拟穴青蟹CYP302a1基因的克隆及表达模式分析

蜕皮激素对节肢动物生长、发育和繁殖有重要调控作用,细胞色素P450(CYP)302al是蜕皮激素合成通路中的关键酶。克隆获得了拟穴青蟹(Scylla paramamosain)CYP302a1基因,命名为Sp-CYP302a1。Sp-CYP302a1的cDNA序列长为3 032 bp,包含一个1 617 bp的开放阅读框(ORF),可编码538个氨基酸,预测相对分子质量为61.14 kDa。序列分析结果显示,该氨基酸含helix-K、helix-C、helix-I、PERF及heme-binding 5个P450特征保守区域。系统进化分析表明,Sp-CYP302A1与其他物种的CYP302Al聚为一类,与三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)和凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)的进化关系最近。qRT-PCR分析发现,雌蟹和雄蟹中CYP302a1均在Y器官具有最高表达,而在其他组织中的表达量相对较低。在幼体发育过程中,CYP302a1在蚤状幼体Ⅲ期出现一个表达峰值,但在其他几个时期的表达量均较低。在蜕皮周期内,CYP302a1表达量变化显著,在蜕皮后期(A、B期)表达量最低,随后开始上升,至蜕皮前期(D期)达到最大值,随后开始下降。综上,研究从序列分析方面鉴定了拟穴青蟹的CYP302a1,并对该基因进行了表达模式综合分析,结果表明其可能在拟穴青蟹蜕皮以及幼体发育调控中具有重要作用。     

三疣梭子蟹CYP302a1基因克隆及其表达分析

细胞色素P450(CYP)302a1是昆虫蜕皮激素合成通路中的关键酶,为了研究其在三疣梭子蟹蜕皮过程中的调控作用,实验采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆得到了三疣梭子蟹CYP302a1全长cDNA序列(GenBank登录号:KM596851).该序列全长为3 171 bp,包含一个长度为1 626 bp的开放阅读框,编码541个氨基酸;序列分析显示该氨基酸含helix-C、helix-K、helix-I、PERF及heme-binding共5个P450特征保守区域;系统进化树分析发现三疣梭子蟹CYP302a1与日本剑水蚤CYP302a1聚为一小支,再与其他物种CYP302a1聚为一支.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析了CYP302a1在不同组织和蜕皮过程中的表达水平变化.结果显示,CYP302a1的表达量在Y器中最高,而在其他组织中均极低(P＜0.05);蜕皮过程中,CYP302a1在蜕皮后期(A、B期)表达量最低,从蜕皮间期(C期)开始上升,至蜕皮前期的D1亚期达到最大值,随后下降.结果表明CYP302a1在三疣梭子蟹蜕皮调控中可能起着重要作用.     

罗氏沼虾几丁质酶3B基因的克隆及其在蜕皮周期中的表达

罗氏沼虾的生长发育及繁殖都与蜕皮紧密相关。几丁质酶是甲壳动物在蜕皮过程中最重要的酶之一。本研究对罗氏沼虾蜕皮周期外观特征和腹肢刚毛进行了观察描述,克隆并分析了罗氏沼虾的几丁质酶Ⅲ基因(MrChi3B),制备了几丁质酶Ⅲ蛋白的多克隆抗体,研究了其在蜕皮周期中的表达。罗氏沼虾几丁质酶基因cDNA的开放阅读框为1 143 bp,编码380个氨基酸,大小为41.91 ku。通过氨基酸序列比对发现,MrChi3B与日本沼虾几丁质酶基因(Chi3B)的同源性最高,为94%。MrChi3B含有一个糖苷键水解酶家族18的催化域。实时定量PCR (qRT-PCR)和蛋白印迹法(WB)检测结果显示,MrChi3B在罗氏沼虾多个组织中均有表达,但是不同组织中的表达有差异。在蜕皮期之后,其在胃、表皮和肌肉中的表达量显著上升。在胃中其表达量在蜕皮间期达到最高;在表皮和肌肉中其表达量在蜕皮后期达到最高;肠中的表达量在蜕皮前期和蜕皮期有所上升;眼柄期的表达量在所有蜕皮期都偏低。本研究结果为进一步研究几丁质酶的功能提供参考依据。     

日本沼虾表皮蛋白-5基因全长cDNA克隆及表达分析

为探究甲壳动物表皮蛋白多样性及其功能,根据表皮转录组资料,利用RACE技术扩增得到日本沼虾表皮蛋白-5基因的cDNA全长序列,分析其生物信息学、不同蜕皮时期的表达特征以及KK-42对其表达特征的影响。日本沼虾表皮蛋白-5基因的cDNA全长796bp,开放阅读框477bp,编码158个氨基酸,含RR基序,预测蛋白等电点为4.22,分子量为16.46ku;氨基酸序列比对发现日本沼虾表皮蛋白-5与克氏原螯虾Casp-2相似性最高,为76%,与其他甲壳动物表皮蛋白相似性为41%~53%。实时荧光定量PCR结果显示,日本沼虾表皮蛋白-5基因在3个时期——蜕皮间期、蜕皮前早期和蜕皮前晚期均有表达,其中在脱皮前晚期的相对表达量最高,为蜕皮间期的1400倍,与之有极显著差异(P0.01)。KK-42处理显著上调日本沼虾表皮蛋白-5基因在蜕皮前早期的表达,在处理后3、6h和48h表达量分别是对照组的6.3、4.8和11.4倍。KK-42诱导日本沼虾表皮蛋白-5基因的表达,使峰值前移,这可能是KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制之一。     

罗氏沼虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆与表达

谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是一种广泛分布在动植物体内的酶,并参与细胞多种代谢调控。在甲壳动物中,GS在能量代谢和渗透压调节过程中起着重要作用。实验克隆了罗氏沼虾GS基因。GS基因cDNA全长1 965 bp,开放读码框(ORF)为1 086 bp,编码361个氨基酸(aa),分子量大小为40.75 ku,等电点为5.81。进化树分析发现,罗氏沼虾GS基因与凡纳滨对虾、斑节对虾和中国明对虾GS聚为一支,氨基酸相似性达到95%。氨基酸多序列比对分析结果显示,罗氏沼虾GS属于无脊椎动物分支的GSⅡ群,有5个保守区域。实验对罗氏沼虾GS蛋白进行表达并制备了多克隆抗体。采用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)对罗氏沼虾蜕壳前后的不同组织GS表达进行检测。qRT-PCR结果显示,GS基因在所检测的8个组织中均有表达;蜕壳前,其相对表达量顺序为:肝胰脏肌肉胃肠鳃心脏脑血淋巴。蜕壳后和蜕壳前GS基因在组织中的差异表达比较结果显示,除了在肝胰脏表达下调外,其他7个组织都表达升高,其相对表达量的差异顺序为:脑鳃胃肠肌肉心脏血淋巴。Westernblot结果显示,蜕壳后GS蛋白在鳃和肌肉组织表达量上调,与其mRNA表达一致。此外,罗氏沼虾蜕壳后肝胰脏GS酶的活性和谷氨酰胺的含量下调,而其在鳃、肌肉和血淋巴中上调,结果与其基因表达一致。研究表明,GS基因在不同组织中表达的差异可能和罗氏沼虾的能量代谢、渗透压调节有关。     

日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。     

中华绒螯蟹细胞色素CYP2基因的克隆与表达分析

为研究细胞色素CYP2基因在中华绒螯蟹蜕皮及生长发育中的作用,本试验通过逆转录聚合酶链式RT-PCR反应以及cDNA末端快速扩增RACE技术获得了中华绒螯蟹CYP2基因cDNA全长。用实时荧光定量PCR技术,分析该基因在中华绒螯蟹蜕皮过程中各组织的相对表达量。试验结果显示,中华绒螯蟹CYP2的cDNA全长1772bp,编码491个氨基酸序列,包括一个84bp的5′端非编码区,一个212bp的3′端非编码区、一个1475bp的开放阅读框,经BLAST比对,该核苷酸序列与岸蟹、三疣梭子蟹的相似性分别为66%、64%。实时荧光定量PCR结果显示,中华绒螯蟹蜕皮前,CYP2基因在鳃中的表达量相对最高;在肝胰脏、肌肉中表达量略低于鳃;在Y器官、眼柄、胸神经节、脑神经节、肠中少量表达;在心和胃中表达量最低。中华绒螯蟹在不同的蜕皮时期中,通过荧光定量试验得出,肝胰脏中CYP2基因表达量在蜕皮前期和蜕皮期最高;眼柄中CYP2基因表达量从蜕皮期到蜕皮后期有上升趋势;鳃中CYP2基因表达量在蜕皮前期最高;Y器官、脑神经节和肠中CYP2基因表达量在蜕皮期最高;肌肉中CYP2基因表达量在蜕皮前期最高;胸神经节和胃中CYP2基因表达量在蜕皮后期最高;Y器官中CYP2基因在蜕皮前期表达量高于蜕皮后期和蜕皮期。以上试验结果表明,CYP2对中华绒螯蟹蜕皮生长中的调控可能起到重要作用。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

三疣梭子蟹EcR基因的克隆及表达分析

为研究蜕皮激素受体(EcR)在甲壳动物生长和生殖过程中的作用,采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA 末端快速扩增(RACE)技术,克隆了三疣梭子蟹蜕皮激素受体 (PtEcR)基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KC354381),运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,分析该基因在不同组织、蜕皮时期和二次卵巢发育阶段的表达特 征。结果表明,PtEcR cDNA全长2 231 bp,包含1 269 bp ORF,编码422个氨基酸;推导的PtEcR氨基酸序列与已公布的其他甲壳动物EcR进行比对,发现一致性 达67%～97%;系统进化树分析PtEcR与其它甲壳动物EcR聚为一支,而昆虫EcR聚为另一支。PtEcR在检测的三疣梭子蟹10个组织中均有表达,其中在Y-器(YO)表达量最高。在蜕皮周期中,自蜕皮后期至蜕皮前期D2亚期PtEcR在YO中的表达量一直较低;至D3亚期和D4亚期,PtEcR表达量显著升高,这与血 淋巴中20-羟基蜕皮酮(20E)浓度在D3/D4亚期显著升高相协同,表明PtEcR在三疣梭子蟹蜕皮过程中起着重要的作用。二次卵巢发育阶段,PtEcR在YO和肝胰 腺(Hp)中的表达量自Ⅱ期逐渐升高至Ⅳ期达到最高;卵巢(Ov)中,则在Ⅰ、Ⅲ期较低,Ⅱ、Ⅳ期较高,表明PtEcR可能参与卵巢发育和卵黄发生。     

日本沼虾核糖体蛋白S3a基因cDNA的克隆、表达及其在卵巢发育中的功能初探

为了探究日本沼虾(Macrobrachium nipponense)核糖体蛋白S3a(MnRPS3a)在其卵巢发育中的功能，利用cDNA末端快速扩增(RACE)-PCR技术获得了MnRPS3a基因的全长cDNA序列，并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和免疫荧光(IF)技术分别进行了该基因的表达模式和蛋白定位分析。结果显示，MnRPS3a基因cDNA全长902 bp,共编码266个氨基酸；MnRPS3a与墨吉对虾(Fenneropenaeus merguiensis)RPS3a氨基酸序列相似性最高，进化上的亲缘关系也最近；在不同组织中，MnRPS3a基因在肌肉中的表达量最高；在不同发育阶段卵巢中，MnRPS3a基因在Ⅰ期卵巢中的表达量最高；注射5-羟色胺(5-HT)能诱导日本沼虾卵巢MnRPS3a和卵黄蛋白原(Vg)基因表达升高，而注射多巴胺(DA)则抑制这2个基因表达。MnRPS3a蛋白主要定位于日本沼虾Ⅰ期和Ⅱ期卵巢的滤泡细胞、Ⅲ期和Ⅳ期卵巢卵母细胞的细胞质中。结果表明MnRPS3a可能在日本沼虾卵巢发育调控中发挥重要的作用。     

食蚊鱼CYP19a基因的克隆与序列分析

硬骨鱼类CYP19基因与生物的性别分化和激素调节相关,因此可开发用来探究环境激素污染与基因表达的关系。本研究首次克隆和分析了食蚊鱼CYP19a cDNA的全系列,为将CYP19基因作为监测环境激素生物标志物的研究提供了全面的实验数据。根据CYP19a基因c DNA保守区域设计引物,扩增保守区域并测序。采用RACE法扩增食蚊鱼CYP19a基因c DNA序列全长,对其蛋白序列进行同源性分析,并将序列应用于CYP19a mRNA转录水平的RT-PCR法检测中。成功克隆食蚊鱼CYP19a基因全长,获得CYP19a基因总长为2020 bp,ORF为238~1791 bp,共编码518个氨基酸,对其编码的蛋白质进行有关信号肽、跨膜螺旋、亲水性/疏水性、一级结构、二级结构和三级结构分析,与其他硬骨鱼类底鰆、青鰆、平鲷、鲫、鲤和斑马鱼的性腺CYP19a基因作同源性比较,其基因相似度分别为93%、84%、84%、71%、71%和66%。用MEGA6.0软件对19个物种的CYP19a基因进行聚类分析,食蚊鱼CYP19a基因与底鰆、青鰆同源性最高,说明芳香化酶在进化上相对保守。确定从食蚊鱼性腺所克隆的CYP19a基因是芳香化酶基因,证明食蚊鱼的芳香化酶是由CYP19a和CYP19b两种基因编码的。食蚊鱼卵巢芳香化酶具有3个高度保守的片段,并具有催化活性。     

罗氏沼虾胞质锰超氧化物歧化酶的功能

为了解超氧化物歧化酶 (SOD)分子生物学特性和免疫功能，实验克隆了罗氏沼虾胞质锰SOD基因 (MrcMnSOD)，制备多克隆抗体，并分析在嗜水气单胞菌感染下该基因的表达模式。结果显示，嗜水气单胞菌感染可显著诱导MrcMnSOD在转录水平和蛋白质水平进行高表达。为探究MrcMnSOD参与免疫应答的机制，进一步的抑菌实验表明，该蛋白质可显著抑制3种革兰氏阴性细菌 (大肠杆菌、副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌)和2种革兰氏阳性细菌 (无乳链球菌、金黄色葡萄球菌)的生长，且抑制作用与蛋白质浓度的关系不显著。研究表明，MrcMnSOD可能作为一种免疫相关分子参与免疫应答反应。本研究初步探讨了MrcMnSOD的免疫生物学功能，旨在为深入研究罗氏沼虾SOD的功能奠定相关基础。     

淇河鲫cyp19a1b基因的克隆表达及芳香化酶抑制剂对其表达的影响

为探索脑型芳香化酶基因(cyp19a1b)在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆淇河鲫cyp19a1b基因cDNA全长序列,采用Real-time PCR分析其在不同组织、胚胎及胚后不同发育时期的表达情况,同时检测芳香化酶抑制剂Letrozole诱导性逆转及腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后cyp19a1b在脑中的表达情况。结果显示,淇河鲫cyp19a1b cDNA全长2 984 bp(GenBank ID:MF926270),包含132 bp5′非编码区,1 319 bp 3′非编码区,1 533 bp开放读码框,编码510个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Cyp19a1b与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性较低,这与其分类地位一致;组织分布检测结果显示,cyp19a1b基因在淇河鲫脑中表达量最高,在卵巢等其他组织中表达量较低;Realtime PCR结果表明,在胚胎发育过程中cyp19a1b在外源精子刺激后从囊胚期开始上调,神经胚期达到最高,随后降低;出膜后随着发育的进行,该基因在脑中表达量逐步上调,在躯体中一直维持在较低水平;除此之外,伴随着Letrozole诱导的性逆转,cyp19a1b在脑中表达量降低;腹腔注射hCG可以促进cyp19a1b在脑中表达。研究表明,淇河鲫cyp19a1b基因可能通过参与神经系统的形成及神经内分泌活动,在性别决定与分化过程中起到一定的作用。     

实时荧光定量PCR检测凡纳滨对虾和罗氏沼虾卵黄蛋白原mRNA在卵巢和肝胰腺中的表达

卵黄磷蛋白作为卵黄蛋白的主要成分, 可为甲壳动物胚胎和早期幼体发育提供能量, 为研究其来源及合成规律, 实验应用SYBR GreenⅠ荧光定量PCR法检测了凡纳滨对虾和罗氏沼虾性腺不同发育时期卵巢和肝胰腺两种组织中卵黄蛋白原mRNA的表达水平。结果发现,凡纳滨对虾和罗氏沼虾的卵巢和肝胰腺中都有卵黄蛋白原mRNA的表达。随着卵巢的发育, 凡纳滨对虾卵巢中卵黄蛋白原mRNA的相对表达量在前5个阶段不断增加, 分别为1.1, 5.9, 10.4, 26.9, 85.0, 恢复期急剧减少, 为1.6。肝胰腺中的相对表达量也不断增加, 分别为1.3, 3.3, 7.1, 37.3, 51.6, 恢复期急剧减少, 为1.0。罗氏沼虾肝胰腺中卵黄蛋白原mRNA的相对表达量在前四个阶段不断增加, 分别为3.4, 12.6, 15.2, 38.9, 抱卵期急剧减少, 为2.9;而卵巢在整个发育过程中对卵黄蛋白原合成的贡献比较小, 分别为1.0, 1.3, 1.7, 4.8, 1.5。研究表明, 两种虾类的肝胰腺和卵巢均具合成卵黄蛋白的功能, 而且在不同的卵巢发育阶段呈现明显的规律性。     

中华绒螯蟹Scarb1基因功能及其与生长性状的关联分析

为研究B类Ⅰ型清道夫受体(SCARB1/SR-BI)在中华绒螯蟹代谢、生长以及免疫等生物学过程中的分子功能，实验对中华绒螯蟹Scarb1的克隆及时空表达进行了分析，观察了RNA干扰该基因后的相关组织结构和类胡萝卜素含量变化，筛选了该基因的SNP标记并与生长相关性状进行关联分析。结果显示，中华绒螯蟹的Scarb1由2个外显子和1个内含子组成，开放阅读框为2 415 bp，编码805个氨基酸；系统进化分析显示中华绒螯蟹与三疣梭子蟹的氨基酸同源性高达80.51%，具有较高的物种间保守性。该基因在不同蜕壳时期的肝胰腺、肠道、血淋巴细胞、心脏、鳃和肌肉组织中均有表达，但在肝胰腺、肠道和血淋巴细胞中的表达量相对较高。RNA干扰Scarb1后，组织切片观察发现肝胰腺的肝小管管腔模糊并产生了部分空泡化结构，肠道内膜的肌肉层和黏膜下层处出现显著空洞现象；肝胰腺的颜色由黄色变成灰白色，其中的类胡萝卜素含量显著下降。在该基因的第一外显子筛选到1个SNP位点(C432T)与蜕壳后体重和壳长增长率存在显著相关性。本研究结果为Scarb1在中华绒螯蟹的遗传研究和育种应用提供参考。     

花鲈ncc、nkcc基因在海、淡水适应中鳃组织的表达与定位分析

为探究ncc、nkcc基因在花鲈渗透调节中发挥的作用,实验通过全基因组鉴定、多重序列比对、系统进化树构建以及蛋白结构预测对花鲈ncc进行了鉴定及序列分析,利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测ncc和nkcc在海水、淡水花鲈鳃组织中的表达水平,利用原位杂交技术确定ncc2和nkcc1a在海水及淡水花鲈鳃中的表达位置。结果显示,从花鲈中鉴定出2个ncc基因,即ncc1和ncc2,其编码序列(CDS)长度分别为2 691和3 120bp,编码896和1 039个氨基酸,在进化上具有保守性。ncc2在淡水花鲈鳃组织中的表达量显著高于海水,而nkcc1a在海水花鲈鳃组织中的表达量显著高于淡水,ncc1、nkcc1b、nkcc2在海淡水中的表达量则无显著差异。淡水适应过程中花鲈鳃组织中的ncc2的表达量逐渐上调,而nkcc1a的表达量逐渐下调;海水适应过程则呈现相反的表达趋势。此外,原位杂交结果显示,ncc2和nkcc1a基因分别位于淡水与海水中鳃组织的相邻鳃小片间的鳃丝上皮。以上结果表明,ncc2和nkcc1a基因分别编码淡水及海水花鲈鳃中重要的Na⁺及Cl     

草鱼miR-462通过靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1调控嗜水气单胞菌感染诱导的免疫应答

为探究miR-462在嗜水气单胞菌感染草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idella kideny,CIK)后的调控机制,实验利用荧光定量技术检测了CIK细胞感染嗜水气单胞菌后miR-462表达水平的变化;运用RNAhybrid软件预测miR-462的靶基因,利用双荧光素酶报告基因系统进行确定;此外还分析了miR-462对靶基因下游基因的调控作用。结果显示,在CIK细胞感染嗜水气单胞菌的过程中,miR-462的表达发生显著变化;cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达先降低后升高,与miR-462的表达模式呈负相关。双荧光素酶报告系统显示,miR-462可靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1的3′非编码区抑制其表达,过表达miR-462可以显著抑制cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达。转染miR-462模拟物后,下游slc4a4a、tnfrsf5、cxcl9和cxcl11基因的表达受到抑制。研究表明,miR-462参与调控嗜水气单胞菌感染后草鱼CIK细胞中的免疫应答。cx32.2、slc9a3.1和tbk1被鉴定为miR-462的靶基因。miR-462可通过靶向slc9a3.1和tbk1影响下游基因的功能。     

凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物及抗生素抗性基因多样性分析

探究凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道微生物及抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)种类的差异。通过高通量测序和变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技术分析2种虾肠道微生物群落结构差异和微生物多样性,并运用PCR方法检测了2种虾肠道细菌常见38种ARGs的携带情况。结果显示,获得凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道细菌有效序列分别为42 795和40 713条,物种注释单元(operational taxonomic unit, OTU)数目分别为124和82,分类地位明确的细菌种类分别隶属5个门、17个属和5个门、16个属。凡纳滨对虾肠道细菌的优势类群为变形菌门,所占比例为75.45%,优势菌属为副球菌属(25.83%)和不动杆菌属(25.24%);罗氏沼虾肠道细菌的优势类群是厚壁菌门(49.74%),优势菌属为乳球菌属(49.01%)和弧菌属(29.98%)。凡纳滨对虾肠道细菌(2.19)Shannon指数高于罗氏沼虾肠道细菌(1.78),表明前者肠道细菌多样性大于后者。DGGE图谱的分析结果与高通量测序一致,2种虾肠道细菌种类差异很大。PCR结果显示,凡纳滨对虾肠道细菌携带15种ARGs,罗氏沼虾肠道细菌携带14种ARGs。本实验表明凡纳滨对虾肠道细菌的群落种类多样性、OTU丰富度、物种总数和ARGs种类均高于罗氏沼虾肠道细菌,为后续肠道微生物资源的挖掘提供了理论依据。     

大黄蒽醌提取物对罗氏沼虾抗鳗弧菌感染的研究

将罗氏沼虾随机分成5组,每组三个平行,每个平行约1000尾(个体均重1g左右),第1组为对照组,投喂基础日粮,另外4组为试验组,在基础日粮中分别添加0.05%、0.1%、0.2%、0.4%大黄蒽醌提取物,饲养6周后对罗氏沼虾进行鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染.测定生长以及0、12、24、48h血清和肝胰腺溶菌酶、丙二醛(MDA)、总抗氧化能(T-AOC)以及超氧化物歧化酶(SOD)等指标.生长试验表明,与对照组相比,0.1%组、0.4%组罗氏沼虾的增重率、特定生长率显著提高,饵料系数显著降低.攻毒试验Ⅰ表明,各组48h内罗氏沼虾血清溶菌酶活性、肝胰腺溶菌酶含量、血清T-AOC均呈先升高后降低趋势,其中它们的最大值分别出现于0.4%组的12h、0.2%组24h、0.1%组12h;肝胰腺SOD活力呈上升趋势,而血清MDA则一直下降.攻毒试验Ⅱ表明,大黄蒽醌提取物能有效地降低试验组罗氏沼虾的死亡率,提高免疫保护率,其中0.4%组的保护效果为最佳.因此,在饲料中添加大黄蒽醌提取物降低罗氏沼虾对病原的敏感性,增强机体抗病力,促进生长.