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相似文献
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1.
近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)热休克蛋白70(HSP70)家族成员是重要的抗逆和潜在污染预警分子。本研究将近江牡蛎HSP70基因cDNA连接到原核表达载体pQE30中,构建近江牡蛎HSP70的重组表达质粒pQE30/HSP70。该重组质粒经酶切和测序鉴定后,转入表达宿主大肠杆菌M15进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Westernblot分析表明,确实获得了重组蛋白的表达。分别在25℃、30℃和37℃下,经0.2mmol/LIPTG诱导融合蛋白表达,其中,在25℃下,诱导的融合蛋白表达量最高,表明该温度为恰当诱导温度;在25℃下,分别诱导重组蛋白表达2h、4h、6h、8h、12h和16h,其中诱导12h的蛋白表达量最高;大部分融合蛋白以可溶形式存在于大肠杆菌M15中;表达的重组融合蛋白分子量约69kD,并能与鼠源抗6伊His的单克隆抗体特异性结合,表明通过原核表达获得了近江牡蛎HSP70蛋白。实验表明,在25℃下,经0.2mmol/LIPTG诱导表达12h,可获得大量可溶近江牡蛎HSP70蛋白。  相似文献   

2.
为了研究淋巴因子基因(T-cell acute lymphocytic leukemia,tal)在香港牡蛎中的免疫功能,实验采用c DNA末端快速扩增技术(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)克隆了香港牡蛎tal的c DNA全长序列,命名为Chtal,该基因全长812 bp,其中5?非编码区17 bp,3?非编码区135 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)660 bp,编码219个氨基酸,相对分子质量25.11 ku,理论等电点5.80。多序列比对和系统进化树结果显示,Chtal与长牡蛎、美洲牡蛎和海蜗牛tal同源性较高,证明了该基因是软体动物tal家族的一个成员。荧光定量PCR结果显示,Chtal在香港牡蛎血淋巴细胞中表达量最高,其次是心脏、鳃和消化腺。在溶藻弧菌和溶血性葡萄球菌刺激后,Chtal表达量显著上调,分别在24和12 h达到最高水平,随着时间的增加该基因的表达量逐渐下降。亚细胞定位结果显示,Chtal在细胞核中表达。活体注射重组TAL蛋白能够显著提高淋巴细胞的数量,通过Edu增殖实验进一步证实了tal具有促进香港牡蛎血淋巴细胞再生的功能。本研究初步揭示了香港牡蛎tal参与了淋巴细胞再生,为深入研究该基因在牡蛎抗病中的功能提供了依据。  相似文献   

3.
为了评估饲料中添加酵母提取物对凡纳滨对虾免疫灵敏性和平衡性的相关基因表达的影响,以鱼粉含量为24.5%的基础饲料(对照组)及在基础饲料中添加2.5%酵母提取物的实验饲料,分别饲喂凡纳滨对虾56 d,检测两种饲料投喂的对虾在急性感染溶藻弧菌前后鳃组织Toll受体、IM D和溶菌酶mRNA表达量变化及感染后的对虾死亡情况。结果表明:摄食添加酵母提取物饲料的凡纳滨对虾鳃组织中Toll受体mRNA和溶菌酶mRNA表达量均显著高于对照组对虾(P0.05),IMD mRNA表达量与对照组无显著性差异(P0.05)。急性感染溶藻弧菌后,两组对虾鳃组织Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量随感染进程均出现显著变化,Toll受体、IMD和溶菌酶mRNA表达量峰值出现的时间分别为24、42和36 h,且摄食添加酵母提取物组对虾各基因的表达量峰值分别为对照组峰值的201.06%、481.46%和276.77%,均显著高于对照组对虾(P0.05)。摄食添加酵母提取物饲料组对虾鳃组织中Toll受体和IM D mRNA表达量在感染溶藻弧菌后12和24 h分别出现显著上调,而对照组对虾鳃组织中Toll受体和IMD mRNA表达量分别在感染弧菌后24和42 h才出现显著上调。两组对虾经溶藻弧菌人工急性感染后72 h内的累积死亡率无显著差异(P0.05)。实验表明,饲料中添加酵母提取物上调了溶藻弧菌感染前凡纳滨对虾Toll受体和溶菌酶mRNA的表达量,提早了溶藻弧菌感染后对虾Toll受体和IMD mRNA表达量上调时间,且增加了对虾Toll受体、IM D和溶菌酶mRNA表达量的峰值,在一定程度上提高了凡纳滨对虾免疫相关基因表达的灵敏性。  相似文献   

4.
酚氧化酶是一种含铜的金属酶,广泛分布于微生物、动植物及人体中。该酶在无脊椎动物先天免疫防御中起着重要的作用。用分子克隆技术得到了虾夷扇贝酚氧化酶cDNA基因全序列,并利用Real-Time PCR方法分析了酚氧化酶基因在虾夷扇贝不同组织中表达概况以及鳗弧菌注射后不同时段的相对表达量。试验得到的酚氧化酶基因全长1850bp,其包括长为1470bp的开放阅读框,编码489个氨基酸,5’UTR和3’UTR分别为37bp和343bp。实时定量分析研究显示,酚氧化酶基因在肝胰腺、外套膜、肾、闭壳肌、鳃和血中均有表达,其中外套膜表达最高。鳗弧菌注射后6h,酚氧化酶基因表达量显著低于对照组,而注射后12~36h,酚氧化酶基因表达量显著高于对照组,表明该基因可能在免疫过程中发挥重要作用。  相似文献   

5.
于5L试验容器内,以副溶血弧菌和溶藻弧菌通过菌浴和口服法感染拟穴青蟹溞状幼体,比较2种弧菌对拟穴青蟹溞状幼体感染的致病力。海水水温25~26℃,盐度30.1,紫外线消毒。试验结果表明,副溶血弧菌菌浴感染拟穴青蟹幼体,24h对Z1至Z5幼体半致死密度分别为4.03×105、7.67×105、8.56×105、1.98×106、8.99×106cfu/mL;溶藻弧菌菌浴拟穴青蟹幼体,24h对Z1至Z5幼体半致死密度为5.76×106、7.64×106、7.92×106、1.02×107、6.02×107 cfu/mL;口服感染试验的幼体死亡率随投喂次数和时间增加而提高。在5×106cfu/mL密度下2种弧菌的混合感染组(密度比1∶1)24h幼体死亡率低于对照副溶血弧菌感染组,高于对照溶藻弧菌组。  相似文献   

6.
梁箫  刘钰珠  陈珂  李一峰  杨金龙 《水产学报》2019,43(11):2347-2358
为理解髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)基因的生物学特性以及对细菌胁迫的响应,本研究克隆了厚壳贻贝MyD88基因(命名为McMyD88-4)cDNA全长序列,其全长3 930 bp,开放阅读框2 607 bp,编码868个氨基酸。其中,13~109位的氨基酸序列为死亡结构域(death domain,DD),347~481位的氨基酸序列为TIR(toll/interleukin-1 receptor)结构域,TIR结构域包含3个高度保守的区域Box 1、Box 2和Box3;McMyD88-4蛋白的空间结构包含6个α螺旋(α-helix)和4个β折叠(β-sheet)。同源性分析显示,McMyD88-4蛋白序列与长牡蛎MyD88最相似,其一致性和相似性分别为60%和77%;其次,与虾夷扇贝、海湾扇贝和菲律宾蛤仔相似度较高,其一致性和相似性分别为40%~51%和58%~67%。系统进化树结果显示,McMyD88-4先与长牡蛎和扇贝聚为一支,然后与黑腹果蝇聚为一支,脊椎动物单独聚为一支。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现,McMyD88-4基因在厚壳贻贝各组织和器官中均有表达,其中在外套膜和鳃中的表达量最高,而血细胞中表达量最低。厚壳贻贝经沙氏弧菌感染后,McMyD88-4基因表达量在免疫相关组织中急剧上升,分别在感染后3和6 h达到峰值,且在消化腺中的上调水平显著高于鳃和外套膜。研究表明,McMyD88-4在厚壳贻贝抵御外界病原体侵染过程中,尤其是弧菌感染方面发挥重要作用。  相似文献   

7.
蛋白酶抑制因子是极其多样的蛋白质或多肽,能抑制蛋白酶的水解活性。研究发现蛋白酶抑制因子能通过抑制病原蛋白酶活性,从而抑制病原的入侵。I84蛋白酶抑制因子家族是MEROPS数据库中新增的一个家族,其部分成员在免疫防御过程中的作用得到了一定的揭示。为探究I84蛋白酶抑制因子家族在长牡蛎中的分布和功能状况,实验鉴定了长牡蛎中23个潜在的I84家族基因,根据系统进化树分析,挑选了5个同源基因进行时空表达和功能分析。首先,利用克隆技术验证了长牡蛎中5个I84家族同源基因CgSi3、CgSi5、CgSi6、CgSi16和CgSi19可表达性。结果显示,5个基因在外套膜、闭壳肌、性腺、血淋巴细胞、肝胰腺和鳃等6个组织中均表达,但肝胰腺中表达量显著高于其他组织。同时,5个基因在长牡蛎幼体不同发育阶段表达模式不同,其中各基因在受精卵时期均不表达,CgSi3表达量则在眼点幼虫期显著上升后下降,而CgSi6在壳顶幼虫期开始表达后,表达量随长牡蛎发育而持续增加。另外,对牡蛎进行病原相关模式分子(PAMPs)注射后,5个基因也表现出不同的表达模式,其中LPS和PGN注射后CgSi6表达量变化明显,而poly (...  相似文献   

8.
参照GenBank上登录的弧菌鞭毛蛋白flaB基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaB全长基因,序列分析结果显示该基因为1134bp,编码377个氨基酸。与GenBank中其它弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaB基因与副溶血弧菌flaB基因的同源性最高(92%)。将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出带His-tag的融合蛋白,分子量大小与预期一致。优化的表达条件为28℃,0.4mmol/LIPTG浓度诱导10h。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,制备了多克隆抗体。Western-blotting结果表明鼠抗FlaB血清不仅能与诱导后的重组蛋白发生反应,而且能与天然的溶藻弧菌全菌蛋白发生反应,提示鞭毛蛋白FlaB可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一,为下一步进行FlaB蛋白免疫原性的研究以及疫苗的制备奠定了基础。  相似文献   

9.
为研究溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护作用,实验构建了重组真核表达质粒pcDNA-flaC并将该质粒肌肉注射红笛鲷,采用PCR、RT-PCR、ELISA和攻毒试验等方法检测了该真核表达质粒在红笛鲷组织内的分布、表达和对红笛鲷的免疫保护.PCR结果显示,免疫接种7和28 d,注射点周围肌肉、鳃、肾脏、肝脏和脾脏都存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种后第7天、14天和28天,红笛鲷不同组织内均有目的基因表达.ELISA结果表明,鱼血清内产生了抗FlaC蛋白的抗体,表明DNA疫苗免疫后鱼体表达了目的蛋白,并诱导产生了相应抗体.攻毒实验表明,免疫后的红笛鲷能较好地抵抗致病性溶藻弧菌的感染.结果表明,质粒pcDNA-flaC可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效的疫苗候选物.  相似文献   

10.
为了有效防治细菌及其他病原微生物对魁蚶等贝类的危害,本实验研究了魁蚶各组织中溶菌酶活性对鳗弧菌侵染的响应过程,以期探讨魁蚶体内溶菌酶的免疫功能。本实验采用注射活菌的方法侵染20月龄魁蚶个体,随机选取16只个体,在每只个体的斧足处注射1 mL(约1×10~9个)鳗弧菌菌悬液作为感染组;随机选取16只个体不注射鳗弧菌作为对照组。两组魁蚶分别于洁净海水中暂养4、12、24和48 h后,每组随机取4只魁蚶个体的血液、外套膜、鳃、斧足、肝胰腺和闭壳肌等组织,采用ELISA试剂盒测定其溶菌酶含量变化。结果显示,对于鳗弧菌的侵入,魁蚶血液中溶菌酶含量由正常低值迅速增高并一直维持较高的含量,说明血液是魁蚶机体防御病原菌的主要免疫组织之一;魁蚶外套膜在无感染的情况下,对外界水环境的干扰始终保持较高的溶菌酶含量;鳃、斧足的溶菌酶含量均在注射细菌24 h之后明显高于正常值,说明外套膜、鳃、斧足作为魁蚶机体与外界接触的第一道屏障也能应对病原菌入侵,但反应较血液延迟;肝胰腺和闭壳肌的溶菌酶含量变化不明显,推测肝胰腺和闭壳肌不是魁蚶的重要免疫组织或器官。本实验结果可为魁蚶抗病选育及免疫机理方面的研究提供相关的参数。  相似文献   

11.
缢蛏ScHsc70 cDNA的分子特性和表达分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
从缢蛏(Sinonovacula constricta Lamarck)cDNA文库中筛选出一条热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)同源序列,采用EST扩增和5′RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增方法获得全长cDNA序列,共2 335 bp,包括76 bp的5′非翻译区和309 bp的3′非翻译区,以及1 950 bp的开放阅读框。阅读框共编码649个氨基酸,推算的分子量约为70.89 kD,理论等电点为5.28。氨基酸序列分析结果表明,该基因的氨基酸序列含有HSP70家族的3个签名序列,2个糖基化位点,1个ATP-GTP结合位点,且C末端具有GGXP四肽重复序列以及细胞质特异性调控基序EEVD。该基因是组成型HSC70(Heat shock cognate 70)亚家族基因成员,被命名为ScHsc70。基于氨基酸序列的双壳贝类聚类分析表明,缢蛏与南极帽贝(Laternula elliptica)、文蛤(Meretrix meretrix)的亲缘关系最近。荧光定量表达分析显示,ScHsc70 mRNA在缢蛏水管、鳃、斧足、外套膜、肝和性腺等组织中以不同水平存在,其中在外套膜中的表达量最低,而在水管和肝中的表达量最高。经副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和副鳗弧菌(V.anguillarum)诱导后,ScHsc70 mRNA在缢蛏肝中的水平呈现先升高后下降的变化趋势,且分别在感染后的第20小时和第30小时达到最高。结果提示,缢蛏ScHsc70基因可能参与了对细菌感染的防御反应。  相似文献   

12.
采用改良的微孔板法研究静置培养条件下致病性溶藻弧菌ND-01在酶标板上成膜情况。结果显示,溶藻弧菌的生物膜的OD590在16h达到峰值后,随培养时间延长出现下降;在102~108cfu/mL范围内,不同的初始菌密度对生物膜的OD590影响并不显著;NaCl质量分数为4.5%时,所形成生物膜的OD590最高;30℃,溶藻弧菌的生物膜OD590显著高于其他温度组(P0.05);在胰蛋白胨大豆肉汤培养液中加入质量分数1.5%的CaCl2,能够显著促进生物膜形成,而加入MgCl2对于生物膜的影响则不显著;经过大黄鱼表皮黏液包被后,96孔板中生物膜的OD590显著高于其他部位组织提取液包被组(P0.01)。致病性溶藻弧菌ND-01能够在聚苯乙烯材料的96孔酶标板表面形成稳定而明显的生物膜,且其生物膜的形成与多种环境因素有着密切关系。  相似文献   

13.
14.
合浦珠母贝热休克蛋白hsp70基因的克隆与表达分析   总被引:10,自引:2,他引:8       下载免费PDF全文
采用同源克隆和RT-PCR技术对合浦珠母贝(Pinctada fucata)热休克蛋白hsp70基因进行了克隆和表达分析。获得cDNA全长序列2 365 bp,其中3’非编码区域(UTR)为318 bp,5’UTR为88 bp,开放阅读框(ORF)为1 959 bp,编码652个氨基酸,分子量约为71.39 kD,理论等电点为5.22,并含有3个HSP70家族的签名序列IDLGTTYS、DLGGGTFD和EEVD。同源性分析表明,合浦珠母贝HSP70的氨基酸序列与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)等双壳贝类的相似性高达86%以上,基于氨基酸序列的聚类分析表明,合浦珠母贝与牡蛎属种类亲缘关系最近。高温、高盐刺激后,半定量RT-PCR检测发现hsp70基因的表达明显增加,高温刺激的表达量高于高盐刺激,高温刺激组不同组织的表达量由大到小依次为鳃、消化腺、外套膜、肌肉、性腺,高盐刺激组不同组织的表达量由大到小依次为鳃、外套膜、肌肉、消化腺、性腺,表明HSP70参与了机体对刺激的应答过程。该基因的克隆为进一步深入研究合浦珠母贝的抗逆机理及其遗传改良奠定了重要基础。  相似文献   

15.
为了解长牡蛎MITF基因的表达及其与壳色的关联,验证了长牡蛎中的4个MITF基因,对长牡蛎MITF氨基酸序列进行了序列分析和多序列比对,分析了长牡蛎幼体发育各时期的转录组,采用荧光定量PCR的方法研究长牡蛎各组织及黑壳、白壳牡蛎特定部位mRNA表达情况。4个MITF基因中有3个基因可能为假基因,有表达的长牡蛎MITF基因共编码448个氨基酸,为亲水性不稳定蛋白,含有N端结构域(MITFTFEBC3N superfamily)和高度保守的功能性结构域HLH结构域。转录组分析发现MITF在长牡蛎个体发育的各个时期均有表达,在稚贝期达到最高。组织表达结果显示MITF在外套膜中的表达水平显著高于其他组织。MITF在黑壳牡蛎闭壳肌中的表达量显著低于白壳牡蛎,而在黑壳牡蛎外套膜中的表达量高于白壳牡蛎,但不显著。在黑壳、白壳牡蛎外套膜边缘的表达量都显著高于内侧。研究表明,长牡蛎MITF基因可能在牡蛎壳形成早期就参与了黑色素的生成调控和个体的生长发育,可调控牡蛎酪氨酸酶Tyr2基因,参与外套膜和贝壳中黑色素的形成。本研究为进一步研究牡蛎壳色形成机制奠定了基础。  相似文献   

16.
17.
Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是一种古老的先天性免疫受体,参与病原体相关分子模式识别,对维持免疫稳态和预防感染至关重要。本研究克隆和鉴定了卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus) TLR13基因(命名为ToTLR13),其开放阅读框(ORF)为1 269 bp,编码422个氨基酸,等电点为8.13。保守结构域分析显示,ToTLR13含有跨膜结构域(TM)、LRR结构域和TIR结构域,符合TLR家族的典型特征。通过建立TLR13保守域三级结构发现,ToTLR13与小鼠(Mus musculus)和大黄鱼(Larimichthys crocea) TLR13功能结构域的蛋白三级结构具有较高重叠性。多序列比对显示,ToTLR13与其他硬骨鱼TLR13具有较高的相似性,与其他纲物种的序列相似性较低。系统进化树结果显示,ToTLR13与硬骨鱼TLR13聚在一起,其中与鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)最为接近,与哺乳动物、两栖类和贝类相分离。实时荧光定量PCR (Real-time fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)分析显示,ToTLR13在健康卵形鲳鲹的心、鳃、肾、头肾、肝、脾、脑和肌肉中普遍表达,其中鳃的表达量最高,其次是脾。ToTLR13在其鳃、脾、肝和肾免疫相关组织中的表达情况呈现出不同程度的上调,提示其经无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)免疫刺激后可能激活了炎症反应,启动了先天性免疫反应。亚细胞定位显示,ToTLR13定位于A549细胞质。本研究表明,ToTLR13在抵御病原菌免疫应答过程中可能发挥重要的作用,研究结果可为阐明脊椎动物TLRs的功能进化史提供基础资料。  相似文献   

18.
This study investigated potential application of lactic acid bacteria (LAB) in depuration for reducing Vibrio parahaemolyticus in oysters. Lactobacillus plantarum ATCC 8014, which exhibited strong bactericidal effects against V. parahaemolyticus in vitro, was added to artificial seawater for depuration of Pacific oysters (Crassostrea gigas) inoculated with V. parahaemolyticus BE 98-2029 (O3:K6) to levels of about 104 MPN/g at 15 ± 1 and 10 ± 1°C. Application of L. plantarum ATCC 8014 treatment (107 CFU/mL) in oyster depuration did not enhance reductions of V. parahaemolyticus in oysters depurated at 15 ± 1°C but significantly decreased (p < 0.05) levels of V. parahaemolyticus in oysters depurated at 10 ± 1°C after 5 days (3.40 log reductions) when compared with controls (2.75 log reductions). It is not clear if a competitive exclusion by LABs to compete with V. parahaemolyticus binding sites in oyster tissues plays a role in the reduction of V. parahaemolyticus in the oysters. Further studies utilizing different types of LABs in oyster depuration might provide additional knowledge for application of LAB in depuration for decontaminating V. parahaemolyticus in oysters.  相似文献   

19.
用溶藻弧菌诱导后,收集耳鲍血淋巴,利用微量测定法进行抗菌活性分析.结果发现,耳鲍血淋巴具有抗革兰氏阴性菌-溶藻弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌的活性,对革兰氏阳性菌的抑制活性较低.利用胰蛋白酶对耳鲍血淋巴水解后,其抗菌活性消失,表明其中抗菌成分为蛋白质.将耳鲍血淋巴在不同温度(37~95 ℃)和不同pH(2.5~5.0)下保温,发现其抗菌活性成分对热及酸耐受性较强.耳鲍血淋巴在低浓度无溶血活性.该抗菌组分在耳鲍的免疫防御中具有一定的作用.  相似文献   

20.
Marteilia sydneyi is the causative agent of QX disease in Sydney rock oyster, Saccostrea glomerata . It is responsible for disease outbreaks among oysters that occur during summer and can result in up to 95% mortality. QX disease has significantly decreased S. glomerata production in some areas of Australia's eastern seaboard over the past 30 years. Marteilia sydneyi sporulates in the digestive gland of oysters leading to complete disorganization of the infected tissues. The current study used proteomics to identify potential molecular markers of sporulating M. sydneyi infection during a field trial undertaken in the Georges River, Sydney, between December 2006 and May 2007. Early stages of M. sydneyi infection were detected by polymerase chain reaction, whilst cytological examination was used to identify sporulating M. sydneyi in the gut. Protein expression in oyster haemolymph was assessed during the M. sydneyi infection period by two dimensional electrophoresis. Proteome maps identified significant differences in the expression of four proteins in oysters with sporulating M. sydneyi infections.  相似文献   

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