橙色莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）和荷那龙罗非鱼（O．hornorum）的选育效果评价

以橙色莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）和荷那龙罗非鱼（O．hornorum）为基础群体，分别对其进行选育，并对产生的选育系F4代的选育效果进行了评价。经过4代的选育，橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼的日增重率分别比对照系提高了27．96％和36．73％，差异显著（P〈0．05），平均每代选育效应分别为6．99％和9．18％。F4代的体重变异系数分别为23．74％和22．17％，比对照组分别降低了24．83％和36．33％。而且第一次性成熟时这2种罗非鱼的平均体重都比对照系增加2倍以上，其杂交子代的雄性率达到了99．4％。试验结果表明，橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼的选育效果明显，F4代的生长性能有了显著提高，个体之间的生长速度趋于一致；也说明这2种罗非鱼F4代仍具有一定的选育潜力，对其继续进行选育是切实可行的。     

荷那龙罗非鱼、橙色莫桑比克罗非鱼及其杂交F1呼吸耗氧率的初步研究

用呼吸室法对荷那龙罗非鱼、橙色莫桑比克罗非鱼及其杂交F1的呼吸耗氧率、窒息点进行了试验。试验结果表明:①水温为16~32℃时,平均体重为10.40~116.28 g的荷那龙罗非鱼的耗氧率在0.07~0.61 mg/g.h,平均体重为18.98~102.53 g的橙色莫桑比克罗非鱼的耗氧率范围是0.06~0.43 mg/g.h,平均体重2.24~133.82 g的杂交F1莫荷鱼的耗氧率范围是0.06~0.65 mg/g.h;3种试验鱼的耗氧率随着温度的升高而增加;耗氧率与鱼体规格呈负相关。②3种实验鱼的耗氧率均为白天高于夜间。③水温24℃时,3种试验鱼的溶氧临界窒息点分别是:荷那龙罗非鱼0.33~0.55 mg/L,橙色莫桑比克罗非鱼0.24~0.31mg/L,莫荷鱼为0.38~0.43 mg/L。     

莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼耐盐性的初步研究

用人工配制的6个盐度咸水(0、15、25、30、35、40),对莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼耐盐性进行了初步研究。结果表明:在几种耐盐指标中,莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼的96小时半致死盐度分别为22．29和21．56;在除盐度为40外的其它各盐度梯度中,莫桑比克罗非鱼的50％成活时间和平均成活时间均高于荷那龙罗非鱼,但差异不显著 (p>0．01)。在对2种罗非鱼的盐度驯化过程中,各个驯化盐度梯度下,莫桑比克罗非鱼的死亡率均小于荷那龙罗非鱼的死亡率。     

半滑舌鳎促滤泡激素基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

从半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther脑垂体中提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到半滑舌鳎促滤泡激素（FSH）基因全长cDNA序列。半滑舌鳎FSHcDNA全长为541bp,开放阅读框为393bp,编码130个氨基酸（GenBank序列登录号：JQ277933）。发现一个N-糖基化位点：24～27NTT。与其他脊椎动物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明,半滑舌鳎FSH与鲽形目和鲈形目鱼类FSH同源性为42％～49％,与鲤形目和高等脊椎动物FSH同源性为27％～319/5。用MEGA4．0软件构建了NJ树,获得的进化树表明,半滑舌鳎FSH与其他鱼类FSH聚类,亲缘关系较近。实时荧光定量组织表达分析表明,FSHmRNA除在垂体中大量表达外,其他组织也有表达,尤以脑、性腺表达量较高。半滑舌鳎FSHmRNA在垂体以外组织中的广泛表达,暗示FSH可能具有广泛的生理功能。     

军曹鱼MHC-Ⅰα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法，得到1330bp的军曹鱼（Rachycentroncanadum）MHC-Ⅰα全长cDNA片段。该序列包括76bp的5’末端非编码区（UTR），189bp的3’UTR及1065bp的开放阅读框（ORF），编码354个氨基酸，预测其蛋白质分子量约40．10kDa，等电点5．70。构建MHC-Ⅰα氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸相似性比对，结果表明，军曹鱼和已知鱼类及人类（Homosapiens）MHC-Ⅰα氨基酸的同源性在27．9％～67．1％之间。所推测的蛋白序列具有一些重要特征，包括前导肽、α1、α2、α3区、CP／TM／CYT区和保守的半胱氨酸等。Real—timePCR检测结果显示，MHC-Ⅰα基因在各个正常军曹鱼组织中均表达，但表达量各有不同，其中较强的表达于头肾；中等程度表达于鳃、脾和肠；在心、脑和肌肉中表达较弱。     

佛罗里达红罗非鱼黑色素浓集激素1基因的克隆与表达分析

采用同源克隆技术获得了佛罗里达红罗非鱼(Oreochromis sp.)前原黑色素浓集激素1(prepro-melanin concentrating hormone 1,pmch1)基因c DNA全长序列,将其命名为flpmch1;并通过实时荧光定量PCR(q RTPCR)分析天生黑斑佛罗里达红罗非鱼组织表达谱和低温胁迫后其各组织表达差异。结果表明,flpmch1 c DNA序列全长629 bp,开放阅读框411 bp,编码136个氨基酸,存在12个潜在磷酸化位点和1个长度为199 bp的Cp G岛。Flpmch1与24个物种Pmch1氨基酸序列比对结果表明,Flpmch1与尼罗罗非鱼(O.niloticus)、奥利亚罗非鱼(O.aureus)、莫桑比克罗非鱼(O.mossambicus)、布氏新亮丽鲷(Neolamprologus brichardi)的Pmch1相似性最高。系统进化树分析显示硬骨鱼纲Pmch聚成一个大支,Flpmch1与尼罗罗非鱼Pmch1进化地位最接近。组织表达谱分析显示,flpmch1 m RNA在多个组织中均有表达,其中在脑中表达量最高,且粉白色皮肤中的表达量显著高于黑色皮肤(P0.01)。低温胁迫后flpmch1 m RNA各组织表达量较对照组均呈下调表达。推断flpmch1可能参与了佛罗里达红罗非鱼天生黑斑的形成和过冬黑化过程。     

乌鳢脑型芳香化酶基因cDNA的克隆及组织表达分析

为了解乌鳢(Channa argus)性别分化相关机制,采用RT-PCR和RACE法克隆了乌鳢脑型芳香化酶基因Cyp19a1b cDNA部分序列,运用半定量RT-PCR和q PCR技术检测其在雌雄个体组织中的表达情况。结果显示,乌鳢Cyp19a1b cDNA部分序列为1 432 bp,包括120 bp 3'-UTR和1 311 bp编码区,编码436个氨基酸。序列比对表明乌鳢Cyp19a1b氨基酸序列包含三个功能保守区,与毛足鲈、平鲷和金钱鱼Cyp19a1b同源性较高,分别为89%、88%和88%。半定量RT-PCR和q PCR结果显示,乌鳢Cyp19a1b基因在雌、雄成鱼垂体中表达量高,在肠组织中表达量低,在雄鱼脑组织中呈现高表达而在雌鱼脑组织中则未表达,在其他组织均未检测到表达,表明乌鳢Cyp19a1b基因的表达存在组织特异性及功能差异。     

尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因的克隆、表达及多态性分析

为进一步了解鱼类MHC ⅡA基因的特点及其在免疫反应中的功能,采用同源克隆、RACE-PCR、巢式PCR等技术,从健康的尼罗罗非鱼体获得1 205 bp的MHC ⅡA基因cDNA全序列(Orni-DBA-0101,Genebank登录号:JF719813)及1 388 bp的基因组序列。序列分析发现,尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因含4个外显子和3个内含子,开放阅读框长720 bp,编码239个氨基酸。从4尾尼罗罗非鱼中共得到8条不同的cDNA序列,分别编码不同的氨基酸序列。氨基酸序列比对后发现,序列间存在丰富的多态性,且主要集中在α-1区,多态性位点数远远高于半滑舌鳎MHC ⅡA基因。生物信息学分析表明,尼罗罗非鱼MHC ⅡA编码的蛋白质分子包含1个信号肽、2个胞外结构域、1个跨膜区和1个胞质区,存在4个保守的半胱氨酸残基以及丰富的磷酸化位点,与其他物种的相似性为23%～65%。RT-PCR结果表明,MHC ⅡA基因在脾、肾、肠、鳃、性腺、肝、心脏表达量很高,在鳔和肌肉中表达量最低。人工感染嗜水气单胞菌后,肝、脾、肾、鳃、肠5个组织中MHC ⅡA基因的mRNA水平均发生了不同程度的变化,提示MHC ⅡA分子作为一种重要的免疫因子,在清除病原的免疫反应中起着重要作用。     

泥蚶乙二醛酶Ⅰ基因的克隆及时空表达特征分析

为探索贝类乙二醛酶Ⅰ基因的结构及功能特征,实验利用RACE技术首次克隆获得泥蚶乙二醛Ⅰ基因(Tg-GLOI)的cDNA全长序列,并对其氨基酸序列特征及时空表达特征进行了研究。结果发现,Tg-GLOI基因的cDNA全长序列为1 807 bp,开放阅读框为540 bp,编码180个氨基酸,在27~169 aa处具有典型的乙二醛酶系保守序列;成熟的乙二醛酶Ⅰ由2个相同的亚基组成,每个亚基由乙二醛Ⅰ基因编码,其二级结构由18个α-螺旋、20个β-折叠片和36个转角组成,每个亚基各含1个Zn2+;氨基酸序列比对发现,Tg-GLOI氨基酸序列与太平洋牡蛎的同源性达到86.1%,与其他脊椎动物的同源性也都在70%以上,表现出高度保守性。qRT-PCR结果显示,Tg-GLOI基因在泥蚶成贝8个组织中均有表达,在内脏团中的表达量最高,极显著地高于其他组织(P0.01);在各发育时期中,Tg-GLOI表达量随发育进程呈逐渐升高的趋势,在眼点幼虫期达到最高,极显著高于其他时期(P0.01),而在幼虫变态至稚贝时,表达量又极显著地下降(P0.01)。研究表明,Tg-GLOI具有类似于高等动物的分子结构,并在泥蚶不同组织、不同发育时期表达差异显著,这为进一步研究该酶在贝类中的功能和作用机制奠定了重要基础。     

半滑舌鳎促性腺激素α亚基cDNA的克隆及组织表达特征

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法,从半滑舌鳎脑垂体中克隆了促性腺激素α亚基（CGα）全长cDNA（GenBank序列登录号：JQ364953）.半滑舌鳎CGα基因全长685bp,其开放阅读框384bp,编码含127个氨基酸的蛋白,N端33个氨基酸为信号肽.半滑舌鳎CGα成熟肽与其他脊椎动物CGα成熟肽结构特征相似,具有10个半胱氨酸残基和两个N-糖基化位点.CGα成熟肽序列分析表明,半滑舌鳎CGα与鲽形目和鲈形目鱼类CGα同源性为60％～70％,与鲤形目鱼类CGα同源性为55％～60％.实时荧光定量RT-PCR结果表明,半滑舌鳎CGα mRNA在被检测的12个组织中均有表达,除头肾和脾脏、脾脏和肝脏间表达量差异不显著外,其他组织间表达量差异显著（P＜0.05）;CGα mRNA在垂体组织中大量表达,其次是鳃、肾脏、肌肉、卵巢和脑组织,而在心脏、头肾、肝和脾等组织中表达量很低.本研究为进一步探讨促性腺激素在半滑舌鳎繁殖生理中的作用机制奠定基础.     

细胞核rDNA序列用于罗非鱼及其杂交种鉴别的初步研究

罗非鱼种间，尤其是尼罗罗非鱼与杂种尼奥罗非鱼之间，很难区分。本文对尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、莫桑比克罗非鱼和杂交种尼奥罗非鱼（尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂）和红罗非鱼的核糖体DNA内部转录间隔子1（ITS1）序列及其两侧的18S和5．8s部分序列特征进行分析，以筛选种间鉴别标记。PCR扩增产物大小约700bp，测序结果表明，（去除引物后）18S长146bp，5．8S长66bp，不同种类之间无差异；ITS1长383-483bp，因种类不同而异，其GC含量大于AT含量，达到67．1％。序列比对分析结果表明，18S和5．8s片段高度保守，但各有3个变异位点可以把上述几个种和杂种相互区分开；18S序列上有一个UnbI限制性酶切位点，可作为尼罗和尼奥罗非鱼的鉴别标记。ITS1序列种间变异大，系统发育分析表明，所研究的5个种聚成2个类群，尼罗与尼奥罗非鱼为一组，莫桑比克-红罗非鱼-奥利亚罗非鱼为另一组。组内种间遗传距离较小，尼罗和尼奥罗非鱼的种间遗传距离为0．006；莫桑比克、奥利亚和红罗非鱼的种间遗传距离在0．007-0．009之间；两组罗非鱼之间的遗传距离较大，在0．030-0．035之间，表明罗非鱼ITS1序列多态性较高，适合于种类区分。结合部分18S和5．8S序列，细胞核rDNA具有鉴别罗非鱼及其杂种的潜力。     

莫荷罗非鱼“广福1号”与其亲本间DNA甲基化的差异分析

为了探讨罗非鱼杂种优势形成过程中基因组DNA甲基化模式的变化,运用甲基化敏感扩增多态技术(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)分析橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其杂交种莫荷罗非鱼"广福1号"的皮肤、肌肉和鳃等11种组织的DNA甲基化水平差异。采用16对引物进行选择性扩增,经聚丙烯酰胺凝胶电泳带型分析结果显示:莫荷罗非鱼"广福1号"及其亲本在不同组织间的甲基化水平存在组织特异性,相同组织不同亲、子代罗非鱼间的甲基化程度亦不同;橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼以及"广福1号"各组织平均总甲基化水平分别为32.21%、38.03%和29.77%,莫荷罗非鱼"广福1号"的甲基化水平低于双亲;与亲本相比,莫荷罗非鱼"广福1号"的甲基化模式除了大多数保持稳定遗传(A、B、C类型分别为19.67%、29.99%、25.42%)之外,24.92%胞嘧啶位点发生去甲基化和超甲基化,且去甲基化位点(E类型,15.73%)多于超甲基化位点(D类型,9.19%)。研究表明,莫荷罗非鱼"广福1号"基因组DNA的低甲基化特征和甲基化模式的重调可能与耐盐杂种优势有关。     

A novel cytochrome P450 1D1 gene in Nile tilapia fish (Oreochromis niloticus): partial cDNA cloning and expression following benzo-a-pyrene exposure

To understand the detoxification and bioactivation mechanisms for organic contaminants, it is essential to identify the cytochrome P450 (CYP) complement. Therefore, this study aimed to clone a partial cDNA sequence of the novel CYP1D1 gene from the fish Oreochromis niloticus and examine whether intraperitoneal injection of benzo-a-pyrene (BaP), a potent AHR agonist, is capable of inducing CYP1D1 mRNA expression in different tilapia fish tissues. The cloned nucleotide sequence consisted of 713 bp representing a portion of the tilapia CYP1D1 cDNA ORF, encoding 237 amino acids. Amino acid sequence comparison of O. niloticus CYP1D1 with the sequences of CYP1D1 from other species showed that this gene shared the highest identity of 81% with Fundulus heteroclitus CYP1D1. Furthermore, analysis of the percent identities shared by the deduced amino acid sequence of O. niloticus CYP1D1 with the sequences of CYP1 from other species revealed that the highest identities were shared with fish CYP1As. Real-time PCR results revealed that the highest expression level of CYP1D1 mRNA was found in muscles, followed by gills, liver, and intestine, while there was no detectable expression recorded in bile acid. These results indicate that tilapia CYP1D1 plays an important role in the metabolism of xenobiotics, expanding our knowledge regarding the diversity of CYP1 genes in this important model fish species.

     

Identification and expression analysis of two growth hormone receptors in zanzibar tilapia (Oreochromis hornorum)

Growth hormone plays important roles in various physiological processes such as growth, metabolism, and reproduction. In this study, two cDNAs encoding growth hormone receptor (GHR) were isolated from the liver of zanzibar tilapia (Oreochromis hornornum). The two cDNAs were 2,831 and 2,044 bp in length and named GHR1 and GHR2, respectively. GHR1 and GHR2 shared 57.4% similarity in nucleotide sequences and 33.5% similarity in deduced amino acid sequences. Consequently, it was presumed that they were two different genes. Conserved regions of GHR1 and GHR2 in zanzibar tilapia were different from those of other vertebrates. For example, conserved box2 regions of GHR1 and GHR2 in zanzibar tilapia were, respectively, WVELM and WVEFT, while it was WVEFI for GHRs in other vertebrates. Similar to other fish species, GHR1 and GHR2 were expressed in brain, gill, liver, muscle, spleen, gonad, stomach, kidney, and pituitary in zanzibar tilapia. The expression levels were the highest in liver. Unlike fathead minnow (Pimephales promelas) and mossambique tilapia (O. mossambicus), the expression levels of GHR1 in most female fish tissues were higher than those in male fish. No significant difference in GHR2 expression was found in all the tissues in male and female of zanzibar tilapia. Under fasting condition, the expressions of GHRs and IGF-II were significantly up-regulated (P < 0.05) in liver, while the expression of IGF-I remained stable. This observation would contribute to understanding the evolution of the GHR family in further investigation of growth regulation of zanzibar tilapia.     

Optimum Density of Red Tilapia Oreochromis mossambicus×O. urolepis hornorum in a Pulsed-Flow Culture System

Abstract.— Densities of 9 tilapia (hybrid Oreochromis mossambicus × O. urolepis hornorum)/m³ gave the highest production among five densities (1, 3, 6, 9, and 12 fish/m³) tested in a pulsed-flow culture system. Culture of fish in irrigation ditches may have great potential for integrating fish farming with irrigated agriculture. Each 1,000 meters of ditch could potentially produce up to 1,400 kg of tilapia during a 112-d growing season.