黄鳍鲷基因组微卫星的分离

采用磁珠富集法构建黄鳍鲷(Acanthopagrus latus Houttuyn)基因组微卫星富集文库。共挑选60个克隆进行测序,分析发现58个克隆分别含(GA)n或(CA)n两碱基重复单元。进一步通过序列比对,最终获得41个具有特异微卫星序列的阳性克隆。其中,23个克隆含有(GA)n或(CT)n两碱基重复序列,17个克隆含有(GT)n或(CA)n重复序列,另1个含有以上两种重复类型。获得的微卫星序列中,单一型及间断型序列各有20条,另有1条属于复合型序列。序列长度为117~512 bp,平均259 bp。微卫星核心序列两碱基重复5到38次,绝大多数序列重复次数大于10。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了3对能够在黄鳍鲷基因组有效扩增的微卫星引物。本研究旨为进一步开展黄鳍鲷分子育种及资源评价分析提供基础资料。     

日本蟳微卫星富集文库的建立与多态性标记的筛选

采用磁珠富集法筛选日本蟳微卫星分子标记。日本蟳基因组DNA经Sau3 AⅠ酶切后,收集400~1 200 bp大小的片段并纯化,利用生物素标记的寡核苷酸探针(AC)¹⁵从中筛选出含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD18-T载体中,构建富集微卫星序列的基因组文库,经PCR检测筛选出阳性克隆进行测序。从随机挑选的970个菌落中筛选出369个阳性克隆进行测序,结果86.99%(321个)含有微卫星序列,其中完美型占80.54%,非完美型占15.95%,混合型占4.28%。除使用的探针AC重复外,还得到GA、CT等重复序列。共设计出102对微卫星引物,其中65对能扩增出清晰条带,27对具有多态性。同时筛选出的微卫星标记可为今后研究日本蟳的分子遗传育种提供有效的遗传标记。     

仿刺参微卫星标记的筛选及群体遗传结构分析

采用FIASCO(Fast Isolation by AFLP Sequences Containing Repeats)方法构建了仿刺参基因组富集CA微卫星序列的基因组短片段文库,筛选得到118条微卫星DNA序列。根据重复单元的排列特点,完美型共83个,占70.4%;非完美型共30个;占25.4%;复合型标记5个,占4.2%。选取其中20条微卫星序列设计引物进行多态性检测,并利用这20对引物对采自中国、韩国(西海岸及东海岸)、俄罗斯和日本沿海的野生仿刺参以及美国沿海的具疣拟刺参进行遗传多样性水平和遗传结构分析。结果表明,所设计的20对引物的扩增产物均具有多态性,其中16个位点为高度多态(PIC>0.5)。遗传多样性分析结果显示,20个微卫星座位的平均观察杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)分别为0.39和0.69,共检测到231个等位基因(102个有效等位基因),在每个座位上获得3～20个等位基因,平均等位基因数为11.6个,20个位点在6个群体中不同程度偏离遗传平衡(P<0.05),所有群体在整体上均表现为杂合子缺失(Fis>0);5个仿刺参群体间的遗传相似系数在0.71以上,相似性较高,而仿刺参群体与具疣拟刺参的相似性则较低。聚类分析结果表明,中国群体与韩国西海岸群体聚类成一支,而俄罗斯群体、韩国东海岸群体和日本群体聚类成另外一支,聚类的先后与它们在地理分布上的海域位置有一定的相关性。     

长江草鱼多态微卫星位点的分离及后备亲鱼的遗传多样性分析

本研究采用磁珠富集法分离了10对具有多态性的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)微卫星位点,并对140条长江野生草鱼组成的后备亲鱼群体的遗传结构进行了分析。结果显示:本试验得到的草鱼微卫星序列主要是以2个碱基为重复单位、重复次数在5～22之间的多重复单元,重复次数在10次以上的微卫星序列较易得到多态性;77个微卫星座位中,完美型、非完美型和混合型微卫星标记所占的比例分别为87.01%、2.60%和10.39%;群体遗传分析显示,10个多态性微卫星座位中,除了GC39座位外,其它座位都符合哈迪-温伯格平衡,适用于草鱼群体的遗传结构分析;每个座位检测到3～8个等位基因,平均有效等位基因数为3.9302,多态信息含量在0.4129～0.8107之间变动,平均为0.6678,除了GC78座位为中度多态外,其他9个座位均为高度多态。基因分化系数、Shannon指数、平均观测杂合度和平均期望杂合度的平均值分别为0.3457、1.4262、0.9511和0.7193,表明该群体的遗传多样性比较丰富。     

胭脂鱼微卫星富集文库的构建及其应用前景展望

以湖北武汉和四川宜宾人工增殖放流的胭脂鱼子一代酒精浸泡鳍条样本为材料,提取完整基因组DNA,选用人工合成的生物素标记(AAAG)7探针,采用FJASCO(fast isolation by AFLP of sequences containing repeats)磁珠富集法构建胭脂鱼(Myxocyprirnus asiaticus)微卫星富集文库.以Msel-N引物组和设计合成的微卫星核心序列引物(AAAG)5,用双引物PCR法筛选含有微卫星的阳性克隆,从54个阳性克隆中共获得22个微卫星序列,其中完美型(perfect)共15个(占68.2%),非完美型(imperfect)6个(占27.3%),混合型(compound)1个(占4.5%);(AAAG/ITYC)n序列在胭脂鱼的基因组DNA中含量非常丰富.根据微卫星侧翼序列最终设计并合成了18对胭脂鱼微卫星引物,经其有效性检验后,可应用于胭脂鱼遗传多样性、种群遗传结构等进一步研究及人工增殖放流效果评估.     

罗氏沼虾三群体线粒体D-loop基因序列差异的初步研究

通过测定罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)人工养殖群体(A)(浙江湖州)、缅甸引进群体F2代(B)和"南太湖1号"(C)3个群体线粒体控制区(D-loop)基因序列片段(约1200 bp),探讨罗氏沼虾群体遗传结构.结果发现,在用于分析的1121 bp基因序列中有86个变异位点,共计14个单倍型.其中,群体A、C的遗传多样性均较低,其π值分别为0.022和0.025,相比之下,群体B的遗传多样性则明显要高于上述两个群体(π=0.032).AMOVA分析表明,群体间的遗传变异占总遗传变异的6.32%,而93.68%的遗传变异源于群体内.对三群体的遗传学参数计算结果表明,群体A和B间遗传分化指数(Fst)为0.105,已达到中等分化水平;群体C与A间的遗传距离(D=0.025)最小,提示它们的亲缘关系最近.本研究结果认为,D-loop基因可以作为检测罗氏沼虾群体遗传差异的分子标记,"南太湖1号"群体遗传多样性比人工养殖群体有所提高,但仍偏向养殖群体,未表现出最高的杂种优势.     

斑节对虾基因组微卫星分离及其序列特征研究

采用(CA)_(12)(AG)_(12)及(TA)_(16)生物素标记探针及磁珠富集法构建了斑节对虾Penaeus monodon基因组微卫星富集文库。随机挑选254个克隆进行PCR筛选,得到51个候选克隆(20．1%)。其中,32个克隆来源于CA-文库,另19个克隆来源于AG-文库。测序发现48个克隆含有微卫星重复单元,通过序列比对,最终获得40个具有特异微卫星序列的阳性克隆。微卫星(GA/CT)_N及(CA/GT)_n 2碱基重复序列分别占所有分离的微卫星数目的20．7%及60．4%。此外,还检测到其它多种微卫星重复类型,如(AT)_n、(GC)_n、(TGG)_n、(AAG)_n、(AAT)_n、(GAA)_n、(GTGC)_n、(GCGT)_n、(GGTTA)_n、(GTGCGT)_n,占检测到的微卫星数目的18．9%。获得的微卫星序列中属于完全型序列的有76条(68．5%),不完全型序列的有22条(19．8%),另有13条属于复合型序列(11．7%)。微卫星(GT/CA)_n 2碱基重复次数(3～52次)要远大于(GA/CT)_n 2碱基次数(3～27次)。获得的微卫星序列长度大小范围为129～601 bp,平均为286 bp。研究为进一步开展斑节对虾分子育种及资源评价分析提供了基础资料。     

团头鲂微卫星标记的快速制备

采用磁珠富集法与放射性杂交相结合开发团头鲂（Megalobrama amblycephala）基因组微卫星资源。以团头鲂基因组DNA为材料，经Sau 3AⅠ限制性内切酶消化后，选取400～900bp的片段进行PCR全基因组扩增，并利用生物素标记的（CA）15探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中，然后利用γ-32P标记的放射性同位素探针进行第二轮杂交。结果表明，共获得微卫星基因组文库2000个菌，杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为50％；杂交后得到的阳性克隆为230个，占11．5％。从得到的230个阳性克隆中挑出120个进行测序，有94个克隆含有重复次数大于5次的微卫星序列，其中46个（48．94％）有随机侧翼区，可以设计引物；14个缺乏足够的侧翼序列。在得到的微卫星序列中，重复单元除CA／GT外，还观察到CT、AG、CG、CAA、CTCA等重复单元。在单一型标记中，完美础占53．15％，非完美型为37．84％；混合型标记占9．01％。另外，微卫星重复次数主要集中在5-30次，占75．68％。本研究旨在对团头鲂基因组资源的开发利用起到一定的促进作用，并为团头鲂养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等奠定基础。     

磁珠富集法制备大口鲶的微卫星分子标记

通过磁珠富集的方法分离大口鲶（Silurus meriaionalis）的微卫星分子标记。将基因组DNA酶切，梯度离心收集400～900bp片段并纯化，连接Brown接头，用生物素标记的寡核苷酸（CA）15作探针与其杂交，杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上，然后将这些片段洗脱，PCR扩增，进行克隆构建“基因组文库”，再通过同位素标记的探针（CA）15进行2次杂交筛选，所得到的阳性克隆测序。从所获得593个阳性克隆中选取178个经测序，97．19％（173个）含有微卫星序列，90．60％重复数在10以上，75．98％为完美型。除探针中使用的CA重复单元外，还观察到Cr、GA、ATG的重复序列。设计获得120对微卫星引物，合成40对经PCR筛选，结果31对引物扩增出多态性条带。显示出，磁珠富集法是获得微卫星分子标记的一种有效的方法，可成为今后发展该标记的主要方法。同时，制备出的微卫星标记可为今后研究大口鲶的分子遗传育种提供有用的遗传标记。     

企鹅珍珠贝微卫星分子标记的筛选

运用生物素与链霉亲和素的强亲和性原理,用生物素-磁珠吸附微卫星富集法,筛选企鹅珍珠贝(Pteria penguin)的微卫星分子标记序列,进而对南海区企鹅珍珠贝的遗传多样性进行分析。对136个菌落中的85个阳性克隆进行微卫星测序,获得64个序列,达到85.93%。所得到的55个重复6次以上的微卫星序列中,除生物素探针中使用的CA重复外,还得到TG、TC、GA的重复序列。重复序列中完美型36个,占65.5%;不完美型14个,占25.5%;混合型5个,占9.1%。利用Primer Premier5.0设计引物40对,合成其中的20对并进行PCR筛选,15对可扩增出特异性条带。研究表明,筛选出的企鹅珍珠贝微卫星分子标记可用于进一步的遗传多样性分析。     

合浦珠母贝微卫星DNA标记分离与分析

采用生物素标记的（CA）15、（AG）12、（ACA）15、（GATA）8、（GATT）75个探针和磁珠富集法构建马氏珠母贝（Pinctada martensii Dunker）基因组微卫星富集文库。随机挑选500个进行PCR筛选，得到138（27．6％）个候选克隆，测序分析发现130个克隆含有微卫星基重复单元。进一步通过序列比对，最终获得109个具有特异微卫星序列的阳性克隆，其中包含179个微卫星DNA结构域。获得的微卫星序列中，属于完全型序列的有154条，不完全型重复型序列有19条，复合型重复序列有6条。序列长度为70～490bp，平均295bp。微卫星核心序列两碱基重复3到39次，绝大多数序列重复次数大于10。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了13对能够在马氏珠母贝基因组有效扩增的微卫星引物。本研究旨为进一步开展马氏珠母贝分子育种及资源评价分析提供基础资料。     

2014年中国不同地区对虾白斑综合征病毒ORF14/15和ORF23/24缺失区序列比较

对虾养殖面临诸多病害威胁,对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是养殖对虾主要病原之一,WSSV不同地理株的变异可能导致WSSV毒力的变化。为了解2014年中国大部分地区WSSV ORF14/15和ORF23/24的变异情况,本研究选择2014年1月–8月期间采集的48份WSSV阳性样本,用特异引物扩增ORF14/15和ORF23/24片段,连接于T载体,转化至Top10中,筛选阳性克隆,测序分析不同样本之间的缺失差异。结果显示,能够扩增ORF14/15和ORF23/24样品的比例分别为43.75%和33.33%。在ORF14/15扩增中,分别扩增出1260 bp、1270 bp、1892 bp和2662 bp片段,与TH-96-Ⅱ比对共有4种缺失情况,即缺失6540 bp、6530 bp、5908 bp和5138 bp。而在ORF23/24扩增中,分别扩增出1140 bp和1146 bp片段,与中国台湾株(TW)比对有两种缺失情况,即缺失12070 bp和12064 bp。研究结果表明,WSSV在中国大部分地区存在一定程度的变异,而不同毒株之间在ORF14/15可变区差异比较明显,在ORF23/24可变区差异不大,但均具有大片段缺失。     

大黄鱼EST微卫星标记初步筛选

通过构建大黄鱼性腺线性化cDNA文库，并经测序后获得3535条EST，对其二碱基至六碱基重复序列进行筛选，共发现微卫星位点150个，占EST序列的4．24％；其中包括二碱基重复序列64条，三碱基重复序列80条，四碱基重复序列5条，五碱基重复序列1条；三碱基重复序列是最丰富的重复单元，占53．3％。在这些微卫星序列中，（TG／GT／AC／CA）n形式在二碱基重复中最为常见，（GAG／AGG／GGA／CCT）n形式在三碱基重复序列中最为常见，分别占微卫星序列总数的26％和14％。选取其中的62条微卫星序列进行引物设计、合成与多态性检测，经过PCR扩增，2．0％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得呈多态性微卫星引物8对，多态率为12．9％。本研究为开发大黄鱼EST微卫星分子标记和大黄鱼基因编码区微卫星的功能研究提供有价值的信息。     

鳙鱼微卫星分子标记的筛选

采用常规方法从鳙鱼(Aristichthys nobilis)血液中提取基因组DNA,经限制性内切酶Sau3AI酶切后,选取250～750bp大小的片段构建鳙鱼基因组文库。采用人工合成的重复序列(CA)15、(AG)12、(AAG)8用同位素标记作为探针,通过原位杂交筛选基因组文库,获得鳙鱼的微卫星序列。进一步用引物设计软件Primer Premier 5．0设计引物。通过杂交获得99个阳性克隆,经测序筛选出82个微卫星序列,设计引物65对。     

2013年中国典型对虾养殖区白斑综合征病毒流行株高变异区序列的分析比较

为了解中国不同地区白斑综合征病毒的流行变异情况,本研究取用2013年3—12月从7个省市发病地区采集到的64份WSSV阳性样本,以特异的引物扩增目的片段,通过测序分析不同样本的缺失及变异差异。结果显示,在开放阅读框ORF14/15的扩增中,分别有6530 bp、6533 bp和5138 bp的片段缺失,而在ORF23/24扩增中有12070bp大片段的缺失,不同地区样本中未能成功扩增ORF75,而ORF94的重复单元数目分别为0、3、4、12不等,ORF125的重复单元数目为0、7。SNP分析表明,含有3个重复单元的ORF94在48位的碱基为T、T、T,重复单元数为4的在48位的碱基为T、T、T、T,重复单元数为12的在48位的碱基分别为T及11个A。而ORF125所有重复单元数为7的情况在8、18、25、66、69位置的碱基均为G、G、G、G、A,在9、50、53、61位的碱基也普遍出现了变异。结果表明,WSSV在中国不同地区存在一定程度的变异,其在序列中的缺失、重复单元数目以及SNP的差异较为明显。     

Effects of dietary alpha‐linolenic acids on growth performance,lipid metabolism and antioxidant responses of juvenile Russian sturgeon Acipenser gueldenstaedtii

Five isonitrogenous diets were formulated with graded alpha‐linolenic acid (LNA) levels (0, 5, 10, 15 and 20 g/kg) to investigate LNA requirement of juvenile Russian sturgeon Acipenser gueldenstaedtii. Weight gain and specific growth rate of fish fed LNA5 and LNA10 were significantly higher than those in other groups, while the feed conversion ratio of these two groups was lower than others. Dietary LNA increased n‐3 polyunsaturated fatty acid and n‐3/n‐6 ratio, but decreased saturated fatty acid contents in the liver. DHA in the fish tissue also increased with the increased dietary LNA. The superoxide dismutase activity was highest in fish fed LNA5. Fish fed LNA10 showed the highest catalase activity and the highest malondialdehyde content. A 459‐bp fragment of Δ6 fatty acid desaturase and a 474‐bp fragment of elongases of very long chain fatty acids 5 were cloned and analysed. The expressions of these two genes were higher in fish fed LNA15 and LNA20. The highest hepatic lipase activity occurred in fish fed LNA 20, and the malate dehydrogenase activity peaked in the LNA5 group. Based on SGR and FCR, the range of optimum dietary LNA concentration for juvenile Russian sturgeon is recommended at 6.85–10.69 g/kg.     

青石斑鱼微卫星标记的筛选及群体多态性分析

微卫星DNA,又称短串联重复序列(STR)或简单序列重复(SSR),是广泛存在于真核生物基因组中的简单重复DNA片段,一般每个重复单位仅1～6个碱基,重复数为10～20次,其中动物体中以双核苷酸(CA/GT)n最为常见。根据微卫星DNA核心序列两端的保守序列设计引物