大鲵虹彩病毒β-丙内酯灭活方法的研究

为探讨β-丙内酯(β-propiolactone,BPL)灭活大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)的最适条件,研究了BPL对GSIV的灭活方法。采用终浓度分别为0.025%、0.05%、0.1%、0.2%的BPL灭活细胞培养的GSIV,4℃条件下分别灭活24 h、48 h、72 h、96 h,通过细菌培养、细胞培养、病毒核酸PCR扩增以及鱼体感染试验进行灭活病毒的安全性检验,确定最适灭活条件。试验结果表明,GSIV经终浓度为0.1%的BPL 4℃灭活处理72 h后可完全灭活病毒,灭活病毒无细菌污染,接种对GSIV敏感的鲤上皮瘤细胞系(EPC)细胞无细胞病变效应(CPE)出现,病毒主衣壳蛋白(MCP)基因特异性引物PCR反应未扩增出靶基因产物,灭活病毒对健康大鲵的感染试验未出现疾病症状。灭活效果检测结果表明,与未灭活GSIV相比较,最适灭活条件下的GSIV结构蛋白与抗原性未发生显著变化。结论显示BPL可用来灭活GSIV,本研究确立了BPL灭活GSIV的最适条件,为大鲵虹彩病毒细胞培养灭活疫苗研究奠定了重要基础。     

鳜脑组织细胞系的建立及其病毒敏感性研究

鱼类细胞是开展鱼类病毒分离鉴定、功能基因分析以及生物制品制备等研究的重要物质基础。鳜(Siniperca chuatsi)是深受养殖者和消费者欢迎的养殖品种。随着鳜鱼养殖产量的逐年增加,其病害问题尤其是病毒病问题也日趋严重,但是,可用于鳜鱼病毒分离和基因功能分析的鳜细胞系缺乏。本研究采用组织块消化法,对来源鳜脑组织的细胞进行原代培养,建立了鳜脑组织细胞系,命名为MFB。MFB细胞在28℃含10%胎牛血清的L-15中已稳定传代超过70次,第25代鳜脑组织细胞的染色体众数为56。采用免疫荧光细胞化学技术(β-tubulin和Neu-N)鉴定MFB细胞的神经元纯度,结果显示,培养的MFB细胞为神经元类细胞。病毒敏感性实验结果显示,鳜蛙虹彩病毒(MFRaIV)、大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBRaIV)和大鲵虹彩病毒(GSIV)均可在MFB细胞中产生典型细胞病变效应,病毒滴度分别为108.68±0.12、108.36±0.15、1010.15±1.85 TCID50/mL。使用脂质体Lipofectamine®2000将pEGFP-N1转入MFB细胞,转染效率可达20%。本研究建立的鳜脑组织细胞系不仅对多种蛙虹彩病毒敏感,而且转染质粒效率较高,为鳜病毒性病原的分离及基因功能研究奠定了前期基础。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型的理化及生物学特性和超微形态发生

为了查明鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,Cy HV-2)的理化与生物学特性以及病毒在细胞内的超微形态发生过程,利用新建立的对Cy HV-2敏感的异育银鲫脑组织细胞系(Gi CB),对Cy HV-2的理化及生物学特性进行了详细研究,比较了不同来源鱼类细胞系对Cy HV-2感染的敏感性,并对体外培养细胞中Cy HV-2病毒粒子及其超微形态发生过程进行了电镜观察。结果显示,Cy HV-2对热、酸、碱、有机溶剂和冻融敏感;常用鱼类细胞系EPC、RTG-2、Koi-Fin、CIK、CCK、PF-Fin对Cy HV-2的感染不敏感,特异性巢式PCR检测盲传至第7代Cy HV-2细胞培养物,结果均为阴性;Cy HV-2在Gi CB细胞中的增殖动态研究结果表明:病毒感染细胞经过12 h的隐晦期,24 h开始进入对数生长期,96 h病毒滴度达到最高值(107.52±0.26 TCID50/m L),然后进入平台期;透射电子显微镜观察结果显示,Cy HV-2感染细胞可分为吸附与侵入、复制与装配、成熟与释放3个主要过程,病毒进入对数生长期后,被感染细胞内可见形态典型的疱疹病毒颗粒。     

RNA干扰对大鲵蛙病毒主要功能基因表达及其增殖的影响

采用q PCR与病毒滴度测定观察RNA干扰(RNA interference,RNAi)对大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)、甲基转移酶(methyltransferases,MTases)、DNA多聚酶(DNA polymerase)基因表达与病毒增殖的影响。结果表明,小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)能推迟鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papillosum cyprini,EPC)出现病变,且病变程度也较对照组轻。在各功能基因表达量上,NC-FAM对照组与阴性对照组差异不显著(P0.05);而干扰组的干扰率极显著高于阴性对照组,其中siR-DP-1组siRNA对MCP基因的干扰率为79%,极显著高于其余组(P0.01);siR-MT-1、siR-MT-2组siRNA对MTases基因的干扰率为77%,极显著高于其余组(P0.01);siR-DP-1组siRNA对DNA polymerase基因的干扰率为79%,极显著高于其余组(P0.01)。干扰实验组病毒滴度与NC-FAM对照组和阴性对照组相比也有不同程度的降低。阴性对照组lg TCID50为8.362,NC-FAM对照组lg TCID50为7.848,siR-MCP、siR-MT、siR-DP实验组最低lg TCID50分别为5.764、5.317、5.362。证实RNAi能够抑制CGSRV主要功能基因的表达并影响病毒的复制。     

三种水生动物细胞系对两株蛙病毒敏感性的比较

利用3个不同物种的水生动物细胞系,包括爪蟾肾细胞系(A6)、大鲵胸腺细胞系(GSTC)和鲤上皮瘤细胞系(EPC),分别用沼泽绿牛蛙蛙病毒(RGV)和大鲵蛙病毒(ADRV)感染,进一步研究细胞病变显微形态、病毒滴度、细胞病变与不同感染时间的相关性等。结果显示,在光镜下可见感染病毒的细胞发生病变,A6和EPC细胞肿胀或破裂;GSTC细胞收缩或聚在一起形成多层。同种水产动物细胞系对不同蛙病毒的敏感性不同,在A6、EPC和GSTC细胞中,RGV的滴度分别为10~(3.6)、10~(5.9)和10~(6.6) TCID_(50)/m L;ADRV的滴度分别为10~(4.3)、10~(5.4)和10~(6.1) TCID_(50)/m L,表明GSTC细胞系对两种蛙病毒都更敏感。研究为后续蛙病毒致病机理提供了有用的信息和重要实验材料。     

鳗鲡疱疹病毒的生物学及理化特性

为了明确鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AngHV)的生物学及理化特性,本实验利用一株从欧洲鳗鲡"脱黏败血综合征"病料中分离的AngHV病毒株,研究了其增殖特性及其对主要鱼类细胞系的感染敏感性,进一步分析了其对热、酸碱、氯仿和乙醚等理化因子的耐受性。结果发现,AngHV感染的鳗鲡卵巢细胞系(eel ovary cell line, EO)内可见典型的疱疹病毒样颗粒,细胞出现时序性细胞病变;AngHV可在EO细胞系内稳定传代,较适宜扩繁温度为25～27°C,不能在鲤上皮瘤细胞系(epithelioma papilloma cyprinid cell line, EPC)、草鱼卵巢细胞系(grass carp ovary cell line, CO)、胖头逓肌肉细胞系(fathead minnow cell line, FHM)、大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(chinook salmon embryo cell line,CHSE-214)、虹鳟性腺细胞系(rainbow trout gonad cell line, RTG-2)及蓝鳃太阳鱼细胞系(bluegill fry cell line, BF-2)等鱼类细胞内增殖;理化特性分析表明,37°C处理30 min,AngHV滴度降低不明显,而56°C处理30 min可完全灭活AngHV;AngHV对酸(pH 3.0)敏感,而对碱(pH 10.0)较耐受,同时对氯仿和乙醚敏感。本研究结果可为AngHV的综合防控及疫苗的开发提供参考依据。     

虎纹蛙病毒体外培养及其理化特性

从发病濒死的虎纹蛙（Rana tigrina rugulosa)蝌蚪中分离到一种病毒，在25℃条件下，该病毒能在鲤鱼表皮瘤细胞系（EPC），胖头Shiu肌肉细胞系（FHM）和草鱼性腺细胞系（CO）三种鱼类细胞上产生空斑状的细胞病理变化（CPE）。该病毒对氯仿，热（56℃，20min)和酸（pH3)敏感，其体外培养的适合增殖温度范围为20-30℃，电镜下观察，病毒为对称的二十面体，切面正六边形，对角直径125nm左右。     

大鲵虹彩病毒的PCR检测及初步应用

通过了解大鲵虹彩病毒(Giant salamander iridovirus,GSIV)在EPC细胞接毒情况和PCR的实际检测情况,为大鲵的病毒检测提供必要判断依据和检测方法.通过细胞接毒和组织分离分别提取病毒质粒,进行普通PCR扩增,电泳分析,比较病毒细胞培养和组织直接提取结果.Gsiv病毒体外培养:经传代48 h的EPC细胞,25℃培养,12h后可观察到CPE出现,24 h病变明显,CPE达15％,48 h后CPE可达70％,72 h后细胞完全脱落;PCR检测:对3个样本分别从组织提取和经细胞扩增分离的病毒进行普通PCR扩增检测,经细胞培养扩增的3个样本全部呈阳性;经组织提取的3个样本,2个呈阳性,一个呈阴性;电泳观察,病毒的扩增产物在500 bp左右.在体外环境下GSIV是高病力的一种病毒,对EPC细胞在25℃时效应时间为3d,普通PCR经组织的检出率低,经细胞培养扩增可提高检出率但耗时久,不利于实际生产中快速、准确诊断疫情的需要.     

大鲵细胞与大鲵虹彩病毒的微载体规模化培养工艺及优化

利用Cytodex 3微载体悬浮培养系统规模化培养大鲵肌肉细胞(GSM)和大鲵虹彩病毒(GSIV),研究了微载体培养GSM细胞的形态和增殖特性,同时测定了病毒在培养系统中的增殖动态相关指标。结果显示,在Cytodex 3微载体培养系统中,将GSM细胞在贴壁期以转速30 r/min,每静置40 min搅拌2 min的方式间歇搅拌,10 h后贴壁率可达95%,培养基中最适血清浓度为10%,最适微载体浓度为2 g/L,最适细胞初始接种密度为1.2×10~5 cells/mL;增殖期以25 r/min的连续搅拌方式可以达到最佳的细胞生长效能。倒置显微镜与扫描电镜观察结果显示,GSM细胞呈长梭形,紧密贴附在Cytodex 3微载体上,生长良好。采用优化的工艺条件培养GSM细胞,以感染复数(MOI)为0.5的剂量接种GSIV至规模化培养的GSM细胞,48 h后GSM细胞出现典型的细胞病变效应,72 h病毒滴度达到最高TCID_(50)=10~(–8.50±0.20)/mL。本研究为大鲵虹彩病毒病疫苗的规模化生产工艺研究奠定了前期基础。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)特性和对鲤春病毒的敏感性

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)是中国科学院水生生物研究所在20世纪70年代开展草鱼出血病研究时建立的一株细胞系,迄今已传至300多代,在中国鱼类病毒学研究领域发挥了重要作用.本研究采用形态学观察、细胞生长曲线测定、细胞周期测定、细胞核型分析、细胞凋亡检测、电镜观察等方法,对GCO的生长特性及鲤春病毒血症病毒(SvCv)在该细胞中的增殖特性等进行了研究.结果显示,GCO细胞的最适生长温度为25℃,在M199和MEM等细胞培养液中均能较好地生长,培养液中最适的胎牛血清浓度为10％.测定了GCO细胞系对SVCV病毒的敏感性,发现与鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞系(EPC)、肥头鲤(Pimephales promelas)细胞系(FHM)、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)胚胎细胞系(CHSE-214)等世界动物卫生组织(OIE)推荐和各检测实验室常用的鱼类细胞系相比,GCO细胞系对SVCV表现出非常高的敏感性.生长盐线、电镜观察和凋亡实验显示,SVCV能引起GCO细胞系出现明显而稳定的细胞病变,引起GCO细胞系出现凋亡,并在细胞质中大量增殖.结果表明,GCO细胞系适用于SVCV病毒的分离、检测以及病毒致病性的有关研究.GCO细胞的适宜生长温度为15-28℃,这一特点将使它可以广泛地用于多种水生动物病毒的分离.     

大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV)主要衣壳蛋白(MCP)编码区长度为1 392 bp 的片段, 克隆到 pMD19-T载体上, 构建重组质粒 pMD19-T-MCP。经PCR鉴定确认正确后, 以10倍梯度稀释 pMD19-T-MCP重组质粒, 作为标准模板进行 TaqMan实时荧光定量PCR扩增, 制作标准曲线, 建立了大鲵虹彩病毒的 TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。制作的标准曲线有极好的线性关系, 且线性范围宽, 相关系数为0.990 19。组内重复试验的CT值标准偏差为0.52%。检测结果显示, 该方法对大鲵虹彩病毒的检测有高度的特异性, 与锦鲤疱疹病毒、弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌以及鲤上皮瘤细胞基因组DNA之间均无交叉反应, 特异性好, 检测总DNA灵敏度为10个病毒核酸分子拷贝数, 约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸, 较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍。研究建立的大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强, 对大鲵虹彩病毒病的快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

大鲵病毒性疾病最新研究进展

中国大鲵(Andrias davidianus)是我国的特有物种,具有极高的产业开发价值,但病毒性疾病严重危害大鲵人工养殖产业的健康发展。本文对大鲵虹彩病毒的分类地位及主要特征、大鲵虹彩病毒病的病理症状及诊断防治措施几个方面进行了简要概述,以期为大鲵病毒性疾病的深入研究提供科学依据。     

大黄鱼ATG5基因的分子特征及促进病毒增殖的作用研究

自噬是维持真核细胞稳态的重要过程，在细胞分化、发育、免疫等生理过程中发挥作用。目前，人们对于自噬相关基因（Autophagy related gene，ATG）在鱼类免疫应答中的功能仍知之甚少。本研究从大黄鱼（Larimichthys crocea）中克隆得到了自噬相关基因ATG5（LcATG5），其开放阅读框（ORF）全长828个核苷酸，编码275个氨基酸的蛋白质，预测的分子量为32.3 kD，等电点为5.7。氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示，LcATG5与其他物种ATG5之间的序列一致性较高，含有1个高度保守的APG5结构域，并且与棘头梅童鱼（Collichthys lucidus）ATG5的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明，LcATG5在所检测的11个组织或器官中均有表达，在血液中表达量最高，在脾脏中表达量最低；LcATG5在来源于大黄鱼头肾组织的原代粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞以及细胞系LYCK细胞中也均有表达，在原代粒细胞中表达量相对较高，而在巨噬细胞中相对较低；病毒类似物poly(I:C)刺激后，这4种免疫细胞中LcATG5的表达水平都显著上调，其在LYCK细胞中变化最为显著，刺激后12 h上调了3.93倍。过表达LcATG5的鲤上皮瘤（Epithelioma papulosum cyprinid, EPC）细胞受鲤春病毒血症病毒（Spring Viremia of Carp Virus, SVCV）感染48 h后，细胞病变效应（Cytopathic effects, CPE）明显高于对照组，细胞培养上清中SVCV的滴度为1013.82 TCID50/Ml，高于对照组109.27 TCID50/mL，同时细胞内SVCV标志基因SVCV-G、SVCV-M和SVCV-P的表达量分别上调了13.77倍、15.72倍和11.39倍，表明LcATG5过表达促进了EPC细胞中SVCV病毒增殖，这些结果为深入研究自噬和自噬相关基因在鱼类病毒感染过程中的作用及机制奠定了基础。     

一株传染性造血器官坏死病病毒的致病性研究

为了对分离于山东某虹鳟养殖场的一株传染性造血器官坏死病毒株(IHNV-Sn1203)进行致病性检测与研究,将该IHNV-Sn1203毒株进行虹鳟鱼苗人工回接感染实验。结果显示,8d内人工感染实验鱼累计死亡率高达100%。收集大批濒死的病鱼样本,制备病理组织切片;利用鲤上皮细胞(EPC)进行细胞感染实验、病毒电镜观察、空斑实验、病毒滴度检测和聚类分析。病理组织切片显示,该病毒可造成虹鳟造血器官广泛性坏死;细胞感染实验结果显示,接种24 h后EPC细胞出现葡萄串状典型细胞病变(cytopathic effect,CPE),72 h后大部分细胞崩解脱落形成网状孔洞;电镜下清晰可见弹状病毒粒子大量存在于细胞质内,其在EPC细胞上的滴度为108.36TCID50/mL,并能形成2~4 mm空斑。对病毒核蛋白氨基酸序列的聚类分析结果显示,该病毒与标准毒株RB-1和WRAC的同源性分别为97%和93%,与国内报道的zyx株具有最高的同源性(99%)。研究表明,IHNV-Sn1203毒株能够在鱼体及敏感细胞中稳定繁殖,产生典型病变,具有较高的病毒滴度,对虹鳟鱼苗有很高的感染性和致死性。     

一株湖北源大口黑鲈蛙病毒的分离鉴定

采用电子显微镜观察和细胞培养等技术, 从湖北黄陂某养殖场患病大口黑鲈(Micropterus salmoides)体内发现并分离到一株蛙病毒。患病大口黑鲈的临床症状主要表现为体表出血、溃疡, 肝脏发白。将病鱼内脏组织匀浆超微滤液接种鳜脑细胞系(mandarin fish brain, MFB)细胞能产生典型细胞病变效应(cytopathic effect, CPE), 病毒滴度达到 10^8.36±0.15 TCID₅₀/mL。细胞培养病毒的超薄切片电镜观察结果显示, 细胞质中存在大量直径约为 150 nm 左右的正六边形病毒粒子, 呈晶格排列。细胞培养病毒的人工感染大口黑鲈试验结果显示, 7 d 内试验鱼死亡率高达 100%, 其临床症状与自然发病鱼相似。采用大口黑鲈病毒(largemouth bass virus, LMBV)的特异性 PCR 检测方法对患病鲈组织样品和细胞培养病毒样品进行检测, 均能扩增出 241 bp 的单一目的条带。进一步根据 GenBank 中 LMBV 主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因序列设计特异性引物, 均能从上述样品中扩增出 1392 bp 的 MCP 基因开放阅读框(open reading frame, ORF)全长。将 MCP 氨基酸全序列进行比对, 结果显示其与 Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型及大口黑鲈溃疡综合征病毒的 MCP 氨基酸序列同源性高达 100%。系统进化结果显示, 与感染鱼类的虹彩病毒科蛙病毒属病毒, 如鳜鱼蛙病毒、Santee-Cooper 蛙病毒、孔雀鱼病毒 6 型和大口黑鲈溃疡综合征病毒等聚成一支。这些结果证明, 该分离株为虹彩病毒科蛙病毒属的成员, 暂命名为大口黑鲈蛙病毒(largemouth bass ranavirus, LMBRaV)湖北株 LMBRaV-HB001。病毒敏感细胞系筛选试验结果表明, 病毒 LMBRaV-HB001 感染鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid, EPC)、草鱼性腺细胞(grass carp ovary, GCO)、大鲵肌肉细胞(giant salamander muscle, GSM)和鲫脑组织细胞(gibel carp brain, GiCB)均能产生典型 CPE, 病毒滴度可达 10^8.0 TCID₅₀/mL 以上。本研究首次在湖北省养殖大口黑鲈体内分离与鉴定了 LMBRaV 病毒, 建立了病毒的细胞培养方法, 为进一步研究该病毒的传播、诊断和防控技术提供了重要参考。