传染性造血器官坏死病毒新疆株的分离与鉴定

在新疆维吾尔自治区某养殖场取患病虹鳟Oncorhynchus mykiss组织样本,进行传染性造血器官坏死病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)分离鉴定、电镜观察、回归感染及遗传进化分析研究。细胞培养结果显示:患病虹鳟组织样本能够感染鲤Cyprinus carpio上皮细胞(carp epithelial cell,EPC)产生典型细胞病变(cytopathic effect,CPE),收集病毒悬液命名为XJ-13。滴度测定实验表明:该病毒为10~(6.15)TCID_(50)/m L。回归感染实验表明:该分离株在浓度为10~5PFU/尾的剂量使体质量5g的虹鳟死亡率达87.5%。通过透射电镜观察发现患病虹鳟组织悬液感染的EPC细胞内存在大量的子弹状病毒粒子,PCR鉴定结果表明该病毒为IHNV。XJ-13的糖蛋白氨基酸序列的聚类分析结果显示,该病毒株与我国IHNV-Sn1203株具有最高的同源性(99%),与美国参考株WRAC的同源性为94.6%。结果表明:IHNV XJ-13是造成该养殖场虹鳟大量死亡的病原。     

一株鲤春病毒血症病毒的初步分离及鉴定

为了检测上海市某鲤鱼养殖场的疑似患病鲤鱼是否携带鲤春病毒血症病毒(SVCV),采用鲤鱼表皮瘤细胞系(EPC)进行病毒分离和分子PCR方法对SVCV的糖蛋白基因保守区域进行扩增。试验结果:被病毒感染的EPC细胞呈现细胞圆缩、颗粒增多、大量脱落等病变特征,且该株病毒毒力较强,其病毒滴度TCID50/0.1 mL为105.76。分子方法扩增出714 bp和606 bp的SVCV的保守片段。试验采用细胞培养技术和分子PCR方法检测样品是否携带病毒性病原,建立了一种较为简捷高效的检测方法。该方法适合在短时间内完成大量样品的病原学诊断及检疫任务,具有良好的应用前景。     

上海地区2013—2018年鲤春病毒血症病毒的分离和进化特征分析

为了解上海市近年来鲤春病毒血症病毒(SVCV)的流行情况,探明上海市SVCV变异进化规律,对上海地区2013—2018年送检的养殖鲤(Cyprinus carpio)、锦鲤(Cyprinus carpio koi)、金鱼(Carassius auratus)等鲤科鱼类样品中的SVCV进行了病毒分离、鉴定和基因序列进化分析。结果显示: 上海地区近6年来每年均有SVCV检出,从125份样本中共分离获得了18株SVCV毒株,阳性率为14.4%。各毒株接种草鱼卵巢细胞(grass carp ovary, CO)后均可以导致明显的细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)。免疫荧光实验也表明,病毒结构蛋白N、P、M和G均在感染细胞中高水平表达。进一步通过巢式PCR扩增和序列测定,获得了18株分离株G基因606bp的核酸序列。进化分析显示,上海地区的SVCV分离株均隶属于Ia分支,株间核酸序列同源性较高,但不同分离株之间核酸序列也呈现出一定程度的差异。其中2015年之后的分离株均聚类为同一小分支,提示其从同一祖先进化而来。实验结果显示,SVCV在上海地区持续以低水平流行并在不断进化。研究提示,养殖户应改变传统的养殖模式,提高防病意识和管理水平,相关部门也需要加强持续监测,以减少和控制鲤春病毒血症(SVC)的发生和流行。     

一株鲈鲤源鲤春病毒血症病毒的分离鉴定及其病理观察

2016年4月,四川某鲈鲤(Percocypris pingi)养殖场流行一种以鳃、鱼鳔和内脏器官出血为临床特征的传染病。组织病理学观察发现,患病鲈鲤全身多组织器官均发生明显的病理损伤,尤其是肝、脾、肾、鳃和肠表现为明显的出血、变性、坏死以及炎症细胞浸润。取病鱼组织匀浆滤液接种鲤上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprini, EPC),盲传3代出现典型的细胞病变(cytopathic effects, CPE)。将自然发病鱼组织匀浆滤液和细胞培养病毒液分别接种健康鲈鲤,实验鱼出现与自然发病鱼相同的症状,死亡率分别为60%和50%,而对照组未见异常。对经分离毒株ZLP160415感染出现CPE的EPC细胞制备超薄切片进行电镜观察,发现病毒呈弹状,长90～150 nm,宽40～60 nm;对自然发病鱼、人工感染发病鱼内脏组织和细胞培养病毒液进行鲤春病毒血症病毒(springviremiaofcarpvirus,SVCV)的RT-PCR检测,均扩增出目的条带。基于SVCV糖蛋白基因进行系统发育分析,结果显示分离毒株(ZLP160415)属于Ia型。结合本次疾病的流行病学与病理损伤特点、病毒分离鉴定、人工感染试验结果和透射电镜检查,确定此次流行病的病原为SVCV。     

一株传染性造血器官坏死病病毒的致病性研究

为了对分离于山东某虹鳟养殖场的一株传染性造血器官坏死病毒株(IHNV-Sn1203)进行致病性检测与研究,将该IHNV-Sn1203毒株进行虹鳟鱼苗人工回接感染实验。结果显示,8d内人工感染实验鱼累计死亡率高达100%。收集大批濒死的病鱼样本,制备病理组织切片;利用鲤上皮细胞(EPC)进行细胞感染实验、病毒电镜观察、空斑实验、病毒滴度检测和聚类分析。病理组织切片显示,该病毒可造成虹鳟造血器官广泛性坏死;细胞感染实验结果显示,接种24 h后EPC细胞出现葡萄串状典型细胞病变(cytopathic effect,CPE),72 h后大部分细胞崩解脱落形成网状孔洞;电镜下清晰可见弹状病毒粒子大量存在于细胞质内,其在EPC细胞上的滴度为108.36TCID50/mL,并能形成2~4 mm空斑。对病毒核蛋白氨基酸序列的聚类分析结果显示,该病毒与标准毒株RB-1和WRAC的同源性分别为97%和93%,与国内报道的zyx株具有最高的同源性(99%)。研究表明,IHNV-Sn1203毒株能够在鱼体及敏感细胞中稳定繁殖,产生典型病变,具有较高的病毒滴度,对虹鳟鱼苗有很高的感染性和致死性。     

一株鳢科鱼源弹状病毒的分离及鉴定

为研究近来鳢科鱼类疫病频发的病因,实验对采集的患病杂交鳢病料分别从细菌学和病毒学两方面进行病原分离和鉴定。排除细菌感染的可能后,通过细胞培养技术、回归感染实验、电镜技术、分子生物学技术等进行病毒学分析,最终分离到一株弹状病毒,命名为HSHRV-C1207(Hybrid Snakehead Rhabdovirus-C1207)。实验结果显示,该病毒在EPC、FHM、GSB、SFC、CIK等 8种细胞中都能复制,并对其中6种细胞产生明显的细胞病变效应(CPE)。用分离的病毒进行回归感染实验,可使感染的杂交鳢复制出自然发病鱼的相同症状,且死亡率达90%。感染病料组织液的EPC细胞固定后经电镜观察,发现细胞质内有大量子弹状病毒聚集,直径约60 nm,长度约为160 nm,形态和排列方式与已报道的鱼类弹状病毒相似。参考OIE中传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)的检测引物及根据乌鳢弹状病毒(SHRV)、鳜鱼弹状病毒(SCRV)、比目鱼弹状病毒(HIRRV)的G蛋白基因设计特异性引物,分别对自然发病病料组织、接种病料组织的细胞进行RT-PCR扩增,仅针对SCRV的引物能扩增出大小约350 bp 的片段。对HSHRV-C1207株的G基因进行序列测定和分析,结果表明其核苷酸序列同SCRV和SHRV的同源性分别为93.8% 和 20.4%,推导的氨基酸序列同源性分别是93.7%和18.3%。用G基因推导氨基酸序列与其它弹状病毒的G蛋白进行系统进化树分析,表明该毒株与水泡性病毒属聚为一支,其中与SCRV的亲缘关系最近,而与属于诺拉弹状病毒属的SHRV相距甚远,可能为SCRV的变异株或一个新的毒株。     

东北地区不同宿主NDV的分离鉴定与系统发育进化分析

针对我国东北地区获得高免新城疫(NewcastleDisease,ND)抗体鸡群仍然发生新城疫(ND)的情况,应用分子流行病学技术,对所分离的18株鸡源新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)和1株鸽源NDV进行系统发育进化分析。将NDV分离株通过差速离心纯化,以SDS-蛋白酶K(或Trizol法)提取病毒RNA,RT-PCR扩增其融合蛋白(F)基因532bp或280bp关键片断,经回收克隆到pMD18-T载体上进行核苷酸序列测定(GenBank序列号:AY208680-AY208698)。核苷酸和氨基酸序列进行同源性比较,结果表明各毒株之间核苷酸同源性为83.1%～100%,氨基酸同源性为85.5%～100%;系统发育进化树分析显示,其中JL-12、HLJ-3为弱毒株,与疫苗株V4同属于基因Ⅰ型;其余17株均为强毒株,其中HLJ-4、JL-14为Ⅵ型,其余15株均为基因Ⅶ型,由此可见东北地区目前新城疫的流行是由3种不同基因型的NDV毒珠(Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型)所发,但以基因Ⅶ型为主,这与我国其他地区和世界上其他国家ND的流行情况趋于一致。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白的截短表达及其免疫原性分析

为了揭示鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)糖蛋白编码基因的主要免疫原性决定区域,本研究对SVCV的糖蛋白基因进行截短表达,并用纯化的重组蛋白作为免疫原制备了兔抗血清以分析其免疫原性。通过SOSUI以及DNAStar 6.0软件对SVCV糖蛋白基因的跨膜区、亲水性以及抗原表位进行分析后,采用RT-PCR对该基因主要抗原决定区域编码片段进行扩增,并构建重组表达质粒p GEX-Gtr,对其进行诱导表达后获得截短的SVCV糖蛋白的重组蛋白。将表达的重组蛋白进行纯化复性后,作为免疫原制备兔抗血清,采用ELISA法检测其效价,采用免疫印迹以及间接免疫荧光技术检测该重组蛋白的免疫原性。研究结果显示,截短表达的糖蛋白编码基因长1317 bp,编码439个氨基酸(29~467),推测分子量为49.6 k D。利用该重组蛋白制备的兔抗血清,其与重组蛋白的反应效价为1∶64000,。免疫印迹及间接免疫荧光结果显示,该兔抗血清与SVCV-HN株能发生特异性反应,表明该重组蛋白与天然的病毒表面糖蛋白的免疫原性无差异。上述研究结果表明,截短表达的重组蛋白具有很好的免疫原性,可应用于免疫诊断技术研发与基因工程疫苗的研制。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据Gen Bank中鲤春病毒血症病毒(SVCV)糖蛋白全基因序列设计特异性引物,以SVCV欧洲株病毒核酸为模板,通过RT-PCR方法获得欧洲株SVCV-G基因,克隆至p PICZαA,构建p PICZαASVCV1540表达质粒。以限制性内切酶Sac I线性化p PICZαASVCV1540后通过化学法转化毕赤酵母感受态细胞X33和GS115,添加1%甲醇进行诱导表达,SDS-PAGE电泳分析表达产物显示其分子质量为70 ku。Western Blot分析显示该蛋白可以被SVCV山羊多抗识别,表明目的蛋白具有反应原性。     

新城疫病毒分离株融合蛋白基因的遗传变异分析

根据GenBank中报道的NDV融合蛋白基因(F)序列,设计了一对特异性引物,用该引物对所分离的LN-SN株进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-F,用于核苷酸序列测定。结果该基因ORF长1662bp,编码553个氨基酸;将LN-SN毒株与GenBank中已报道的NDV毒株进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在83.1%～98.9%之间,推导的F蛋白氨基酸序列的同源性在88.1%～99.5%之间。     

First detection of spring viraemia of carp virus in common carp (Cyprinus carpio L.) affected by a septicaemic disease in Mexico

Spring viraemia of carp (SVC) is an infectious disease responsible for severe economic losses for various cyprinid species, particularly common carp (Cyprinus carpio carpio). The causative agent is the SVC virus (SVCV), a member of the Sprivivirus genus, Rhabdoviridae family, and a List 1 pathogen notifiable by the World Organization for Animal Health. This study describes the diagnosis of an SVCV pathogen isolated in October 2015 from wild common carp inhabiting a natural lagoon in central Mexico. While neither an epidemic nor fish mortalities were reported, the collected killed specimens exhibited clinical signs of disease (e.g., exopthalmia, moderate abdominal distension and haemorrhaging, as well as internal haemorrhages and adhesions). Histological results of injuries were consistent with the pathology caused by SVCV. This finding was supported by the isolation of a virus in EPC and BF‐2 cells and subsequent RT‐PCR confirmation of SVCV. The phylogenetic analyses of partial SVCV glycoprotein gene sequences classified the isolates into the Ia genogroup. These findings make this the first report of SVCV detection in Mexico, extending the southern geographical range of SVCV within North America. However, since this pathogen was detected in fish inhabiting a natural body of water without tributaries or effluents, it is difficult to estimate the risk of SVCV for other wild/feral cohabitating cyprinid species in the lagoon. The status of this virus is also unknown for other bodies of water within this region.     

微生态制剂对鲤、鲫和草鱼养殖池塘效益的影响

以枯草芽孢杆菌为主的主要用于促进鱼类消化生长的微生态制剂I、多种混合微生物主要用于调节水质的微生态制剂II,或是两者混合使用的方法,比较研究了黑龙江省及辽宁省池塘养殖的鲤（Cyprinus carpio）、鲫（Carassius auratus）和草鱼（Ctenophyargodon idellus）的增重率、饲料系数及药价等效益。结果表明,单种或者混合使用微生态制剂均对池塘养殖鲤及草鱼的增重率、饵料系数及用药价格有一定影响,同时使用两种微生态制剂提高鱼类增重率最显著,辽宁省和黑龙江省分别提高了423.57%和90%;而两省养殖池塘的药价也分别降低了29%和56.25%。微生态制剂I及混合同时使用两种微生态制剂均能显著降低饲料系数,辽宁及黑龙江分别降低0.35及0.05。结果可见,适当使用微生态制剂对辽宁草鱼及黑龙江池塘养鲤效益有较好影响,对减少用药、发展绿色养殖业具极大的推动作用。     

微生态制剂对鲤、鲫和草鱼养殖池塘效益的影响

以枯草芽孢杆菌为主的主要用于促进鱼类消化生长的微生态制剂I、多种混合微生物主要用于调节水质的微生态制剂II,或是两者混合使用的方法,比较研究了黑龙江省及辽宁省池塘养殖的鲤（Cyprinus carpio）、鲫（Carassius auratus）和草鱼（Ctenophyargodon idellus）的增重率、饲料系数...     

鲤、鲢、鳙精子低温短期保存研究

本文对鲤(Cygrinus carpio)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Aristichthys nobilis)精液在2—4℃的短期保存进行了实验研究。筛选出了几种较为理想的稀释保护液配方;确定了精液与稀释液的适宜稀释比例为1:1;研究了抗冻剂二甲亚砜(DMSO)对低温保存条件下精于活力的影响,确定了DMSO的适宜添加浓度为6％左右。鲤精在2—4℃保存10天,活力仍高达70％,少数精子存活时间长达12天;鲢和鳙精子在2—4℃保存7天后活力仍高达60％,达到了生产应用的水平。为水产养殖和鱼类育种研究提供了一种简便易行的精液短期保存技术。     

Seasonal Differences in Growth Performance of Four Strains of Common Carp,Cyprinus carpio in India

To assess strain related differences in growth performance and growth patterns under the same culture environment, four strains of common carp, two each of the scale carp, Cyprinus carpio var. communis (Chinese big-belly carp and long bodied carp) and mirror carp, C. carpio var. specularis (scattered carp and linear carp) were communally stocked in three fertilized earthen ponds of 0.14 ha each at 5,000 fish ha^?1 in the ratio of 1:1:1:1 during an 11-month (February to December) culture cycle. Chinese big-belly carp grew larger than other groups, among which there were no significant differences. Scale carp strains performed relatively better than mirror carp at higher temperatures and then essentially stopped growing as temperatures declined into winter. The strains of mirror carp, on the other hand continued growing well later into the cold season.