大黄鱼结节病病原菌—诺卡氏菌的鉴定及其系统发育分析

一株分离自浙江台州、舟山海水网箱养殖患结节病大黄鱼（Larimichthys crocea）的病原菌,经生理生化试验及形态结构观察显示,该菌株革兰氏阳性,好氧,具有弱抗酸性,菌体呈长或短杆状,或细长分枝状,过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性,还原硝酸盐,不水解酪素、黄嘌呤、酪氨酸、淀粉和明胶,能以柠檬酸盐为唯一碳源生长.对其16S rRNA基因进行PCR扩增、测序和系统发育分析,结果表明,该菌株与诺卡氏菌属的菌株亲缘关系最近,与（鱼师）鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea JCM 3360^T）的16S rRNA基因序列相似性达99.9%.据此鉴定结果认为,该菌株为（鱼师）鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea）.[中国水产科学,2006,13（3）：410-414]     

乌鳢诺卡氏病及其防治

一、病原与病因1.病原对乌鳢养殖影响最大、危害最严重的是乌鳢的诺卡氏病,据报道,引起乌鳢诺卡氏菌病的病原为%鱼诺卡氏菌(Nacardia seriolea)。     

蓝鳃太阳鱼诺卡氏菌的分离鉴定及药敏分析

为探明患结节病蓝鳃太阳鱼的病因,从蓝鳃太阳鱼(Lepomis macrochirus)脾脏结节处分离获得一病原菌SD1810。通过菌落形态、细菌生理生化鉴定和16S rRNA基因序列分析,确定所得菌株为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)。人工回归感染试验结果显示,注射浓度为2.8×107 CFU/mL的菌液能使蓝鳃太阳鱼患病致死,发病症状与原感染鱼相似。从死亡太阳鱼体内可重新分离到与SD1810形态特征、生理生化指标相一致的病菌。对分离获得的鰤鱼诺卡氏菌进行药敏试验分析,结果表明,鰤鱼诺卡氏菌SD1810对红霉素、利福平、庆大霉素、氯霉素、阿米卡星、氟苯尼考等10种抗生素极其敏感,对头孢唑啉,诺氟沙星,青霉素、氨苄青霉素和阿莫西林等6种抗生素具有耐药性。     

乌鳢诺卡氏菌病致病菌的分离、鉴定及组织病理学观察

为研究乌鳢诺卡氏菌的致病机理,本实验通过病原分离鉴定、组织病理学和基因表达水平分析对病原菌的致病性、药物敏感性及乌鳢的免疫抗性进行了研究。结果显示,患病乌鳢主要感染了命名为SDAT 0011病原菌,通过菌落形态观察、革兰氏染色鉴定、生理生化鉴定、16S rRNA鉴定及诺卡氏菌特异序列扩增鉴定,结果均显示该病原菌为诺卡氏菌。将分离的SDAT 0011感染健康乌鳢后,1×105～1×108 CFU/mL注射组的死亡率均为100%,感染乌鳢出现明显的诺卡氏菌病症状,如内脏出血,肝脏、脾脏和肾脏中有大量大小不等的结节,组织病理切片进一步检测发现,结节分界清晰,结节中有大量的淋巴细胞、受损或死亡的组织细胞。药物敏感性实验发现,诺卡氏菌对利福平等抗生素较为敏感,对青霉素等具有较强的抗性。基因表达分析显示,在感染初期(48 h)及中后期,Toll样受体2基因(TLR2)和Toll样受体13基因(TLR13)在脾脏和头肾的表达水平显著上调,而趋化因子受体9基因(CCR9)在脾脏和头肾中显著下调,这表明乌鳢Toll样受体和趋化因子受体信号通路可能在其抵抗诺卡氏菌感染中起重要作用。本实验为乌鳢诺卡氏菌病的...     

(鱼师)鱼诺卡氏菌研究进展

诺卡氏菌(Nocardia sp.)是一种革兰氏阳性丝状杆菌,具有抗盐、碱,耐干旱的特点,广泛分布于土壤、水体、空气、腐烂植物和动物粪便中[1-2].该菌为条件致病菌,其中某些种类为人畜共患[1].目前,已发现(鱼师)鱼诺卡氏菌(N.seriolae)、星状诺卡氏菌(N.asteroids)、杀鲑诺卡氏菌(N.salmonicida)和粗形诺卡氏菌(N.crassostreae)对鱼类具有致病性[1,3].鱼诺卡氏菌是鱼类诺卡氏菌病的主要病原,多数为腐生,少数营寄生[4].水产养殖动物一旦感染该菌,患病周期长、治愈率低、累积死亡率高,给我国的加州鲈(Microperus salmoides)、乌鳢(Channa argus)等特种水产养殖业造成了极大的经济损失[1,5].笔者综述了鱼诺卡氏菌的国内外研究概况,旨在为该病的有效防控提供参考.     

鰤鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化

对鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia seriolea）ZJ0503的增菌培养基和生长条件进行优化。研究了温度、盐度、初始pH对鰤鱼诺卡氏菌生长的影响，并通过单因素试验对培养基的碳源、氮源和无机盐成分进行了筛选，采用正交实验法对培养基各主要成分的添加量进行了优化。结果表明，鰤鱼诺卡氏菌最适宜生长条件为温度25 ℃、盐度5、pH 6.5±0.2；经筛选，鰤鱼诺卡氏菌培养基中最佳碳源是葡萄糖，最佳氮源是酵母粉，促生长作用最强的2种无机盐是磷酸氢二钾（K2HPO4）和氯化钙（CaCl2）；确立了培养基优化配方为葡萄糖20 g·L-1，酵母粉15 g·L-1，K2HPO4 0.75 g·L-1，CaCl 20.2 g·L-1（单独灭菌），氯化钠（NaCl2）5 g·L-1，pH 6.5±0.2。     

鱼类诺卡氏菌病的研究进展

诺卡氏菌广泛分布于自然界的水源中,是一种条件致病菌。引起鱼类诺卡氏菌病的细菌主要有星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)和杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)。鱼类诺卡氏菌病在每年的4-11月皆可发生,发病高峰主要集中在6-10月,在水温25~28℃时发病最为严重,死亡率最高。     

中草药复方制剂对乌鳢■诺卡氏菌病药效研究

为评价中草药复方制剂(HNK)对乌鳢■诺卡氏菌病药效，开展了体外抑菌试验、攻毒试验和药效试验。结果表明，HNK的最低抑菌浓度(MIC)为0.49 g/L，低于受试的穿梅三黄散以及大黄流浸膏；对乌鳢经腹腔注射■诺卡氏菌后，出现的典型症状为体表溃疡、肾脏肿大和内脏结节，乌鳢死亡率与攻毒菌液浓度成正相关，其中诺卡氏菌株菌液浓度2×10⁸和2×10⁹cfu/mL试验组，14 d内死亡率均为100%；药效试验中，低、中、高剂量HNK组死亡率分别为45%,20%和5%，抗生素组及阴性对照组分别为45%和90%，中、高剂量HNK组乌鳢出现结节等症状的数量最少。指出，HNK能够有效抑杀■诺卡氏菌，防治因■诺卡氏菌感染引起的乌鳢诺卡氏菌病，效果优于抗生素，具备良好的应用前景。     

灭活鰤鱼诺卡氏菌对乌醴非特异性免疫指标的影响

应用浓度为108CFU/ml的0.4%甲醛灭活鰤鱼诺卡氏菌Nocardia seriolea，经超声波破碎后对乌鳢进行腹腔注射，剂量为0.5 ml/尾，对照组同法等量注射灭菌生理盐水。分别于实验第0、3、6、9、12、15、18、21天抽取乌鳢血液，测定其血细胞数、血清总蛋白含量及血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶活性。结果显示，注射灭活鱼师鱼诺卡氏菌后，乌鳢血细胞数呈先升高后降低的变化趋势，在实验第12天时注射组血细胞数显著高于对照组；血清总蛋白含量在实验第9天后均高于对照组；血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶等活性在实验时间内均发生了显著的变化。研究结果表明，灭活菌苗的刺激能引起乌醴血细胞的增殖以及血清中各非特异性免疫指标的变化，从而提高机体自身的免疫保护力。     

鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化

对鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolea)ZJ0503的增菌培养基和生长条件进行优化。研究了温度、盐度、初始pH对鱼诺卡氏菌生长的影响,并通过单因素试验对培养基的碳源、氮源和无机盐成分进行了筛选,采用正交试验法对培养基各主要成分的添加量进行了优化。结果表明,鱼诺卡氏菌最适宜生长条件为温度25℃、盐度5、pH 6.5±0.2;经筛选,鱼诺卡氏菌培养基中最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是酵母粉,促生长作用最强的2种无机盐是磷酸氢二钾(K2HPO4)和氯化钙(CaCl2);确立了培养基优化配方为葡萄糖20 g·L-1,酵母粉15 g·L-1,K2HPO40.75 g·L-1,CaCl20.2 g·L-1(单独灭菌),氯化钠(NaCl)5 g·L-1,pH 6.5±0.2。     

Identification of Stress Sensitive Genes in Hyperthermic Atlantic Salmon (Salmo salar) Embryos by RAP-PCR

Deformities of skeletal structures, the heart, and other organs are a recurrent problem in species used in intensive aquaculture. Elevated egg incubation temperature appears to be a high risk factor in the development of these malformations, but the causal relation has not been established. Our aim was to identify candidate genes involved in the development of heat induced deformities in Atlantic salmon (Salmo salar). Temperature sensitive genes were isolated by RNA Arbitrarily Primed (RAP)-PCR. A total of 33 RAP-PCR products were successfully sequenced, and the expression of eight identified genes was further examined by RT-PCR from pooled samples of heat exposed embryos. Five of these genes were demonstrated to be temperature sensitive, of which four were shown to be up-regulated and one was down-regulated at elevated water temperatures. The atrial natriuretic peptide (ANP) gene, which is a promising candidate for heart deformities, showed the highest level of heat induction. Three additional RAP-PCR products identified as heterogeneous nuclear ribonucleprotein (hnRNP) A0, acyl CoA binding protein (ACBP) and mitochondrial (mt)-HSP70 showed up-regulated mRNA expression in response to elevated water temperature. The single down-regulated gene was identified as an Atlantic salmon (Salmo salar) homolog of the cysteine and tyrosine-rich 1 (CYYR1) gene. This study demonstrated that a temperature elevation of only 4 °C during the early stages of the organogenesis in Atlantic salmon induce altered expression of a number of genes, which are candidates for the development of heat induced deformities.     

鲍疱疹病毒原位LAMP检测方法的建立与初步应用

为精确定位鲍疱疹病毒(HaHV-1)在宿主不同组织器官中的分布,明确HaHV-1的组织亲嗜性和侵染进程,实验基于环介导等温扩增技术(LAMP)和原位杂交技术建立了HaHV-1的原位LAMP检测方法。利用该方法研究了HaHV-1人工感染实验不同时间节点,病毒在杂色鲍主要器官的分布规律和组织亲嗜性。并对已报道的HaHV-1 LAMP扩增引物进行优化,实现对载玻片上原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,筛选最佳显色时间等原位杂交反应条件,最后通过免疫酶标技术分析HaHV-1在组织样本内的分布情况。结果显示,HaHV-1原位LAMP检测方法最适显色时间为60 min。利用该方法对攻毒后24、36、48、60和72 h,HaHV-1在杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺和腹足神经节4种样本的组织分布情况进行检测和分析。病毒阳性信号最早于36 h出现在腹足神经节,48 h在部分外套膜样本中观察到病毒阳性信号,分布局限于外周神经中。在感染实验后期,病毒阳性信号出现在肝胰腺结缔组织中。病毒阳性信号出现的部位常有大量细胞渗出和浸润,渗出的细胞中可见被病毒感染的血淋巴细胞。本研究建立的HaHV-1原位LAMP检...     

大黄鱼sox9a/b基因的克隆与表达分析

为探究sox9基因在大黄鱼性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆得到大黄鱼sox9a和sox9b 2个基因,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析其在雌雄个体不同组织和不同发育阶段的表达规律,并检测了其在17β-雌二醇处理后的遗传雄性和17α-甲基睾酮诱导处理后遗传雌性幼鱼中的表达变化。结果显示,大黄鱼sox9a c DNA全长2 442 bp(NCBI登录号:MH996431),包含476 bp 5′UTR、466 bp 3′UTR、1 500 bp ORF,编码499个氨基酸。大黄鱼sox9b cDNA全长为2 199 bp (NCBI登录号:MH996432),包含335 bp5′UTR、415 bp 3′UTR、1 449 bp ORF,编码482个氨基酸。qRT-PCR分析显示,sox9a基因主要在性腺、眼、脑、肝脏中表达,精巢中的表达量显著高于卵巢;sox9b在大黄鱼各组织中广泛表达,但以精巢中表达量最高,而卵巢中只有痕量表达。在鱼苗性腺发育初期,sox9a/b的表达量都维持在较低水平;随着鱼苗长大,sox9a/b的表达量在84 dph、123 dph 2次达到高峰,随后开始下降,10 mph后又逐渐上升。17β-雌二醇处理能够显著下调遗传雄性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达,17α-甲基睾酮处理则显著上调遗传雌性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达。研究表明,sox9a/b基因与大黄鱼性别发育和分化过程密切相关,对大黄鱼精巢的发育与维持起重要的调控作用,而且两个基因的功能可能具有一定程度的分化。     

半滑舌鳎TRAF6 基因和TAK1 基因的克隆及表达分析

本研究通过同源克隆和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)和转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)的c DNA全长,并分析了其在不同组织和早期胚胎发育时期的表达情况。结果表明,TRAF6 c DNA全长1956 bp,开放阅读框(ORF)为1731 bp,编码576个氨基酸。二级结构预测显示TRAF6具有保守的蛋白结构域:N端的RING结构,两个锌指结构以及C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构和高度保守的MATH同源结构。TAK1 c DNA全长2519 bp,ORF为1731 bp,编码576个氨基酸。TAK1的蛋白结构域包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶激活结构域和C端的环–环(coiled-coil)α螺旋结构域。系统进化树分析表明,半滑舌鳎TRAF6和TAK1分别与牙鲆(Paralichthys olivaceus)TRAF6和TAK1聚为一支,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,TRAF6和TAK1在所检测的8种组织中都有表达,TRAF6在鳃中的表达最高,肠中也有较高的表达;TAK1在心脏中的表达量最高,其次是肾。TRAF6和TAK1在鳃、肾等免疫器官中的高表达,与其在Toll样受体信号通路中的重要作用是一致的。对TRAF6和TAK1在早期胚胎发育时期的表达情况进行检测,结果显示,在未受精卵中可检测到TRAF6和TAK1,提示了这两种免疫分子的母源性m RNA遗传的可能性。免疫分子母源性m RNA可能参与发育过程,也可能参与构建免疫体系,以保护胚胎或仔鱼免受病原体的侵袭。     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268^+56 bp,且-1 308^-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224^+48 bp,且+48^+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229^-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。     

倒刺鲃属三个种之间种间杂交的初步研究

采用人工催产和干法授精技术,进行了以中华倒刺鲃、倒刺鲃为母本与其父本及黑脊倒刺鲃雄鱼的种间杂交实验,获得4个杂交组合和2个自交组合,在(27±0.5)℃温度条件下,对其F₁卵膜径、受精率、孵化率、孵化时间、畸形率、子代早期形态特征与成活率进行了比较,同时,观察了胚胎发育及其异常现象,结果表明:以中华倒刺鲃为母本的F₁卵膜径差异不显著;以倒刺鲃为母本的F₁卵膜径,在多细胞期时差异不显著,在耳石期时,倒刺鲃♀×中华倒刺鲃♂F₁卵膜径显著大于母本(P<0.05)。杂种F₁的受精率、孵化时间与母本差异不显著,畸形率显著高于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃杂种F₁的孵化率较高,与母本差异不显著(P<0.05)。倒刺鲃♀×中华倒刺鲃♂F₁的孵化率与母本之间差异不显著,倒刺鲃♀×黑脊倒刺鲃♂F₁的孵化率显著低于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃杂种F₁仔鱼早期发育阶段存在死亡高峰期,成活率显著低于母本(P<0.05)。中华倒刺鲃种间杂交和倒刺鲃♀×黑脊倒刺鲃♂杂种F₁既具有父本特征,同时又具有母本特征,初步证明倒刺鲃属种间杂交是可行的。     

欧洲鳗短钩拟指环虫病及其鳃组织病理

报道了患短钩拟指环虫病欧洲鳗的症状、流行状况和鳃显微组织病理.游动和呼吸频率异常、鳃丝浮肿和鳃上粘液增多为该病的主要症状.该病尽管在冬季也有发生,但水温在26℃以上的春末、夏季和秋初是最易发病的流行季节,流行出现明显的季节性变化.患病欧洲鳗鳃的组织病理变化主要表现出5种类型,其一是鳃小片上皮细胞增生,使邻近的鳃小片相连;其二是鳃小片粘液细胞增生,同样使鳃小片连成一片,增生的粘液细胞经阿利新蓝(Alclan blue)和过碘酸雪夫氏(Periodic acid schiff)二者联合染色后呈蓝紫色的染色反应,属于Ⅳ型的粘液细胞;其三是鳃小片肿大,但单层扁平上皮细胞无肿大现象,上皮细胞层与毛细血管相分离,鳃小片上皮细胞坏死,上皮细胞层破裂,血细胞外溢,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,失去鳃小片原有的结构;其四是鳃小片肿大同时伴随单层扁平上皮细胞肿大,进一步发展,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,鳃小片同样失去原有的结构;其五是鳃小片毛细血管严重充血扩张,比原毛细血管扩张几倍到十几倍,形成充满红细胞的棒状到球状的动脉瘤.结果表明鳃上皮细胞增生、粘液细胞增生、鳃小片肿大、上皮细胞坏死脱落和严重充血成动脉瘤等病理变化都可导致患病欧洲鳗呼吸困难,轻者影响其生长,重者最终因呼吸衰竭而死亡.     

大菱鲆高温胁迫应答主效QTL候选基因的表达特性分析

为研究大菱鲆高温胁迫下相关应激基因的表达影响,采用Real-time PCR对本课题组已定位到的大菱鲆高温胁迫应答主效QTL中的4个候选基因(p53、UBE2H、ZNF469和MAGI2基因)在不同温度胁迫下的肝脏、鳃、脾脏、皮肤4个组织中的表达量进行检测。以大菱鲆正常生活水温14°C为对照组,20°C、23°C、25°C和28°C为实验组,进行数据分析。结果显示,4个基因在各个组织中均有表达,且表达量具有组织和温度特异性。其中UBE2H的表达量在4个组织中均呈现出先上升后下降的趋势,在肝脏、脾脏、皮肤组织中20°C时急剧上升并达到峰值且差异显著;在鳃组织中23°C时达峰值,差异显著。p53在4个组织中的表达量均有先上升后下降的趋势,但在鳃和皮肤组织中28°C时表达量急剧升高达到峰值且差异显著。ZNF469和MAGI2在4个组织中均在20°C时大量表达,并远高于其他温度。研究表明,在大菱鲆高温胁迫应答过程中p53基因与DNA修复和细胞凋亡密切相关,而UBE2H基因参与的泛素-蛋白酶体途径对p53基因具有反馈调节作用,是维持细胞稳态的关键基因;ZNF469和MAGI2在作为鱼类应答高温胁迫的生物标志物方面具有重要研究价值。     

青鱼和鲇肠道排泄物对养殖水体铜绿微囊藻休眠体复苏的影响及作用途径

为探讨养殖水体底栖鱼类肠道排泄物对铜绿微囊藻休眠体复苏的影响,将青鱼和鲇肠道排泄物与铜绿微囊藻休眠体用野外养殖水域沉积物(底泥)混匀包埋,在10、15和20°C梯度温度下进行休眠体复苏实验。结果显示,铜绿微囊藻休眠体主要复苏期为第3～15天,在10和15°C条件下,青鱼排泄物组(MP)、鲇排泄物组(SA)和青鱼-鲇排泄物混合组(MP-SA)铜绿微囊藻休眠体复苏率均显著高于对照组(CK),且MP组也显著高于SA组和MP-SA组;在20°C条件下,MP组铜绿微囊藻休眠体复苏率显著高于SA组、MP-SA混合组和CK组,但SA组和MP-SA组与CK组复苏率并无显著性差异。实验过程中MP组沉积物中优势菌群以假单胞菌为主,SA组和MP-SA组优势菌群分别以芽孢杆菌和厚壁菌为主,第0～12天为菌群增殖期,且此期间沉积物-水体界面(SWI)实验MP组、SA组和MP-SA组溶解氧含量(DO)和氮磷比(N/P)均显著低于对照组。研究表明,青鱼和鲇肠道排泄物能促进铜绿微囊藻休眠体复苏,且这种促复苏效果在低温区间(10～15°C)更显著,可能是排泄物中菌群在生长增殖期降低了沉积物-水体界面N/P和DO的结果。研究结果对养殖水体底泥清淤和春季铜绿微囊藻水华防控具有一定的理论意义。     

定量表达和整体原位杂交研究Doublesex基因在不同生殖状态蚤状溞的表达

为研究doublesex(dsx)基因在不同生殖状态的蚤状溞的时空表达状况,提取不同生殖状态的蚤状溞RNA,采用RT-PCR和Quantitative real-time PCR检测了dsx在不同生殖状态溞体的表达差异,并通过体外转录制备DIG标记的Doublesex的RNA探针;采用整体原位杂交方法研究dsx基因在不同生殖状态的蚤状溞的时空表达状况。结果显示,RT-PCR检测发现dsx在雌雄溞体没有性别特异性的选择性拼接,只有一种相同的转录产物。Real-time PCR显示,dsx在雄溞中表达水平最高,是孤雌溞的2.6倍,两性雌溞的4.9倍,三者之间有显著性差异,表现出性别差异性表达。整体原位杂交发现,在所取样的不同生殖状态溞体中dsx基因也均有表达,但其部位与表达量不同,且在雌雄溞体中表现出性别差异。在雄溞的第一触角和第一胸肢显现得尤为明显,且在复眼中也有表达。孤雌溞和两性雌溞对应部位表达则相对较弱。结果表明,dsx基因很有可能在调控蚤状溞生殖转换和性别分化上起到很大作用。