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1.
为了研究龟鳖类生殖细胞发育分化机制,实验通过RACE技术克隆获得了中华鳖dead end (dnd)基因全长c DNA,RT-PCR分析了其在不同组织的转录表达情况,并通过原位杂交技术检测了dnd mRNA在中华鳖雌雄性腺配子发生过程中的表达变化。结果显示,中华鳖dnd cDNA全长1 251 bp (GenBank登录号为OL757532),包括234 bp的3’端非翻译区和1 017 bp开放读码框,开放读码框编码338个氨基酸。氨基酸序列比对和系统进化树分析结果表明,中华鳖Dnd蛋白与其他物种同源蛋白一样,均具有6个保守的结构域,其中高度保守的RNA识别结构域是主要的功能结构域。中华鳖Dnd与绿海龟Dnd氨基酸序列一致性最高,亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,Psdnd特异性地在中华鳖性腺组织中表达,且在卵巢中的表达明显高于精巢。原位杂交分析结果显示,Psdnd mRNA在生殖细胞中特异表达。在卵巢中,Psdnd mRNA主要在Ⅱ期初级卵母细胞的细胞质中表达,随着卵母细胞的增大,在Ⅳ期及以后的卵母细胞中检测不到其表达。在精巢中,Psdnd mRNA信号在初级精母细胞中表达最强,...  相似文献   

2.
为了研究17β-hsd4基因在无脊椎动物生殖过程中的作用,实验从栉孔扇贝转录组数据库中获得一个表达序列标签,采用cDNA末端快速扩增技术克隆得到1条全长为2 417 bp的cDNA序列,其开放阅读框为2 223 bp,编码740个氨基酸,推测的氨基酸序列含有17β-HSDs特有的4个保守区和17β3-HSD4的3个酶结构域,且与人等脊椎动物的序列相似性均在58%以上.半定量RT-PCR显示,该基因在栉孔扇贝精巢、卵巢、肌肉、外套膜、鳃、肝胰腺和肾脏等各组织中均有表达,其中在肝胰腺和肾脏中表达量明显高于其他组织.对不同发育时期性腺中该基因表达的qRT-PCR检测发现,其在精卵巢发育周期的表达模式不同,且在生长期和成熟期的精巢中表达量显著性高于同时期的卵巢.由此推测,栉孔扇贝多种组织中均可以合成17β-HSD4,在精巢的发育和成熟的作用明显高于卵巢.  相似文献   

3.
SOX9是SOX家族的SOXE亚族成员,在脊椎动物骨骼发育、胰腺发育、性别决定与分化以及肿瘤形成中发挥重要的作用。sox9在不同种类脊椎动物性腺中的表达存在差异,在无脊椎动物性腺中的表达特征尚不清楚。本研究利用RACE技术克隆了栉孔扇贝(Chlamys farreri)sox9(Cf-sox9)全长的c DNA序列,其长度为2835 bp,开放阅读框为1413 bp,编码470个氨基酸。预测的氨基酸序列具有SOX家族的HMG-box和SOXE亚族的高保守区域,但没有脊椎动物羧基端的Pro-Gln-Ser rich区域。原位杂交和免疫组织化学技术确定Cf-sox9 m RNA和Cf-SOX9蛋白均定位在栉孔扇贝精巢和卵巢的所有生殖细胞中,并且在不同发育时期性腺中呈现了类似的表达规律,即在精巢中,阳性信号在精母细胞中最强,在精子中最弱;在卵巢中,阳性信号在卵原细胞、卵母细胞以及成熟卵中呈现逐渐减弱的趋势。这一表达特征与脊椎动物性腺中多样的性别差异表达特征不同,提示sox9在贝类性腺发育和配子发生中的作用可能与大多数脊椎动物不同。  相似文献   

4.
栉孔扇贝wnt4基因cDNA克隆及表达分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
由栉孔扇贝(Chlamys farreri)转录组数据库获得wnt4基因的一段表达序列标签(EST)序列,利用SMART-RACE技术克隆了wnt4基因cDNA全长序列,该序列长1 239 bp,其中开放阅读框为1 068 bp,可以编码355个氨基酸,推导的氨基酸序列含有WNT家族特有序列,且与沙蚕(Platynereis dumerilii)、海胆(Heliocidariserythrogramma)、人(Homo sapiens)等物种WNT4同源性都在60%以上。半定量RT-PCR结果显示,除肾脏外,wnt4基因在栉孔扇贝的精巢、卵巢、闭壳肌、肝胰腺、鳃、外套膜组织中均有表达,但表达量较低。定量RT-PCR结果表明:wnt4基因在成熟期的精卵巢中表达量最高,增殖期和休止期表达量次之,生长期表达量最低;整个生殖周期中精巢表达量高于卵巢。该基因在栉孔扇贝多个组织中的表达特性,暗示其参与了多样的生物学过程;在性腺中的表达特征表明其可能参与两性性腺的发育并在生殖细胞成熟过程中发挥作用。  相似文献   

5.
栉孔扇贝的生殖周期   总被引:17,自引:0,他引:17  
本文介绍了栉孔扇贝生殖细胞的发生、生殖腺成熟度和生殖周期的研究结果。作者把栉孔扇贝的卵细胞发生分为卵原细胞期、无卵黄期、卵黄形成前期、卵黄形成后期和成熟期五个阶段;把精子的发生过程分为精原细胞期、初级精母细胞期、次级精母细胞期、精细胞期和精子期五个阶段。对于栉孔扇贝生殖腺的发育过程,作者根据生殖细胞在滤泡中所占的比例,把它分成增殖期、生长期、成熟期、生殖期和休止期五个阶段。栉孔扇贝的性腺发育在青岛海区为一年一个周期,但其繁殖高峰则有二次,这表明栉孔扇贝的成熟期和生殖期二者是相互重叠的。此外,作者也观察到了栉孔扇贝的雌雄同体现象。  相似文献   

6.
为研究栉孔扇贝贝壳形成机理,首先应用质谱分析的方法,研究了几丁质酶在栉孔扇贝贝壳的蛋白质组中所占的比例。进一步利用RACE技术克隆获得栉孔扇贝几丁质酶的c DNA,全长共1587 bp,可编码439个氨基酸残基。氨基酸序列的功能结构域分析表明,该几丁质酶具有保守的几丁质酶特征结构域。组织表达分析表明,栉孔扇贝几丁质酶在外套膜组织中表达量最高,并且在外套膜边缘的表达量高于外套膜中心,推测其参与了贝壳的形成。应用实时定量PCR方法,检测贝壳损伤修复过程中基因表达水平,结果显示,几丁质酶基因表达水平呈现下调趋势,暗示其作为负调控因子参与贝壳修复过程。利用RNAi技术降低外套膜组织中几丁质酶基因的表达水平,同时应用扫描电子显微镜观察贝壳内表面的结构,发现贝壳矿物晶体片层的轮廓呈现不规则沉积。综合以上实验结果,推测几丁质酶通过水解几丁质来保证有机框架的有序性,从而对贝壳形状和外观起到调控作用。研究几丁质酶的基因组织表达规律及其生物学功能,将有助于揭示贝壳生物矿化的机制。  相似文献   

7.
肌细胞增强因子(Myocyte enhancer factor-2,MEF2)是一种肌肉特异性转录因子,对脊椎动物肌纤维的形成和发育具有重要的调控作用。为了研究MEF2对华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)闭壳肌肌纤维形成和发育的调控作用,实验克隆了华贵栉孔扇贝MEF2C和MEF2C-like c DNA序列,解析了其在不同组织和发育时期的表达调控规律,分析了盐度对其表达调控的影响。结果表明,MEF2C和MEF2C-like基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长为1 302 bp和1 158 bp,分别编码433和358个氨基酸。氨基酸序列比对分析显示MADS和MEF2结构域高度同源,系统进化分析显示华贵栉孔扇贝和长牡蛎具有较近的亲缘关系。在不同组织和发育时期,华贵栉孔扇贝MEF2C和MEF2C-lik mRNA具有相似的表达规律,均在D型幼虫期及闭壳肌中显著高表达。在不同日龄的华贵栉孔扇贝闭壳肌中,MEF2Cs mRNA在60和120日龄表达水平显著升高。MEF2Cs mRNA在盐度为28时表达量最高,说明可能在此盐度下更适合华贵栉孔扇贝生长。  相似文献   

8.
软体动物碳酸钙贝壳的形成过程涉及到C a2+的吸收、转运、贮藏、分泌和沉积等,与钙代谢这一高度受控的复杂生理过程紧密相关。本研究以栉孔扇贝转录组测序结果为基础,通过RACE技术,从栉孔扇贝外套膜中克隆得到钙调素类似蛋白的cDNA序列,全长863 bp ,编码149个氨基酸,相应蛋白质的预测分子量约为17.0 ku ,理论等电点为4.03。钙调素类似蛋白具有4个可能的EF‐hand Ca2+结合结构域,属于 EF‐hand钙结合蛋白家族,其氨基酸序列与栉孔扇贝钙调素钙调素的相似度为66%。半定量RT‐PCR检测显示,钙调素类似蛋白基因在外套膜中特异性高表达,预示其可能参与贝壳的矿化过程。实时定量PCR检测显示,钙调素类似蛋白基因的表达水平随环境中Ca2+浓度的升高呈先升后降趋势,表明钙调素类似蛋白与外套膜中的钙代谢过程密切相关;在贝壳缺刻损伤后的再生过程中,钙调素类似蛋白基因表达量显著上升,暗示其积极参与到了贝壳的再生过程中。上述结果为进一步阐明钙调素类似蛋白基因的功能及其在栉孔扇贝生物矿化过程中的作用提供可能的理论依据。  相似文献   

9.
栉孔扇贝Cf-dmrt4-like基因的克隆、序列特征及表达分析   总被引:1,自引:1,他引:0  
DMRT家族是一类转录因子,在性别决定与分化、器官形成等早期胚胎发育中起重要的作用。本研究采用简并PCR扩增和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从栉孔扇贝(Chlamys farreri)精巢中克隆得到1个全长为2312bp的dmrtcDNA序列,其开放阅读框(Open reading frame,ORF)1110bp,编码369个氨基酸,具有dmrt基因家族共有的DM保守结构域。同源比对和系统进化分析结果显示,其为Cf-dmrt4-like基因。半定量RT-PCR结果显示,该基因从受精卵至匍匐幼虫各发育时期均有表达,卵裂期表达量较高;在雄性成体的鳃和精巢以及雌性成体的外套膜、鳃、肾和闭壳肌中表达,但卵巢中未见表达。qRT-PCR检测不同发育时期的精卵巢,以成熟期精巢表达量最高。由此推测,栉孔扇贝Cf-dmrt4-like基因参与个体的早期发育,并在两性成体中发挥着不同的作用。  相似文献   

10.
为了从分子水平上研究鱼类生殖细胞发育的机制,首次从重要的经济养殖鱼类——黑脊倒刺鲃中克隆了斑马鱼vasa的同源基因ScVHG。该cDNA长1962bp,编码654个氨基酸,氨基酸序列中含有DEAD蛋白家族特有的9个保守结构域。经比对发现,其编码的蛋白序列与斑马鱼VASA蛋白等具有高度的同源性,与斑马鱼、罗非鱼、虹鳟、银鲫、黄鳝、金鱼、金枪鱼、草鱼的VASA蛋白相似度分别为77%,77%,79%,90%,74%,89%,79%和86%。RT-PCR结果显示:在成鱼不同的组织中,ScVHG仅在精巢和卵巢中表达。RNA原位杂交结果进一步表明:在精子发生中,ScVHG只在精原细胞中表达,而在后期的精母细胞、精子细胞中均未发现明显的表达;在卵子发生中,ScVHG在卵原细胞和卵母细胞的各个时相中均有表达,在卵原细胞中表达最为强烈,而在随后各时相的卵母细胞中,阳性信号逐渐减弱。研究认为,该基因中含有的保守序列、序列的相似性以及该基因在生殖细胞中的特异性表达等结果均表明,克隆得到的ScVHG是斑马鱼vasa的同源基因,此基因可作为一种有效的分子标记,用于黑脊倒刺鲃以及其他鱼类生殖细胞发育机制的研究。  相似文献   

11.
为探索龟鳖类生殖细胞的发育分化机制,实验通过特异性引物克隆了中华鳖dazl基因的cDNA片段,长1 007 bp,其中包括5′端非编码区197 bp,3′端非编码区33 bp,开放阅读框777 bp,编码258个氨基酸。氨基酸序列比对显示其与西部锦龟Dazl同源性最高,达96%;与小鼠Dazl同源性达75%。荧光定量PCR分析结果显示,中华鳖dazl mRNA主要在精巢和卵巢中表达,在体细胞组织中仅检测到微量表达。冰冻切片原位杂交结果显示,中华鳖dazl mRNA在生殖细胞中特异表达,且在不同时期的生殖细胞中呈动态表达模式。在精巢中,中华鳖dazl mRNA在初级和次级精母细胞中表达最强,在精原干细胞中表达水平次之,在精子细胞中未检测到信号;在卵巢中,中华鳖dazl mRNA信号在初级卵母细胞胞质中均匀分布且在最早期的初级卵母细胞中信号最强,随着卵母细胞的增大,信号逐渐聚集并逐渐减弱。研究表明,dazl基因可能对中华鳖两性生殖细胞的发生具有重要的调控作用。  相似文献   

12.
DMRT1是DMRT家族重要成员之一,主要参与动物性别决定和分化调控,但在不同动物中其表达和功能调控作用存在差异。本研究采用生物信息学方法分析了栉孔扇贝(Chlamys farreriDmrt1的序列特征,采用半定量RT-PCR技术确定了其mRNA在成体性腺、闭壳肌、外套膜、鳃和肾等组织中的分布,定量RT-PCR和原位杂交技术揭示了Dmrt1 mRNA在性腺中的时空表达特征。结果显示:栉孔扇贝Dmrt1序列中含有DMRT家族保守的DM结构域;其mRNA仅在栉孔扇贝性腺中表达,在精巢中的表达明显高于卵巢,并且以生长期精巢的表达水平最高;原位杂交检测Dmrt1阳性信号主要定位于生殖细胞的细胞质中。研究结果表明,Dmrt1在栉孔扇贝性腺中的表达特征与大部分动物性腺中的表达特征基本一致,推测其可能参与性别分化和精巢发育的功能调节。  相似文献   

13.
厚壳贻贝Wnt4基因时空表达   总被引:2,自引:1,他引:1  
徐跃峰  李一峰  梁箫  陈芋如  杨金龙 《水产学报》2016,40(10):1567-1575
为探究Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段和组织生长过程中的作用,通过RACE技术克隆了厚壳贻贝Wnt4基因c DNA全长序列,该序列全长3342 bp,开放阅读框为1074 bp,编码357个氨基酸。该序列与人、小鼠、海胆、栉孔扇贝和长牡蛎等物种的同源性分别为61%、61%、60%、71%和76%。通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析Wnt4基因在厚壳贻贝成体多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、雌雄性腺、足和消化腺)均有表达,其中在外套膜中表达量最高,推测可能与贝壳形成有关;Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段高表达主要集中在壳顶期,并推测Wnt4基因可能参与了贝壳形态结构发生转变的过程以及某些器官的形成与发育。本研究为进一步开展双壳贝类Wnt基因家族的功能研究提供了理论依据。  相似文献   

14.
Vasa基因编码DEAD-box家族成员中一种ATP依赖的RNA解旋酶,是决定生殖系发育的重要调控因子之一。采用同源克隆策略及SMART-RACE技术,克隆了海洋经济螠虫动物单环刺螠Vasa基因的全长cDNA,该序列长4 080 bp,开放阅读框2 322 bp,编码733个氨基酸,具有DEAD-box蛋白家族共有的全部9个保守域。整体原位杂交和半定量RT-PCR结果显示,Vasa基因在未受精卵、受精卵、2~8细胞的早期胚胎中均有明显的表达,显示其母源性提供的特点;从囊胚开始,表达量明显降低,在原肠胚表达信号主要集中在内中胚层细胞中;至担轮幼虫,表达信号进一步集中在消化道处;当发育至体节幼虫时,阳性细胞分布于消化道和体节的隔膜处,进入蠕虫状幼虫,信号仅在头部的腹刚毛附近以及后肠周围的细胞中表达。实验结果为探知刺螠动物生殖系的起源和分化以及低等型生殖腺的发生提供重要的数据。  相似文献   

15.
李永婧  吴利敏  王磊  马晓  李学军 《水产学报》2018,42(8):1169-1180
为探索脑型芳香化酶基因(cyp19a1b)在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆淇河鲫cyp19a1b基因cDNA全长序列,采用Real-time PCR分析其在不同组织、胚胎及胚后不同发育时期的表达情况,同时检测芳香化酶抑制剂Letrozole诱导性逆转及腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后cyp19a1b在脑中的表达情况。结果显示,淇河鲫cyp19a1b cDNA全长2 984 bp(GenBank ID:MF926270),包含132 bp5′非编码区,1 319 bp 3′非编码区,1 533 bp开放读码框,编码510个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Cyp19a1b与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性较低,这与其分类地位一致;组织分布检测结果显示,cyp19a1b基因在淇河鲫脑中表达量最高,在卵巢等其他组织中表达量较低;Realtime PCR结果表明,在胚胎发育过程中cyp19a1b在外源精子刺激后从囊胚期开始上调,神经胚期达到最高,随后降低;出膜后随着发育的进行,该基因在脑中表达量逐步上调,在躯体中一直维持在较低水平;除此之外,伴随着Letrozole诱导的性逆转,cyp19a1b在脑中表达量降低;腹腔注射hCG可以促进cyp19a1b在脑中表达。研究表明,淇河鲫cyp19a1b基因可能通过参与神经系统的形成及神经内分泌活动,在性别决定与分化过程中起到一定的作用。  相似文献   

16.
根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dUTPase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建表达质粒pET32a-dut。然后,将其转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导表达蛋白分子量约为46 ku,与预期表达蛋白大小一致。经Western-blotting及质谱分析鉴定,所表达蛋白即为重组dUTPase。表达产物经Co2+柱纯化后进行酶学活性测定。结果显示,重组dUTPase能特异性催化dUTP,EDTA可以抑制dUTPase的活性,而Mg2+可以增强其活性。  相似文献   

17.
通过简并引物和RACE技术分离得到了半滑舌鳎Vasa基因的cDNA序列,其全长为2 602 bp,编码包含722个氨基酸残基的蛋白质。半滑舌鳎Vasa在N末端含有5个RGG重复和10个RG重复,具备DEAD-box家族特有的8个保守基序,与东方蓝旗鲔的同源性最高(91%)。利用RT-PCR技术研究了csVasa在性成熟半滑舌鳎中的表达模式。组织分布研究发现,Vasa在半滑舌鳎的卵巢和精巢中表达丰富,心脏中有微量表达;繁殖周期中,卵巢中Vasa的表达量在初级卵黄期和囊泡期要明显高于核周期和退化吸收期;精巢中,Vasa在精子细胞增殖期的表达量要显著高于精子成熟期和精母细胞增殖期。结果表明,Vasa可能在半滑舌鳎的配子发生中起重要作用。  相似文献   

18.
为探究Tyrosinase(Tyr)基因在黄河鲤体色形成中的作用,利用生物显微镜对黄河鲤黑色鳞片、银色鳞片、鳍条色素细胞的组成进行观察,并利用RACE克隆黄河鲤Tyr基因全长cDNA序列,荧光定量PCR分析其在不同组织中的表达情况,Western blot印迹和免疫组织化学方法检测其蛋白的表达定位。结果显示,黄河鲤具有黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞3种色素细胞,3种色素细胞的数量、种类和分布在不同组织中存在较大差异。黄河鲤Tyr基因cDNA全长1717 bp(GenBank ID:No.KY305667),其中ORF长1605 bp,编码535个氨基酸,5′-UTR区41 bp,3′-UTR区71 bp。蛋白同源分析发现,黄河鲤Tyr与鲤科鱼类相似性最高,与哺乳类及鸟类等脊椎动物相似性最低。系统进化分析显示,黄河鲤Tyr与鲤、瓯江彩鲤、锦鲤和斑马鱼等鲤科鱼类的亲缘关系最近。实时定量PCR分析表明,Tyr基因在黄河鲤不同组织中均有表达,肌肉中的表达量最高,其次是黑色皮肤,另外在黄色皮肤、臀鳍和尾鳍等黑色素细胞存在的组织中也有较高表达。Western blot印迹结果显示,Tyr基因在黑色皮肤中表达最高,其次是臀鳍和尾鳍,银色皮肤中没有表达。免疫组织化学结果显示,Tyr基因在黑色皮肤的黑色素细胞和黏液细胞中有表达。研究表明,Tyr基因表达水平与黑色素细胞数量和分布具有一定相关性,参与黄河鲤体色的形成。  相似文献   

19.
为探究Smoothened (Smo)信号在精巢不同细胞增殖与存活中的作用,实验分离鉴定了尼罗罗非鱼smo (命名为Onsmo),检测了其在不同组织中的表达分布及在精巢中的细胞表达模式,在尼罗罗非鱼精巢组织的体外培养体系中,用Smo特异性激动剂SAG或抑制剂环巴胺分别进行处理,EdU掺入法及TUNEL法检测了处理后生殖细胞(Vasa+)、Sertoli细胞(Amh+)与Leydig细胞(Cyp17a1+)增殖或凋亡情况。结果显示,Onsmo开放阅读框全长2 478 bp,编码825个氨基酸,含有7次跨膜结构域,与人SMO氨基酸一致性达77%;Onsmo表达于包括精巢在内的多个组织;在精巢中,Onsmo在多种不同类型细胞表达,包括精原细胞、精母细胞、Sertoli细胞以及Leydig细胞;在精巢组织的体外培养体系中,SAG处理对精原细胞增殖具有显著促进作用,而环巴胺处理对Sertoli细胞、Leydig细胞凋亡具有显著促进作用。研究表明,On Smo信号在尼罗罗非鱼精巢精原细胞增殖与体细胞存活中具有重要作用。该研究首次证实...  相似文献   

20.
甘为  方展强 《水产学报》2016,40(10):1542-1555
硬骨鱼类CYP19基因与生物的性别分化和激素调节相关,因此可开发用来探究环境激素污染与基因表达的关系。本研究首次克隆和分析了食蚊鱼CYP19a cDNA的全系列,为将CYP19基因作为监测环境激素生物标志物的研究提供了全面的实验数据。根据CYP19a基因c DNA保守区域设计引物,扩增保守区域并测序。采用RACE法扩增食蚊鱼CYP19a基因c DNA序列全长,对其蛋白序列进行同源性分析,并将序列应用于CYP19a mRNA转录水平的RT-PCR法检测中。成功克隆食蚊鱼CYP19a基因全长,获得CYP19a基因总长为2020 bp,ORF为238~1791 bp,共编码518个氨基酸,对其编码的蛋白质进行有关信号肽、跨膜螺旋、亲水性/疏水性、一级结构、二级结构和三级结构分析,与其他硬骨鱼类底鰆、青鰆、平鲷、鲫、鲤和斑马鱼的性腺CYP19a基因作同源性比较,其基因相似度分别为93%、84%、84%、71%、71%和66%。用MEGA6.0软件对19个物种的CYP19a基因进行聚类分析,食蚊鱼CYP19a基因与底鰆、青鰆同源性最高,说明芳香化酶在进化上相对保守。确定从食蚊鱼性腺所克隆的CYP19a基因是芳香化酶基因,证明食蚊鱼的芳香化酶是由CYP19a和CYP19b两种基因编码的。食蚊鱼卵巢芳香化酶具有3个高度保守的片段,并具有催化活性。  相似文献   

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