厚壳贻贝早期幼虫低温保存的影响研究

探讨低温(4 ℃)条件下的厚壳贻贝早期幼虫保存可能性,同时调查了不同培育密度对低温保存的影响。在正常条件下,继续培育低温保存后的幼虫,并调查其存活率和生长的变化。 结果表明,在低温保存后,早期幼虫存活率较高,超过95%;厚壳贻贝早期幼虫的壳长和壳高出现显著性的增长。不同培育组间,培育密度对厚壳贻贝早期幼虫的存活和生长影响不同,表明密度是幼虫低温保存的一个重要因素。在正常培育条件下,低温保存后的幼虫,3周后其存活率明显低于对照组,但仍超过50%,且其生长速度明显高于对照组。因此,低温培育是保存厚壳贻贝早期幼虫的有效方法,可用于今后贝类幼虫生物学实验和人工育苗技术的改善研究。     

胆碱受体化合物对厚壳贻贝幼虫变态的调控作用

为研究胆碱受体在厚壳贻贝幼虫变态发育过程中的作用,通过药理学手段调查胆碱类神经递质乙酰胆碱、氯甲酰胆碱及其拮抗剂六甲双铵和阿托品对厚壳贻贝幼虫变态发育调控作用。结果显示:在24 h暴露实验中,氯甲酰胆碱在10-5~10-4mol/L浓度表现出诱导活性,乙酰胆碱则无诱导活性。在持续暴露实验中,氯甲酰胆碱在10-5~10-4mol/L浓度表现出诱导活性,乙酰胆碱在10-6~10-4mol/L浓度表现出诱导活性。在拮抗剂实验中,在10-4mol/L氯甲酰胆碱或10-4mol/L乙酰胆碱存在时,N型胆碱受体拮抗剂六甲双铵对厚壳贻贝幼虫的变态均无抑制效果,表明N型胆碱受体可能并不在幼虫的变态发育过程发挥主导作用。M型胆碱受体拮抗剂阿托品在10-4mol/L氯甲酰胆碱存在时表现出抑制作用,且测试液中幼虫的变态率降为0%,表明M型胆碱受体可能参与调控厚壳贻贝幼虫变态发育过程。在整个药理学实验过程中无死亡幼虫出现,因而氯甲酰胆碱和乙酰胆碱可作为有效诱导物来促进厚壳贻贝幼虫的变态发育,尝试应用于该种的水产养殖过程;同时本研究为厚壳贻贝变态发育调控机制的研究提供有效理论依据。     

生态因子对厚壳贻贝眼点幼虫生长和存活的影响

为了实现厚壳贻贝人工育苗技术突破和推广,研究了海水盐度、温度、pH等生态因子对厚壳贻贝眼点幼虫的生长和存活的影响,筛选出最佳的繁育条件.结果表明:厚壳贻贝眼点幼虫对盐度的适应范围为23.5～39.1,最适为27.4～35.3;对温度的适应范围为18～27℃,最适为21～24℃;对pH值的适宜范围为7.5～9.0,最适为7.8～8.5.掌握了厚壳贻贝眼点幼虫对主要生态因子的适应范围,对厚壳贻贝人工育苗技术的突破具有重要的指导意义.     

GABA受体拮抗剂荷包牡丹碱和CGP52432对厚壳贻贝幼虫附着变态的影响

为研究GABA及其受体拮抗剂荷包牡丹碱（GABA_A受体）和CGP52432 （GABA_B受体）在厚壳贻贝幼虫附着变态中的调控作用,实验通过分析厚壳贻贝不同发育阶段幼虫转录组数据获得GABA受体相关蛋白基因（GABARAP）和GABA_B2受体基因(GABA_B2R),发现GABA_B2R在变态前期的眼点幼虫阶段相较于其他阶段幼体显著高表达。通过实时荧光定量PCR验证也得到相似的表达模式,显示GABA_B2R可能参与调控厚壳贻贝幼虫变态发育。药理学实验结果显示,10^-4 mol/L GABA对厚壳贻贝幼虫的变态具有诱导活性（27.2%±3.0%）。在拮抗剂实验中,10^-6～10^-4 mol/L荷包牡丹碱和CGP52432均显著抑制了厚壳贻贝幼虫变态,且抑制作用随浓度升高而增强。实验还发现GABA及其受体拮抗剂都抑制了厚壳贻贝幼虫的游泳行为。研究表明,GABA_A或GABA_...     

厚壳贻贝抗菌肽Mytilin的初步鉴定

厚壳贻贝是我国具有重大经济价值的水产养殖贝类,对其抗菌肽的研究有助于人们了解厚壳贻贝的免疫机制。为了解厚壳贻贝血清中抗菌肽Mytilin的分子组成和特性,采用多维高效液相色谱对厚壳贻贝血清进行分离纯化,从中获得3种对革兰氏阳性菌以及阴性菌均有抑制作用的抗菌肽分子,序列分析表明3种抗菌肽具有较高的序列相似性,均属于贻贝抗菌肽Mytilin家族,分别命名为Mytilin-1,Mytilin-2和Mytilin-3。其中,Mytilin-1为34个氨基酸残基构成的多肽,其分子量为3885.17u,含8个半胱氨酸,形成4对二硫键。根据所测Mytilin-1的氨基酸序列设计特异性引物,通过菌落PCR方法筛选厚壳贻贝cDNA文库,获得Mytilin-1的cDNA基因并进行了序列分析。以上研究结果表明,作为贻贝的主要抗菌肽家族,Mytilin在厚壳贻贝血清中具有较高丰度,对其蛋白质序列以及基因序列的研究为深入了解厚壳贻贝Mytilin抗菌肽的分子多样性奠定了基础。     

厚壳贻贝人工繁殖技术的研究

厚壳贻贝(Mytilus coruscus)是我国贻贝的主要养殖品种,其苗种主要依靠天然苗种和半人工采苗获得。2006年浙江海洋学院于嵊泗县石柱育苗厂,首次突破了厚壳贻贝规模化全人工繁殖和稚贝海区中间培育技术。研究结果表明,厚壳贻贝亲贝通过室内强化培养,经人工催产可获得成熟受精卵,受精率可达95%。在水温16℃时,受精卵在受精后25min出现第一极体,受精后39h50min发育至直线绞合幼虫期,胚胎孵化率达92%,在水温15.8～21℃的条件下,经39d室内人工培育,获平均壳长0.694mm的附着稚贝1304.7×104ind;附着稚贝经102d海区中间培育,获平均壳长13.95mm的稚贝404.46×104ind,海区保苗成活率达31%。该研究结果为今后厚壳贻贝大规模苗种生产奠定了重要理论和技术基础。     

不同温度下形成的深海菌膜对厚壳贻贝幼虫变态的影响

为探讨深海细菌生物被膜对温度的适应性及对厚壳贻贝幼虫变态的影响,分别在4、18、25、37°C条件下培养生物被膜,调查温度对细菌密度、膜厚和胞外产物等生物学特性的影响,以及被膜对幼虫变态发育的影响。结果显示,4个温度条件下产生的生物被膜均可有效促进幼虫变态发育。其中,深海菌株Virgibacillus sp. 1在18°C时生物被膜的变态诱导活性最高(35%),且α胞外多糖含量较高,诱导活性与温度和细菌密度均显著相关;同时温度与其细菌密度和膜厚均显著相关。2株深海假交替单胞菌诱导活性与细菌密度均显著相关,温度仅影响Pseudoalteromonas sp. 33细菌密度。研究表明,3株深海细菌均有很好的温度适应性,且都能形成生物被膜;温度变化导致生物被膜的生物学特性改变,最终影响其对幼虫的诱导效果。     

紫贻贝和厚壳贻贝杂交及F1代杂交优势初探

2005-2007年对紫贻贝(Mytilus gallo provincialis)和厚壳贻贝(Mytilus coruscus)种间进行了杂交生产性试验,通过亲贝强化培育、确认雌雄亲贝、改革育苗水体交换方法、投喂混合单细胞藻类、流水培养附着稚贝等技术,获得F1代.结果表明,正交F1代幼虫的成活率明显高于反交F1代和厚壳贻贝,在幼虫培育前期与紫贻贝的成活率相当,但随着幼虫的发育有高于紫贻贝的趋势.正交F1代幼虫的壳长和壳高在培育阶段的前期生长与紫贻贝相当,低于厚壳贻贝,高于反交F1代;但后期的生长明显增快,并高于反交F1代和其他两种贻贝.各试验组贻贝海区养殖的成活率在90%以上,正交F1代最高,显著高于反交F1代.各试验组生长特性,正交F1代紫贻贝厚壳贻贝反交F1代.其中正交F1代获附着稚贝3.77×109 ind.正交F1除在孵化率上低于紫贻贝、厚壳贻贝外,在壳长、壳高、成活率等方面指标具有一定杂交优势,而反交F1代的杂交优势不明显.     

厚壳贻贝SOD和POD同工酶的组织特异性研究

采用聚丙烯酰胺垂直电泳对厚壳贻贝的鳃、性腺、外套膜、足、闭壳肌等5种组织的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)进行了检测分析。SOD共检测出6条酶带,其中酶a在5种组织中都得到较强表达;酶b只在鳃中有表达,且活性高;酶c和d在鳃以外的4个组织中有表达,在足和外套膜中的表达活性低于闭壳肌和性腺;酶e在鳃、足、闭壳肌中有较强表达;酶f只在闭壳肌、性腺中有微弱表达。POD共检测到3条酶带;其中,酶a只在鳃中有表达;酶b在5种组织中都有表达;酶c只在足和性腺中有表达,该酶除在足中表达较弱外,在其它组织中都有较高的浓度。从检测结果来看,SOD和POD在厚壳贻贝体内的表达有一定的组织特异性,这种特异性不仅与各组织的不同生理分工相关,而且也与机体对自身基因表达进行调控相联系。     

厚壳贻贝与贻贝遗传渐渗的分子生物学鉴定

本文运用ISSR标记对厚壳贻贝与贻贝遗传渐渗进行研究。结果表明,厚壳贻贝与贻贝的特异性标记在杂交贻贝中有所反应,进一步证实了在浙江嵊泗部分厚壳贻贝与贻贝发生了杂交和基因渐渗现象。所采集的杂交群体样本中,65%与厚壳贻贝的遗传距离近,可能是杂交后与厚壳贻贝回交的后代。目前由于过度采捕、环境改变以及引进外来种等影响,应该对厚壳贻贝的种质资源进行保护。     

厚壳贻贝Wnt4基因时空表达

为探究Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段和组织生长过程中的作用,通过RACE技术克隆了厚壳贻贝Wnt4基因c DNA全长序列,该序列全长3342 bp,开放阅读框为1074 bp,编码357个氨基酸。该序列与人、小鼠、海胆、栉孔扇贝和长牡蛎等物种的同源性分别为61%、61%、60%、71%和76%。通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析Wnt4基因在厚壳贻贝成体多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、雌雄性腺、足和消化腺)均有表达,其中在外套膜中表达量最高,推测可能与贝壳形成有关;Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段高表达主要集中在壳顶期,并推测Wnt4基因可能参与了贝壳形态结构发生转变的过程以及某些器官的形成与发育。本研究为进一步开展双壳贝类Wnt基因家族的功能研究提供了理论依据。     

不同来源海洋弧菌微生物被膜对厚壳贻贝稚贝附着的影响

为探讨广泛存在于近海环境中海洋弧菌和贝类附着的相互作用关系,实验从自然微生物被膜和厚壳贻贝成体肠道内分离了海洋弧菌,测定其种属及亲缘性,调查了这些不同来源弧菌形成的微生物被膜与厚壳贻贝稚贝附着的调控作用。结果显示,测试弧菌形成的微生物被膜密度随着初始细菌密度的增加呈现不同程度的增加。源于自然微生物被膜和贻贝肠道内的10株弧菌均能显著促进厚壳贻贝稚贝的附着,不同菌株形成微生物被膜的诱导活性存在显著差异,附着率变化范围为17%~67%,其中稚贝在Vibrio sp.17微生物被膜上的附着率为67%±2%。微生物被膜对稚贝附着诱导活性与被膜密度呈显著相关性,其中弧菌V.crassostreae ECSMB14106的相关性系数最高,为0.8992。此外,微生物被膜的诱导活性与弧菌的来源无关。本实验初步探明了海洋弧菌对厚壳贻贝稚贝附着的影响,有助于进一步理解微生物被膜调控厚壳贻贝的附着分子机理。     

弧菌生物被膜的动态演替对厚壳贻贝附着的影响

为探讨生物被膜动态演替过程中如何影响海洋无脊椎动物附着,实验选取了对厚壳贻贝附着具有不同诱导活性的弧菌Vibrio cyclitrophicus、V. chagasii和Vibrio sp. 22形成单一生物被膜,观察弧菌动态演替中生物被膜细菌密度、膜厚度和胞外产物等生物学特性变化,探究其对厚壳贻贝稚贝附着的影响。结果显示,弧菌生物被膜动态演替过程中,被膜细菌随着时间推移出现聚集现象,细菌密度和膜厚度也随着时间变化呈先增多后减少。除了Vibrio sp. 22,V. cyclitrophicus和V. chagasii生物被膜细菌密度和膜厚度与稚贝附着均有不同程度的相关性。所测弧菌生物被膜胞外产物的显微激光共聚焦结果分析发现,胞外多糖随着时间先增多,然后开始下降。相对比而言,胞外蛋白和胞外脂质无显著性变化。因而,胞外多糖变化规律与稚贝在被膜上附着变化相一致,表明胞外多糖是生物被膜动态演替过程中调控厚壳贻贝附着的重要因素。本实验初步探讨了生物被膜动态演替特征及其对厚壳贻贝稚贝附着的影响,对于后续进一步在海区开展生物被膜的动态演替与海洋底栖动物附着相互关系研究具有重要的学术价值,同时对于人...     

厚壳贻贝5-羟色胺2A受体(5-HT2AR)基因克隆和时空表达

为探究5-羟色胺2A受体（5-HT 2A receptor, 5-HT2AR）基因在海水贝类生长发育中的作用,本研究通过RACE技术和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）克隆了厚壳贻贝5-HT2AR 基因的cDNA全长,并分析该基因的时空表达。结果显示,5-HT2AR基因全长2 636 bp,开放阅读框（ORF）2 124 bp,共编码707个氨基酸。序列分析结果显示该序列与人、小鼠、斑马鱼、长牡蛎和虾夷扇贝等物种分别具有45%、45%、48%、49%和67%的同源性。厚壳贻贝雌雄成体各组织和器官中均有5-HT2AR基因表达,雄性中的鳃表达量最高,而在雌性鳃、外套膜和性腺中的表达稍高于其他组织和器官;推测该基因可能与厚壳贻贝的摄食、对外界环境的感知及促进卵母细胞成熟有关。5-HT2AR基因在厚壳贻贝各发育阶段均有表达,且稚贝的表达量为眼点幼虫的1.4倍,推测5-HT2AR基因可能参与了调控厚壳贻贝幼虫的生长发育过程。本研究为进一步了解5-HT基因家族在双壳贝类中的功能奠定了基础。     

厚壳贻贝M7 lysin分子的克隆与表达

M7 lysin位于贻贝精子顶体中,是溶解卵黄膜、促进受精作用的重要蛋白质,决定了贻贝种间精卵识别的特异性。采用同源克隆法得到厚壳贻贝M7 lysin分子,并在原核生物中对该分子进行重组表达。结果表明,扩增产物为540 bp左右的片段,进一步测序发现其开放阅读框cDNA为543 bp,与贻贝、地中海贻贝、盖勒贻贝具有较高的相似性;在线翻译所得蛋白质片段中含有180个氨基酸,分子量为20 ku,等电点为8.48;通过M7 lysin氨基酸序列构建系统进化树发现,贻贝和地中海贻贝亲缘关系最近,其次为盖勒贻贝,最后是厚壳贻贝;将 M7 lysin分子在E.coli Rosseta(DE3)中融合表达,得到包括载体氨基酸序列在内的25 ku蛋白质,符合预期分子质量。     

灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响

为探究灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响,用1×10~6、1×10~7、1×10~8个/mL 3个浓度的灿烂弧菌刺激厚壳贻贝,探讨弧菌刺激后厚壳贻贝的一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)等免疫指标和淀粉酶、蛋白酶等消化酶的变化情况。结果显示,灿烂弧菌刺激48 h后,厚壳贻贝足、鳃、消化腺等组织中仅消化腺的NOS活性较对照组有显著升高,且酶活性随初始细菌浓度的升高而升高,故选用消化腺来测定灿烂弧菌刺激后72 h内的免疫指标和消化酶活性的变化。灿烂弧菌刺激后,48 h内NOS活性较对照组均显著升高。NO含量较对照组均显著升高,与NOS显现相同变化趋势。SOD活性在各浓度灿烂弧菌刺激下较对照组均显著升高,而MAD含量在实验组中含量显著低于对照组。淀粉酶活性在实验组中显著低于对照组,总体呈现先下降后升高的趋势。蛋白酶活性在各实验组中均呈现先升高后下降的趋势。研究表明,灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和蛋白酶活性的升高有诱导作用,但对蛋白酶的活性有抑制作用。本研究初步探明了厚壳贻贝对灿烂弧菌的免疫应答机制,为进一步研究灿烂弧菌和厚壳贻贝相互作用机制以及厚壳贻贝免疫机制奠定了基础。     

培养基对微生物被膜形成和厚壳贻贝附着的影响

为探讨微生物被膜生物学特性、培养基以及大型生物附着三者之间的相互关系,本实验通过微生物分子生态学和海洋贝类生态学等方法调查了不同培养基对海洋细菌所形成微生物被膜的影响及其对厚壳贻贝幼虫附着的影响。结果显示,厚壳贻贝稚贝率与培养基类型和细菌初始密度显著相关,进一步分析表明,Zo Bell 2216E和Seawater Luriabertani(SWLB)条件下分别有6株和9株细菌形成的微生物被膜密度与稚贝率显著相关。扫描电镜结果显示,Staphylococcus sp.3在Zo Bell 2216E培养基条件下形成微生物被膜的细菌分布较为紧密,Pseudoalteromonas sp.8则在SWLB培养基条件下微生物被膜细菌分布较为紧密,且形态变为短杆状。SDS-PAGE结果显示,相比Zo Bell 2216E培养基,Staphylococcus sp.3在SWLB培养基条件下9条条带蛋白显著下降,其中2个条带完全消失;Pseudoalteromonas sp.8则在SWLB培养基条件下明显增加5条蛋白条带。研究表明,微生物被膜的形成受到培养基的影响,培养基的不同导致微生物被膜的形态结构、分布和蛋白有所差异,最终导致微生物被膜诱导厚壳贻贝幼虫附着变态的活性差异,本研究为后续开展厚壳贻贝附着的分子机制奠定良好基础。