主养草鱼池塘底泥微生物群落多样性研究

为研究主养草鱼池塘底泥微生物多样性,采用细菌通用引物27F和1492R扩增了湖北石首一草鱼(Ctenopharyngodon idellus)养殖池塘底泥细菌16S rDNA片段,构建了底泥细菌16S rDNA克隆文库,并对该文库中的微生物群落进行了分析.结果显示,该文库的Shannon多样性指数(H′)为3.85,S...     

16S rRNA在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中的应用

16SrRNA序列分析作为微生物系统分类的主要依据已得到了广泛认同，随着微生物核糖体RNA数据库的日臻完善，该技术成为细菌分类和鉴定的一个有力工具。本文总结了16SrRNA作为海洋微生物系统分子分类鉴定的理论基础和具体方法，分析了用16SrRNA研究海洋微生物的进化关系，并且对16SrRNA在海洋微生物分子检测中的应用作一评述。     

养殖大黄鱼低温弧菌病病原的研究

浙江沿海深水网箱养殖大黄鱼冬天发生大量死亡，从病鱼体内分离出致病力较强的细菌GYC0227。人工感染试验证实这株菌为大黄鱼的病原菌。对细菌进行了形态、生理生化特性的测定，并进行了16S rRNA分子鉴定。PCR扩增获得了GYC0227菌株大小约1．5kb的16S rDNA部分基因片段，产物经回收纯化，克隆到pMD18-T载体，转化大肠杆菌TG1，对阳性克隆子进行酶切及PCR鉴定，并测序，将测定的序列递交NCBI进行BLAET同源序列比对，与溶藻弧菌的标准菌株的16S rDNA具有96％的同源性。结合菌株的生理生化特性，GYCD227菌株属于溶藻弧菌。该菌适应于低温生长，生长温度范围为7—25℃，并测定了其对14种药物的敏感性。     

象山港南沙岛不同养殖模式沉积物微生物群落结构分析

通过构建16S rDNA克隆文库对象山港南沙岛不同养殖模式(贝类养殖、藻类养殖及网箱养殖)表层沉积物微生物多样性和群落结构特征进行了比较和分析,共获取136个OUT。其中,贝类养殖区、藻类养殖区和网箱养殖区OTU分别为58、48和57个。各站位OTU分布差异明显,表现出高度的多样性。基于16S rDNA序列的生物多样性和丰富度分析表明,网箱养殖区丰富度指数ACE为739,香浓指数H?为3.8,均为最高值,丰富度指数Chao为245,略低于于贝类养殖区。贝类养殖区丰富度指数Chao为303,在各养殖区中最高。藻类养殖区丰富度指数ACE为174、Chao为89,香浓指数H?为3.6,均为最低值。系统发育分析表明,南沙岛各养殖区的优势种群均为变形菌门(Proteobacteria),但是藻类养殖区微生物群落结构与其他养殖区域相比,16S rDNA克隆文库差异显著,其中根瘤菌属(Rhizobium)及其他光合细菌在藻类养殖区分布较多。网箱养殖区沉积物表层微生物群落中出现了与环境污染密切相关的菌群,如志贺氏菌属(Shigella)、埃希氏菌属(Escherichia)和ε-变形菌纲的微生物种群,揭示网箱养殖对底质沉积物环境的影响较大。     

四种鲍45S rDNA在染色体上的比较定位

为了研究皱纹盘鲍、西氏鲍、绿鲍和杂色鲍等4种鲍的核型特征,实验利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术比较定位了上述4种鲍的45S rDNA位点。皱纹盘鲍中约83%的中期细胞均检出2对45S rDNA位点,分别位于13号和16号染色体的长臂端部。西氏鲍中约75%的中期细胞均检出3对45S rDNA位点,分别位于6号染色体短臂端部、14号和17号染色体长臂端部。绿鲍中约85%的中期细胞均检出3对45S rDNA位点,分别位于4号、6号和8号染色体长臂的端部。杂色鲍中约65%的中期细胞均检出3对45S r DNA,位点,分别位于3号、4号和12号染色体短臂的端部。此外,4种鲍均有少数中期相的45S rDNA位点数高于众数,这提示,除了明确的45S rDNA位点外,4种鲍可能均有若干个不稳定的45S rDNA位点。实验结果丰富了鲍细胞遗传学研究资料,同时为鲍的遗传育种研究提供了基础数据。     

核糖体DNA在厦门白姑鱼和大黄鱼染色体上的比较定位

为了探究石首鱼核型微观结构上的变化,实验利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)比较定位了厦门白姑鱼和大黄鱼18S rDNA和5S rDNA的分布特征。结果表明,厦门白姑鱼与大黄鱼在宏观核型以及18S rDNA和5S rDNA染色体分布等3个方面均存在较大差异。厦门白姑鱼的核型公式为2n=48t,臂数FN=48;单对18S rDNA信号分布于1号染色体臂间;单对5S rDNA信号分布于3号染色体近着丝粒区域。大黄鱼的核型公式为2n=2sm+4st+42t,臂数FN=50;单对18S rDNA信号分布于18号染色体短臂端部;5S rDNA信号9~11对,除一对分布于臂间外,其余全部分布于着丝粒端或短臂端部。综合其他石首鱼核型数据可以推断:厦门白姑鱼呈现原始核型特征,而大黄鱼核型是原始核型经染色体重排和/或转座衍生的特化核型;石首鱼宏观核型和18S rDNA分布模式总体保守,仅少数物种存在变化,而5S rDNA位点的分布模式存在高度的种间变化。本研究首次揭示了石首鱼物种间核型微观结构的变化,为进一步开展石首鱼分子细胞遗传学研究奠定了基础。     

基于多个线粒体序列的中韩俄沿海不同地理群体刺参的遗传多样性及种群结构分析

为评价不同海域不同体色特征刺参群体的遗传结构，本研究采用PCR技术扩增了中国、韩国和俄罗斯沿海8个刺参(Apostichopus japonicus)群体的16S rDNA、COⅠ和D-loop序列。根据所获得的16S rDNA、COⅠ和D-loop序列分析这8个群体的遗传多样性和遗传进化关系。结果显示，16S rDNA、COⅠ和D-loop序列长度分别为543 bp、656 bp和509~527 bp。16S rDNA序列中共检测到16个多态位点，16种单倍型，单倍型多样性指数为0.629，核苷酸多样性指数为0.0016，平均核苷酸差异数0.880。COⅠ序列共检测到62个多态位点，38种单倍型，单倍型多样性指数为0.958，核苷酸多样性指数为0.0073，平均核苷酸差异数为4.796。D-loop序列共检测到200个多态位点，61种单倍型，单倍型多样性指数为0.922，核苷酸多样性指数为0.0157，平均核苷酸差异数为6.834。3个线粒体片段对于不同群体的遗传多样性检测结果显示，D-loop和COⅠ序列的多态位点数、单倍型数和核苷酸多样性均显著高于16S rDNA序列，更适用于同一物种不同群体遗传结构的解析。韩国浦项地区3个群体遗传多样性最高，这可能与其所处地理位置洋流影响有关。利用COⅠ基因对采自浦项的3种体色刺参进行遗传分化分析，遗传分化系数Fst<0.05，不存在遗传分化。对所采集的群体构建的系统进化树结果显示，青岛海参群体与烟台海参群体聚为一支，再与韩国群山黑参群体聚为一支，然后与韩国木浦黑参群体聚在一起，向外依次为俄罗斯群体及韩国浦项的3个群体，不同种群的遗传结构受洋流影响最大，其次跟其地理分布有关。     

应用RFLP和DGGE技术分析工厂化养殖凡纳滨对虾肠道微生物群落特征

本研究应用PCR-RFLP(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)和PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术,对工厂化养殖的凡纳滨对虾肠道菌群进行多样性分析。RFLP结果显示,8月样品中不同的克隆子为5个,其中以不可培养细菌(Unculturable bacteria)为主要优势菌,其次为鲁杰氏菌属菌种Ruegeria spp.和Rhodobacterales spp.。依据微生物多样性的覆盖率分析结果表明,所构建16S rDNA克隆文库的覆盖率为97.5%。10月样品中克隆子为8个,其中以不可培养细菌、芽孢杆菌属Bacillus spp.和弧菌属Vibrio spp.为主要优势菌属,其次为Photobacterium spp.和Neptunomonas spp.;所构建16S rDNA克隆文库的覆盖率为90.8%。应用DGGE分析8月和10月对虾肠道样品,菌群以不可培养细菌和弧菌属为主,其次为Streptomyces spp.、Ruegeria spp.、Enterococcus spp.和Photobacterium damselae。     

PCR扩增特异性16SrDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌

根据已发表的气单胞菌16S rDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列，设计了2对引物，建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测，发现16S rDNA引物具有高度的特异性，仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97．2％，且具有高度的敏感性，可检测最低1fg的模板。将16S rDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94．4％。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径，是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。     

中华绒螯蟹精子线粒体的检测

以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)肌肉、鳃和精巢为对照,从线粒体标志酶SDH活性、线粒体特异性荧光探针(Rh123)以及线粒体16S rDNA PCR扩增3个途径,探讨了该蟹精子线粒体的存在状况。研究发现,肌肉和鳃SDH酶活性较高,精巢SDH酶活性显著低于肌肉和鳃,而精子SDH酶活性则无法检测到。使用Rh123检测发现,精巢中有较强的荧光,而精子中则无法观察到。通过GenBank中的中华绒螯蟹线粒体16S rDNA序列设计引物,利用PCR扩增方法,以beta-actin做内参,检测了中华绒螯蟹肌肉、鳃、精巢和精子中线粒体16S rDNA扩增情况,发现各组织或细胞beta-actin扩增片段大小、条带宽度和亮度基本一致,表明各模板DNA量基本一致;而在同一DNA浓度下,16S rDNA的扩增片段长度虽一致,但其产物量存在明显差异,精子16S rDNA产物量显著低于其他3种组织,其条带宽度和亮度很弱;16S rD-NA扩增产物经测序分析及比对证明与已有序列完全吻合。上述结果表明,中华绒螯蟹精子中存在线粒体,但其线粒体的数量极显著低于精巢和其他组织,这也是利用灵敏度较低的SDH酶活性和Rh123探针以及常规的组织学和超微结构观察法难以检测到其精子线粒体的原因。[中国水产科学,2007,14(1):139-143]