免疫层析快速诊断试纸条在猪病诊断上的应用

胶体金免疫层析技术是一种微量、特异、简便和结果容易判定的新的检测方法,非常适用于基层兽医和猪场。本文综述了免疫层析快速诊断试纸条在养猪业上的应用情况。     

哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条的制备

用18~20nm胶体金标记抗哈维氏弧菌Vibrio harveyi抗体并制备金标垫,分别将羊抗兔Ig G和纯化后的抗哈维氏弧菌抗体包被于NC膜上作为质控线和检测线,组装制作了哈维氏弧菌胶体金免疫层析试纸条,优化了该试纸条的制作条件,测试了其性能。结果表明:所制备的哈维氏弧菌免疫层析试纸条具有较好的特异性,与费尼斯弧菌Vibrio furnissii、维氏气单胞菌Aeromonas veronii、美人鱼发光杆菌Photobacterium damselae、类志贺邻单胞菌Plesiomonas Shigelloides、鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri、鳗利斯顿氏菌Listonella anguillarum、迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda、海豚链球菌Streptococcus iniae、嗜水气单胞菌Aeromonas Hydrophila等9种常见水产病原菌无明显交叉反应,检测灵敏度为3×105CFU/m L,5~10min即可得出检测结果,具有快速、简便、特异性强和适应基层推广应用等优点,可用于养殖鱼类病原哈维氏弧菌的现场检测。     

甲基睾酮免疫胶体金试纸条的研制及在水产品中的应用

通过研究胶体金免疫层析技术,建立了一种快速检测水产品中甲基睾酮含量的方法。将待测样品中的甲基睾酮和试纸条检测线上包被的人工抗原(MT-BSA)竞争性结合金标结合垫上包被的胶体金-甲基睾酮单抗聚合物,根据检测线呈现的红色线条深浅来判定样品的阴阳性。结果显示:试纸条上MT-BSA抗原工作浓度为1.0mg/m L,羊抗鼠二抗工作浓度为1.5 mg/m L,试纸条的最低检测限达到10μg/kg,与甲基睾酮类似物的交叉反应率低;使用甲醇提取,4倍PBST稀释,整个检测所需时间仅10~15 min,适用于大规模样品筛选。     

羊早孕诊断试纸条的研制

用抗孕酮单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体分别包被检测线和质控线,优化了金标抗体、质控线和检测线的包被条件和抗体浓度,应用层析式双抗体夹心法原理研制羊早孕诊断试纸。通过检测尿液中孕酮含量的变化推断是否怀孕,结果显示检出率为47.8%;通过了稳定性和重复性实验,获得了理想的效果,值得在基层推广。     

水产品中苯甲酸快速检测试纸条的制备

选择柠檬酸三钠还原制备胶体金,制备的胶体金粒径为20～40 nm;利用胶体金来标记苯甲酸单克隆抗体,再将BA人工合成抗原（BA-BSA）和羊抗鼠二抗（IgG）分别包被在硝酸纤维素膜的T线和C线处,组装成胶体金免疫层析试纸条,快速检测水产品中苯甲酸。结果表明,单抗的最佳标记量为5.0μg/mL,最佳pH为9.0,复溶液为0.5%的Tween 20、pH为9.0的0.5 mol/L Tris;抗原的最佳包被量为7.0μL,二抗的最佳包被量为9.0μL,胶体金标记抗体量为5.0μL,胶体金免疫层析试纸条的目测检测限为1.0 mg/L。试验对苯甲酸试纸条的重复性、稳定性、假阳性及假阴性率的测试验证,结果良好。该试纸条对甲苯、苯乙酸、苯磺酸、苯丙氨酸等均不发生交叉反应性。将试纸条方法和高效液相色谱法做比较,结果显示试纸条和高效液相色谱法结果一致。制作的试纸条在检测水产品中苯甲酸的测试中是可靠的,检测准确且高效。     

豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析试纸条的研制

采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体分泌细胞株,获取抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体,柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒,选择直径20 nm的胶体金颗粒,标记抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体并制备胶体金垫。将胶体金垫与喷涂有抗豚鼠气单胞菌兔多克隆抗体和羊抗鼠抗体的硝酸纤维素膜及样品吸收垫等组装成免疫层析试纸条,建立豚鼠气单胞菌的快速检测方法。用灭活细菌与血清混合的模拟样本测定试纸条的特异性、灵敏度,结果显示,试纸条对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、鳗弧菌、溶藻弧菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌等13种常见病原菌没有交叉反应,与豚鼠气单胞菌显示特异性反应,检测灵敏度为1×10⁶ CFU/mL,结果显示时间小于5 min。研制的豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析检测试纸条具有快速、简便、特异性高、适用于基层临床生产推广应用等优点。     

重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条快速检测新加坡石斑鱼虹彩病毒

[目的]为建立一种快速灵敏、可视化的适用于临床样品检测新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus,SGIV）的方法。[方法]本研究针对SGIV特异基因ORF014序列设计特异性引物及探针,建立重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）技术及结合侧流层析试纸条（lateral flow dipstick, LFD）（RPA-LFD）的SGIV检测技术。[结果]RPA反应使用10 μmol/L的引物浓度,在40.1℃恒温反应20 min即可完成特异性病毒的检测,最低检测限为100个／μl。RPA-LFD反应在42℃恒温反应8 min可将检测结果通过试纸条可视化呈现,最低检测限为10个／μl,且不与其他常见水生动物病原发生交叉反应,临床样品检测结果也与PCR检测结果一致。[结论]RPA、RPA-LFD均能特异性检测SGIV,两者的检测限均比常规PCR灵敏。[意义]RPA-LFD法具有快捷简单、结果可视化的特点,在临床应用具有较好的应用前景。     

河豚毒素胶体金免疫层析快速检测试剂盒的应用研究

在我国东南沿海地区,每年均有人因食用带有河豚毒素的河豚鱼或织纹螺引起中毒的事件。本文以河豚毒素标准品溶液分析河豚毒素胶体金层析快速检测卡的最低检测出限为0.5 MU/mL或100 ng/mL。根据河豚毒素限量值(10 MU/g)设计了织纹螺以及河豚鱼的样品前处理方法,进一步分析了20个织纹螺及河豚鱼实际样品,准确率为100%,单个样品测试时间为20 min。结果表明:河豚毒素胶体金层析快速检测卡具有灵敏度高、特异性好、操作简便、可通过肉眼直接判读结果的特性,尤其适合于基层检测机构、渔业管理单位及水产品加工企业对河豚鱼或织纹螺中河豚毒素的快速筛查与分析。     

盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇检测卡(试纸条)质量验证试验

当前,国内生产盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇检测卡(试纸条)的厂家众多,试剂条的质量参差不齐,同一厂家不同批次的产品质量差异很大,致使现场检测过程中,要么假阳性样品数量太多,增加了监管部门确认经费的负担,要么出理假阴性样品,导致兽药残留超标的畜产品流入市场,造成畜产品质量安全隐患。如何在使用前进行质量验证是确保试纸条检测结果准确有效的重要手段。文章探讨了快速检测试纸条的质量验证试验,提出三个验证参数"检测阈值、假阴性率、假阳性率"。指出"检测阈值"是个重要参数。     

胶体金免疫层析快速检测技术及其在水产养殖业中的应用前景

建立快速、准确、简便易行的病害早期快速检测技术,是从事动物疫病防控研究工作者和产业界人士的迫切愿望。自从开辟免疫分析技术以来,越来越多更灵敏、更便捷的免疫分析方法被开发出来,以胶体金免疫层析法为基础建立起来的快速检测试纸,被认为是当前最快捷、高敏感的一种免疫学检测技术。该项技术真正实现了快速简易检测靶目标,并已在畜牧业中得到普及应用,成为当前畜禽病害早期防控的最有效方法之一。本文就该项技术在畜牧兽医领域的研究进展、应用现状、发展前景进行了介绍、分析和讨论,旨在为水产养殖动物病害的早期诊断提供借鉴,以期获得一种适用于水产动物病害的、专用的快速检测新技术和新产品。     

Development of a rapid immunochromatographic strip test for the detection of Vibrio parahaemolyticus toxin B that cause acute hepatopancreatic necrosis disease

Here, two monoclonal antibodies (MAbs) specific to different epitopes on ToxB, a toxin produced by Vibrio parahaemolyticus that causes acute hepatopancreatic necrosis disease (VP_AHPND), were employed to develop a rapid strip test. One MAb was conjugated to colloidal gold to bind to ToxB at the application pad, and another MAb was used to capture colloidal gold MAb–protein complexes at the test line (T) on the nitrocellulose strip. To validate test performance, a downstream control line (C) of goat anti-mouse immunoglobulin G antibody was used to capture the free colloidal gold conjugate MAb. The sample in the application buffer could be applied directly to the application well, and the test result was obtained within 15 min. The sensitivity of the kit is approximately 6.25 µg/ml of toxin, which was equivalent to the toxin produced by approximately 10⁷ cfu/ml of bacteria. This kit is convenient and easy to use since it can be used to identify VP_AHPND directly using a single colony of bacteria grown on agar culture plates. Because of its high specificity and simplicity, as well as not being reliant on sophisticated equipment or specialized skills, this strip test could be used by farmers for surveillance for ToxB-producing bacteria.     

浅谈附红细胞体病的研究概况

附红细胞体病是由附红细胞体感染机体引起的一种人畜共患的传染病。而附红细胞体则是寄生于红细胞表面、血浆、及骨髓中的一类微生物。近年来随着我国养猪业的蓬勃发展,该病的流行已有越来越烈之势,并逐渐成为危害养猪业的传染病之一。本文就猪附红细胞体的病原特点、流行病学、发病机理、临床症状、病理变化、诊断及防治对策作一综述。     

猪瘟与仔猪副伤寒混合感染的诊断

2006年3月，开阳县某养猪场引进的商品猪发生一种死亡率为45％的疫病，经流行病学调查、临床症状与病理剖解观察、猪瘟荧光抗体试验和细菌分离培养与鉴定，确诊本次疫病系猪瘟与副伤寒混合感染所致。     

猪瘟与仔猪副伤寒混合感染的诊断

2006年3月,开阳县某养猪场引进的商品猪发生一种死亡率为45%的疫病,经流行病学调查、临床症状与病理剖解观察、猪瘟荧光抗体试验和细菌分离培养与鉴定,确诊本次疫病系猪瘟与副伤寒混合感染所致。     

凡纳滨对虾红体病病原菌间接ELISA快速检测方法的研究

以凡纳滨对虾红体病病原菌副溶血弧菌为抗原,免疫兔获得高免血清,建立一种快速检测凡纳滨对虾红体病病原菌副溶血弧菌的ELISA技术。采用棋盘滴定法确定抗原和抗血清的最适工作浓度分别为106CFU·mL-1和1∶2000;病原菌检测灵敏度为每孔104CFU;抗血清与其它细菌标准菌株的交叉反应结果均呈阴性;阻断实验中的阻断率达75.88%;交叉反应和阻断实验结果表明该方法具有较高的特异性。将该方法标准化后检测了30份人工感染后的凡纳滨对虾和健康凡纳滨对虾,阳性检测率分别为93.3%和13.3%,表明该技术不仅能够检测已发病的凡纳滨对虾,而且能够检测带菌的凡纳滨对虾,这对于水产养殖业中疾病的早期诊断有着重要意义。     

锦鲤疱疹病毒单交叉引物等温扩增检测方法的建立

本文根据锦鲤疱疹病毒(Koi herpes virus,KHV)保守的DNA聚合酶(Sph)基因,设计一组单交叉扩增引物,以构建的Sph基因重组质粒作为标准DNA模板,采用单交叉引物等温扩增技术(Single cross priming amplification,SCPA)进行扩增及优化反应体系,并结合核酸试纸条技术(Nucleic acid test strip detection method),建立了快速可视化检测锦鲤疱疹病毒的单交叉引物等温扩增检测方法(KHV-SCPA)。KHV-SCPA法可在63℃下60min内实现循环扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯形条带,可特异性地检测出KHV,灵敏度较之常规PCR方法提高约1000倍。结合核酸试纸条检测技术,在3~5min内可对反应产物进行可视化检测。KHV-SCPA检测方法不依赖昂贵的仪器设备与专业技术人员,可应用于锦鲤疱疹病毒的现场快速检测中,为锦鲤疱疹病毒病的准确快速诊断和有效防控提供了技术支撑。     

杀鲑气单胞菌可视化重组酶聚合酶扩增检测技术的建立

本研究根据杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的铁载受体(fstA)基因的保守序列设计特异性引物和探针,建立了一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与侧向流试纸条(lateral flow strips,LFS)相结合的可视化快...     

石斑鱼虹彩病毒病发生风险评估模型的建立和验证

为评估石斑鱼养殖过程虹彩病毒病发生的风险,实验结合Delphi法和层次分析法(analytic hierarchy process,AHP)构建新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)发生的风险评估模型.风险因素评估指标体系包括1个目标层(石斑鱼虹彩病毒病发生风险),5个准则层(水质、石斑鱼健康状况、饲养管理、养殖模式和养殖环...