大阪鲫卵黄蛋白原和钙离子关系的初步研究

注射苯甲酸雌二醇诱导雄性大阪鲫产生雌性特异血清蛋白(卵黄蛋白原),随着诱导天数的增加,血清中的钙离子浓度升高,同时血清中的卵黄蛋白原的含量也相应增加。在此过程中肝细胞的细胞质中存在大量的钙离子,并进行着旺盛的蛋白合成。雌鱼和被诱导的雄鱼一样在肝细胞内也存在大量的钙离子。正常雄鱼的肝细胞不合成卵黄蛋白原,只有很少的钙离子存在。腹腔注射氯化钙使卵母细胞的卵径增大(实验组为 1.08±0.14mm;对照组为 1.04±0.14mm),并使卵母细胞的蛋白含量升高,同时卵泡膜上毛细血管的分布更为稠密,这表明钙离子可促进卵母细胞的发育和蛋白的吸收。     

不同倍性虹鳟卵黄蛋白原的组织定位

采用分步沉淀法提纯虹鳟卵黄蛋白,以同发育期二倍体虹鳟为对照,用免疫组化法对不同发育阶段的三倍体虹鳟性腺、肝脏、血液和肠道进行卵黄蛋白原(Vg)的细胞化学定位研究.试验结果表明:所纯化蛋白为与卵黄蛋白原具有相似免疫原性的卵黄脂磷蛋白,呈雌性特异性.性腺发育Ⅲ～Ⅴ期的二倍体雌性虹鳟,血液和肝细胞呈卵黄蛋白原阳性,Ⅳ～Ⅴ期卵巢呈卵黄蛋白原阳性,各发育期肠组织呈卵黄蛋白原阴性;性腺发育至Ⅰ～Ⅴ期的三倍体雌雄虹鳟及雄性二倍体虹鳟,其性腺、肝脏、血液和肠道组织呈卵黄蛋白原阴性.二倍体虹鳟外源性卵黄蛋白原在肝细胞内合成,经血液运送至卵巢,最终在卵母细胞中形成卵黄颗粒.由于三倍体雌性虹鳟卵巢发育受阻,无滤泡细胞分化,生殖细胞与体细胞的互作缺失,不能分泌足量的17β-E2以诱导Vg的合成,因而肝脏的Vg阴性并不能说明肝脏不具备合成Vg的能力,从卵黄发生的角度分析,卵黄蛋白原的缺乏不是导致三倍体虹鳟雌性不育的原因,而是其卵泡败育的结果.     

小体鲟卵黄雌性蛋白分离纯化及抗血清的研制

采用凝胶柱层析法,对小体鲟(Acipenser ruthenusLinnaeus)卵黄蛋白粗提液进行分离纯化。小体鲟卵黄蛋白粗提液的质量浓度为25.04 mg/mL,经Sephadex G-200层析后出现3个蛋白峰。用聚丙烯凝胶电泳、免疫印迹(Western-blotting)和免疫扩散等方法研究表明,小体鲟卵黄蛋白由分子量分别为132.1 kD、97.4 kD、85.9 kD、67.0 kD、59.2 kD、47.6 kD、30 kD、14.3 kD和12.8 kD的9个亚基组成;层析后峰B蛋白为卵黄雌性特异蛋白(yolk female specific protein,YFSP),是一种糖脂磷蛋白,具有雌性特异性和组织特异性,抗体具有种属特异性。Western-blotting结果表明,卵黄雌性特异蛋白(YFSP)与血清雌性蛋白(FSSP)免疫印迹图谱上都显示分子量为97.4 kD和30 kD的2条杂交带,可见两种蛋白在免疫原性上具有相似性,可以用卵黄雌性蛋白抗血清代替卵黄蛋白原抗血清对卵黄蛋白原进行检测     

泛甲壳动物激素调控卵黄蛋白原合成的分子机制研究进展

昆虫和甲壳动物由于进化上亲缘关系近统称泛甲壳动物，大多数泛甲壳动物卵黄蛋白原为雌性特异性蛋白，是卵母细胞中储存的卵黄蛋白的前体，可为胚胎发育提供营养和能量，是决定繁殖性能的关键因素，在生殖发育起着十分重要作用。业已证明，调控泛甲壳动物卵黄蛋白原的主要激素有保幼激素、蜕皮激素、神经肽和胰岛素样肽等。昆虫保幼激素和蜕皮激素发挥促进作用，而神经肽和胰岛素样肽对卵黄蛋白原合成的调控作用因种类不同存在不同。除了以上激素，甲壳动物特有的眼柄高血糖激素家族以及促雄腺激素对卵黄蛋白原的合成起负调控作用。本文总结了近年来泛甲壳动物卵黄蛋白原合成的调控机制的相关研究，概括并比较了调控昆虫与甲壳动物的卵黄蛋白原合成的主要激素及调控机制，为养殖虾蟹甲壳动物生殖调控相关研究提供参考。     

雌性特异蛋白质复合物促黄鳝性腺发育、提高黄鳝孵化率

自Aida(1973)在香鱼的血清研究中报导了鱼的血清含有雌性特异蛋白以来,已有许多学者对鱼的雌性蛋白的生化特性、分子量以及生化提纯进行了一些工作,还用同位素示踪追踪C~(14)在雌性特异蛋白合成的过程。但应用雌性特异蛋白和雌性鱼类性腺蛋白质复合物在黄鳝人工繁殖时期促进性腺发育和提高黄鳝苗的孵化率工作,直到目前为止,国内外还没有发现有人报导过。我们这项科研目的就是要提高黄鳝人工孵化的效果。     

卵黄蛋白原的发生、结构及功能研究现状

卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)是一种普遍存在于卵生非哺乳动物血液中的蛋白,是几乎所有卵生动物中卵黄蛋白(Yolk protein)的前体[1]。Vg最初是Pan(1969)等对雌性昆虫血液淋巴蛋白的特称,后来广泛的把这种在卵生动物的卵黄形成过程中,雌性个体血浆中大量存在的含糖、磷、脂的大分子蛋白描述为卵黄蛋白原[2]。卵黄蛋白原不仅被认为是一种理想的雌激素和类雌激素标志物,近年来被广泛应用于环境的内分泌干扰物的筛选及环境毒理、污染调查等研究中[3],它还可为正在发育的动物胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、磷、硫及微量元素等营养…     

鱼的雌性特异蛋白复合物注射鱼体后作用机制的探讨

鱼的雌性特异蛋白(Female Specific Protein简称FSP)是雌鱼的特有蛋白 一般是从雌鱼血清中经层析、电泳可得到电泳纯雌性特异蛋白。作者采用生化法分离出雌性特异蛋白复合物，并进行免疫双扩散、电泳分析，血清中Ca^2 离子及肝脏中葡萄糖六磷酸脱氢酶的测定，以跌卵试验测定其生物活性，发现FSP比对照组有显著高的跌卵作用，将复合物注射给产卵期雌鱼的腹腔及肌肉中，发现鱼血清中Ca^2 上升，肝脏中葡萄糖糖磷酸脱氢酶(G-6-PD)活性升高；同步实验显示血清中蛋白质含量及肝脏中RNA含量也显著上升，这些试验结果反映了FSP对鱼体的内部作用机制．     

饲料磷脂对已交配和未交配三疣梭子蟹卵巢发育、组织学和卵黄蛋白原表达的影响

为探讨饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育、组织学结构和卵黄蛋白原基因表达的影响,本研究采用2×2双因子随机区组设计(日粮类型:0%和4%大豆卵磷脂;三疣梭子蟹交配处理:已交配和未交配),共4个处理组,以大豆卵磷脂0%和4%两种人工配合饲料分别投喂交配和未交配两组三疣梭子蟹雌蟹,进行了为期12周的饲养实验。结果显示,无论三疣梭子蟹是否交配,饲料中添加4%大豆卵磷脂可显著增加三疣梭子蟹的卵巢指数,提高血清中卵黄蛋白原、孕酮和雌二醇的浓度,增大卵母细胞直径;同时上调肝胰腺卵黄蛋白原mRNA相对表达量,但无显著性差异,肝胰腺指数呈现出和卵巢指数相反的趋势;交配后的三疣梭子蟹卵巢指数、肝胰腺卵黄蛋白原mRNA表达量显著高于未交配组。组织学观察显示,交配使得三疣梭子蟹卵母细胞沉积更丰富的卵黄颗粒,促进卵母细胞成熟,交配处理对肝胰腺指数和血清中卵黄蛋白原及孕酮的水平无显著性影响。此外,饲料磷脂水平和交配处理的交互作用显著影响了三疣梭子蟹血清中类固醇激素孕酮和雌二醇的浓度。本实验结果表明,饲料中大豆磷脂和交配处理均能促进雌性三疣梭子蟹的卵巢发育,交配处理对卵母细胞成熟的促进作用更为明显。     

饲料磷脂对已交配和未交配三疣梭子蟹卵巢发育、组织学和卵黄蛋白原表达的影响

为探讨饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育、组织学结构和卵黄蛋白原基因表达的影响,本研究采用2×2双因子随机区组设计(日粮类型:0%和4%大豆卵磷脂;三疣梭子蟹交配处理:已交配和未交配),共4个处理组,以大豆卵磷脂0%和4%两种人工配合饲料分别投喂交配和未交配两组三疣梭子蟹雌蟹,进行了为期12周的饲养实验。结果显示,无论三疣梭子蟹是否交配,饲料中添加4%大豆卵磷脂可显著增加三疣梭子蟹的卵巢指数,提高血清中卵黄蛋白原、孕酮和雌二醇的浓度,增大卵母细胞直径;同时上调肝胰腺卵黄蛋白原mRNA相对表达量,但无显著性差异,肝胰腺指数呈现出和卵巢指数相反的趋势;交配后的三疣梭子蟹卵巢指数、肝胰腺卵黄蛋白原mRNA表达量显著高于未交配组。组织学观察显示,交配使得三疣梭子蟹卵母细胞沉积更丰富的卵黄颗粒,促进卵母细胞成熟,交配处理对肝胰腺指数和血清中卵黄蛋白原及孕酮的水平无显著性影响。此外,饲料磷脂水平和交配处理的交互作用显著影响了三疣梭子蟹血清中类固醇激素孕酮和雌二醇的浓度。本实验结果表明,饲料中大豆磷脂和交配处理均能促进雌性三疣梭子蟹的卵巢发育,交配处理对卵母细胞成熟的促进作用更为明显。     

饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育、组织学和卵黄蛋白原表达的影响

为探讨饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育、组织学结构和卵黄蛋白原基因表达的影响,本研究采用2×2双因子随机区组设计(日粮类型:0%和4%大豆卵磷脂;三疣梭子蟹交配处理:已交配和未交配),共4个处理组,以大豆卵磷脂0%和4%两种人工配合饲料分别投喂交配和未交配两组三疣梭子蟹雌蟹,进行了为期12周的饲养实验。结果显示,无论三疣梭子蟹是否交配,饲料中添加4%大豆卵磷脂可显著增加三疣梭子蟹的卵巢指数,提高血清中卵黄蛋白原、孕酮和雌二醇的浓度,增大卵母细胞直径;同时上调肝胰腺卵黄蛋白原m RNA相对表达量,但无显著性差异,肝胰腺指数呈现出和卵巢指数相反的趋势;交配后的三疣梭子蟹卵巢指数、肝胰腺卵黄蛋白原m RNA表达量显著高于未交配组。组织学观察显示,交配使得三疣梭子蟹卵母细胞沉积更丰富的卵黄颗粒,促进卵母细胞成熟,交配处理对肝胰腺指数和血清中卵黄蛋白原及孕酮的水平无显著性影响。此外,饲料磷脂水平和交配处理的交互作用显著影响了三疣梭子蟹血清中类固醇激素孕酮和雌二醇的浓度。本实验结果显示,饲料中大豆磷脂和交配处理均能促进雌性三疣梭子蟹的卵巢发育,交配处理对卵母细胞成熟的促进作用更为明显。     

饲料磷脂对已交配和未交配三疣梭子蟹卵巢发育、组织学和卵黄蛋白原表达的影响

为探讨饲料磷脂对已交配和未交配雌性三疣梭子蟹卵巢发育、组织学结构和卵黄蛋白原基因表达的影响,本研究采用2×2双因子随机区组设计(日粮类型:0%和4%大豆卵磷脂;三疣梭子蟹交配处理:已交配和未交配),共4个处理组,以大豆卵磷脂0%和4%两种人工配合饲料分别投喂交配和未交配两组三疣梭子蟹雌蟹,进行了为期12周的饲养实验。结果显示,无论三疣梭子蟹是否交配,饲料中添加4%大豆卵磷脂可显著增加三疣梭子蟹的卵巢指数,提高血清中卵黄蛋白原、孕酮和雌二醇的浓度,增大卵母细胞直径;同时上调肝胰腺卵黄蛋白原mRNA相对表达量,但无显著性差异,肝胰腺指数呈现出和卵巢指数相反的趋势;交配后的三疣梭子蟹卵巢指数、肝胰腺卵黄蛋白原mRNA表达量显著高于未交配组。组织学观察显示,交配使得三疣梭子蟹卵母细胞沉积更丰富的卵黄颗粒,促进卵母细胞成熟,交配处理对肝胰腺指数和血清中卵黄蛋白原及孕酮的水平无显著性影响。此外,饲料磷脂水平和交配处理的交互作用显著影响了三疣梭子蟹血清中类固醇激素孕酮和雌二醇的浓度。本实验结果表明,饲料中大豆磷脂和交配处理均能促进雌性三疣梭子蟹的卵巢发育,交配处理对卵母细胞成熟的促进作用更为明显。     

中草药淫羊藿和菟丝子对日本鳗鲡卵巢发育的影响

在水温(21±1)℃下,给体重(592.5±52.5) g的日本鳗鲡(Anguilla japonica)雌亲鱼投喂每千克体重含0.034 g淫羊藿和0.034 g菟丝子浸膏的饲料90 d,对照组投喂人工配合饲料,研究淫羊藿和菟丝子对卵巢发育的影响。结果显示,饲料中添加淫羊藿和菟丝子的雌鱼卵巢大部分卵母细胞属第Ⅱ时相,性腺指数和肝体比均显著高于对照组(P0.05);卵母细胞油滴明显增多,部分卵母细胞胞质已充满油滴,核仁变小增多;血清雌二醇(E2)和11-酮基睾酮(11-KT)水平显著升高(P0.05),实验组11-KT含量约为对照组的4倍;肝脏卵黄蛋白原基因vtg表达量升高,实验组和对照组卵巢cyp19a1仅微量表达,肝脏未检测到erα和erβ的表达;实验组肌肉总脂肪酸、饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和高度不饱和脂肪酸(HUFA)含量均显著高于对照组(P0.05),最主要的高度不饱和脂肪酸花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)含量均显著高于对照组(P0.05)。本研究表明,在亲鱼培育饲料中添加中草药淫羊藿和菟丝子促进了日本鳗鲡卵母细胞油滴和肝脏卵黄蛋白原增加,提高了肌肉高不饱和脂肪酸的积累,为卵黄生成和卵母细胞进一步发育做好更充分的准备。     

水生动物卵黄蛋白原研究新进展

卵黄蛋白原（vitellogenin,VTG）是卵生动物卵黄中主要成分的前体。文章简述了水产动物如鱼类、两栖类及甲壳类动物中卵黄蛋白原基因的鉴定及其基因家族的分类及进化研究,介绍了VTG分子的生物学新功能,以及VTG作为标记分子在环境雌激素监测、反映雌性动物性腺成熟度、区分雌雄性别等方面的应用,以期为VTG在水产动物中的研究以及繁殖中的应用提供参考。     

剑尾鱼卵黄蛋白原基因片段克隆、表达及蛋白检测方法的建立

本研究通过对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)卵黄蛋白原基因片段的克隆和表达,建立了剑尾鱼卵黄蛋白原蛋白检测方法.根据已发表的底鳉(Fundulus heteroclitus)卵黄蛋白原mRNA序列设计引物,利用RT-PCR法扩增出1段1 118 bp的剑尾鱼卵黄蛋白原cDNA片段,序列分析表明该片段与其他鱼类卵黄蛋白原基因序列相似性较高,其中与底鳉和食蚊鱼(Gambusia affinis)的同源性分别达87.4%和96.7%.在对该片段所编码氨基酸序列可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,预期得到258个氨基酸的表达蛋白.表达载体转入大肠杆菌DH5α,经热诱导后,SDS-PAGE分析有29 kD的表达蛋白产生,与预期相符.以重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗血清.雌激素(β-雌二醇)对剑尾鱼诱导后,用重组蛋白抗血清作一抗,进行Westernblot分析.结果表明,该抗血清能与剑尾鱼卵黄蛋白原特异结合,可应用于剑尾鱼卵黄蛋白原的检测.卵黄蛋白原是环境雌激素研究中较为特异、灵敏的生物标志物,剑尾鱼卵黄蛋白原检测方法的建立,为剑尾鱼环境监测应用提供良好基础.     

雌性特异蛋白复合物促鱼类性腺发育及提高孵化率机制的研究

本实验系用生物化学方法从鲤鱼性腺中提取出一种雌性特异蛋白复合物,氨基酸分析发现该复合物含有全部必需氨基酸;将该蛋白复合物注射到雌性大阪鲫鱼体内,发现鱼的血清中蛋白质含量增加,同时对大阪鲫鱼肝脏分析发现核糖核酸(RNA)含量也增加。     

雌性特异蛋白生物活性的研究

本实验采用蟾蜍离体跌卵法和鱼类腹腔注射法证明雌性特异蛋白有促进鱼类性腺发育的作用。     

瓦氏黄颡鱼血清卵黄蛋白原、钙离子的变化与性腺发育的关系

在雌性瓦氏黄颡鱼性腺发育过程中,随着卵巢中卵黄蛋白的积累,性腺系数的增加,血清中钙离子浓度升高,同时血清中的卵黄蛋白原含量也相应地增加。然而在雄鱼的性腺发育过程中血清钙离子无明显变化。产卵后,雌鱼卵黄蛋白原、钙离子含量降至最低水平。     

中华锯齿米虾卵黄蛋白原部分cDNA序列的克隆

卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)是广泛地存在于卵生脊椎和无脊椎动物体内的雌性特异性蛋白,是卵黄蛋白(vitellin,Vn)的前体,本文通过同源克隆的方法从成熟中华锯齿米虾的卵巢中克隆到了一条长474 bp的Vg cDNA序列。用DNAMAN中的Blast功能将此片段与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、高背长额虾(Pandalus hypsinotus)的Vg部分序列进行比对,结果发现中华锯齿米虾与罗氏沼虾和高背长额虾的同一性分别为64%与62%。此片段为中华锯齿米虾Vg cDNA全长序列的克隆及其表达奠定了基础。     

中国对虾卵黄蛋白原合成部位的研究

十足目甲壳类卵巢中卵黄的来源,在过去的几十年研究中一直存在争议,内源性合成和外源性合成都有报道。本文以雌性中国对虾为实验材料,根据组织学观察确定其发育阶段,试验虾可以分为:卵巢未发育期;卵黄发生前期;初级卵黄发生期和次级卵黄发生期4个时期。从处于不同卵巢发育期对虾的卵巢和肝胰腺中提取总RNA,用RT-PCR的方法初步探讨不同发育期的中国对虾卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原mRNA的表达,确定是否存在卵黄蛋白原的合成功能。结果发现,从卵巢未发育期到次级卵黄发生期的卵巢和肝胰腺中都有卵黄蛋白原mRNA的表达,说明二者为卵黄蛋白的合成部位。     

越冬期饥饿对河川沙塘鳢雌鱼卵巢发育的影响

以投喂鲜活中华米虾（Cardina sinensis）作为正常对照,对处于越冬期的雌性河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）进行了为期一个月的饥饿试验。至试验结束时,与对照组相比,饥饿组鱼的体重、肝体指数发生了显著（P<0.05）和极显著的下降（P<0.01）;卵巢内可供继续发育形成成熟卵子的3时相中、后期卵母细胞数量骤减,卵巢整体发育程度仅到达Ⅲ期,滞后于正常投喂组的Ⅳ期卵巢,提示饥饿对越冬雌性亲鱼的性腺发育造成了不良影响。试验同时发现,饥饿组的性腺指数在28d内未发生显著变化（P>0.05）;饥饿组卵巢中卵黄脂磷蛋白的含量、肝脏中卵黄蛋白原的基因表达量及血清中的卵黄蛋白原含量都呈现出先降后升的变化趋势,其中前两项指标在28d时分别回升到了14.31±1.11µg/mg和2081.08±124.86的水平,与对照组已无显著差异（P>0.05）;组织切片观察发现,饥饿组卵巢中退化卵子的卵黄崩解产物被重吸收,细胞质中只剩余大量小泡。研究结果提示,饥饿状态下雌性河川沙塘鳢体内可能启动了一种性腺发育补偿机制,且该机制有多种表现形式,能使机体通过消耗自身贮能来保证子代繁殖任务的完成。