表达质粒, 转化大肠杆菌诱导表达后获得分子量为41 kD的截短重组VP110蛋白(rVP110)。以rVP110作为诱饵蛋白, 运用pull-down实验结合蛋白质谱分析鉴定rVP110结合蛋白, 结果显示, 中国明对虾鳃细胞中的肌动蛋白和精氨酸激酶(arginine kinase,AK)与rVP110具有结合作用。利用PCR扩增中国明对虾AK编码基因, 将其与表达载体pGEX-4T-1连接后转化大肠杆菌诱导表达获得重组AK蛋白(rAK), 通过pull-down实验进一步证实rAK可与rVP110发生结合。克氏原螯虾(Procambarus clarkia)体内中和实验结果显示, rAK对WSSV感染克氏原螯虾具有一定的中和作用, 能延缓螯虾的死亡进程。另外, 中国明对虾在人工感染WSSV后, 荧光定量PCR检测结果显示, AK基因表达水平显著上调, 18 h时达到峰值, 然后下降至正常水平; 酶底物法检测结果同样显示, 鳃细胞中AK酶活性在感染WSSV后发生显著上调。本研究旨在为深入了解WSSV囊膜蛋白VP110在WSSV感染宿主过程中的作用提供基础依据。

     

中国对虾几个产卵场群体携带白斑综合征病毒状况调查

白斑综合征可以导致养殖对虾短时间内大面积死亡,是迄今为止对虾养殖业面临的最大挑战。本试验采用巢式PCR法对2001年采自黄渤海的中国对虾几个产卵场群体进行白斑综合征病毒检测,旨在较全面地了解黄渤海野生中国对虾携带病毒状况。各群体的阳性检出率分别为：朝鲜半岛南海岸群体55％;渤海湾群体35％;辽东湾群体94．7％;海州湾群体47．4％。结果显示,中国对虾几个产卵场群体均不同程度地携带白斑综合征病毒。辽东湾产卵场群体阳性检出率明显高于其他群体,推测人工孵化苗种放流、海湾的地理和水质条件与中国对虾的WSSV感染率相关。而中国对虾野生群体携带病毒对于对虾养殖业的影响是不容忽视的,笔者认为,只有从无特异病原(SPF)及抗特异病原(SPR)对虾养殖群体的建立着手才能从根本上避免由于对虾携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。同时,应该重视海区污染的治理,减少病毒病暴发的诱因。本试验建立了快速检测WSSV的PCR方法,1pg病毒核酸仍可检测到,为白斑综合征病毒病的防治及早期诊断提供了有效的手段。     

感染白斑综合症病毒中国对虾雄性生殖系统的PCR检测与电镜观察

通过人工投喂携带WSSV的毒饵，对性腺发育成熟的中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）雄虾（♂）进行感染实验。采用nest-PCR（巢式PCR）技术，检测感染后的中国对虾雄性生殖系统受WSSV感染情况，同时选取感染严重的虾样进行电镜观察。巢式PCR检测结果表明，感染组中国对虾的精巢、输精管和精囊均被WSSV感染，其中精囊呈阳性的最多，输精管次之，精巢最少。通过电镜进一步观察发现，WSSV粒子只存在于精巢、输精管和精囊的结缔组织中，而在其他组织和生殖细胞中均未发现病毒粒子。其中，精巢中WSSV粒子存在于精巢内两个生精小管之间的结缔组织；输精管中WSSV粒子存在于管壁的结缔组织；精囊中WSSV粒子也只存在于精囊内膜的结缔组织和精荚膜的结缔组织中。PCR检测和电镜观察结果均表明，WSSV粒子能感染中国对虾的雄性生殖系统且对性腺感染存在着一定的组织特异性。     

中国明对虾组织蛋白酶L 的原核重组表达及其组织分布

组织蛋白酶L属于半胱氨酸蛋白酶中的木瓜蛋白酶超家族,在哺乳动物中它与抗原提呈、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等许多生命活动有关。但对其在无脊椎动物中的功能了解的不多。从中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)中克隆得到了组织蛋白酶L基因,为了进一步研究组织蛋白酶L的组织分布及其功能,对该基因进行了重组表达。将中国明对虾组织蛋白酶L基因的酶原片段亚克隆进原核表达载体pET30a中,转化大肠杆菌BL21(DE3),再进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳检测,其分子量在40kD左右,与期望的中国明对虾组织蛋白酶L的分子量一致。表达产物形成包涵体,经过对包涵体变性和复性,并进行His-tag柱亲和纯化,得到了纯化的蛋白。利用重组蛋白制备了的兔抗血清。Western实验表明,组织蛋白酶L在中国明对虾的肝、胃、肠中有表达,而在卵巢中没有表达。