龙胆石斑鱼源美人鱼发光杆菌的生物学特性与系统发育学分析

对从1尾病死的观赏用龙胆石斑鱼Epinephelus lanceolatus L.中分离到的细菌，进行了形态特征、理化特性和对抗菌类药物的敏感性等较系统的表观生物学性状鉴定。同时，测定了16S rRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树。结果表明，供试两株纯培养菌（编号：HQ061227-1、HQ061227-2）为发光杆菌属Photobacterium（Beijerinck 1889）的美人鱼发光杆菌美人鱼亚种P.damselae subsp.damselae（Love et al.1982；Smith et al.1991），用HQ061227-1株作为代表菌株的16S rRNA基因序列长度（不包括引物结合区）为1469bp（GenBank登录号：EF635307），与GenBank数据库中美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的同源性在99%。药敏试验结果显示，对供试37种抗菌药物中的青霉素G等4种耐药，对头孢唑啉等32种敏感，对氨苄青霉素低敏。     

异育银鲫病原温和气单胞菌表型及分子鉴定与溶血素基因检测

2008年10月江苏盐城大丰精养异育银鲫（Carassius auratus gibelio) 发生严重疾病，从病鱼肝脏、血液及腹水中分离到优势生长的细菌。对分离做纯培养的4株菌(JY081016-1至JY081016-4)进行形态特征、理化特性等表型生物学性状检验；测定了菌株（JY081016-1）的16S rRNA和gyrB基因序列，分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性，并构建了系统发生树。结果表明分离菌对供试健康异育银鲫有强致病性，菌株（JY081016-1）所扩增的16S rRNA基因序列长度为1448bp（GenBank 登录号：GQ232759），所扩增的gyrB基因序列长度为1177bp（GenBank 登录号：GQ232760），其16S rRNA和gyrB基因序列与GenBank数据库中维氏气单胞菌和维氏气单胞菌温和生物型的16S rRNA和gyrB基因序列相似性均在97%以上；根据分离菌的表型及分子特征，判定分离鉴定的4株菌为温和气单胞菌（Aeromonas sobria）。胞外酶及溶血活性检测表明分离菌均能产生蛋白酶、卵磷脂酶、脂酶，在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血；设计的特异性引物可扩增出溶血素基因。     

锦鲤中琼氏不动杆菌的分离与鉴定

对从病死锦鲤(Cyprinus carpio L.)肝组织中分离的2株菌(编号:HC050630D-1、HC050630D-2)进行了形态特征、理化特性、药物敏感性及对健康鲤鱼的致病作用等方面的检验;测定不HC050630D-1株菌的16S rRNA基因序列,构建了系统发育树.结果表明,2株被检菌为琼氏不动杆菌(Acinetobacter junii),对健康鲤鱼未呈现明显致病作用;所测菌株的16S rRNA基因序列长度1450 bp,在GenBank中登录号为EF669479,该菌株16s rRNA基因序列与GenBank数据库中不动杆菌属细菌的16S rRNA基因序列同源性为99%;药敏试验结果显示对供试的头孢拉啶等21种药物坚现高度敏感或敏感,对头孢他啶等7种呈低度敏感,对青霉素G等9种耐药.     

杀鲑气单胞菌一新亚种的生物学特性及系统发育学分析

从石鲽（Kareius bicoloratus L．）细菌性败血感染症的病鱼（濒死及死亡不久）中分离到相应病原菌，进行形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定及代表菌株DNA中G＋Ct001％的测定。同时，选择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定，测定16S rRNA基因序列、分析相关细菌相应序列的同源性，构建系统发生树。结果表明，分离鉴定的60株菌为杀鲑气单胞菌的一个新亚种（subsp．nov．），定名为杀鲑气单胞菌杀鲽亚种（Aeromonas salmonicida subsp．flounderacia subsp．nov．）。代表菌株HQ010320-1及HQ010320-5的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的杀鲑气单胞菌的同源性在99％和100％。     

鲤嗜水气单胞菌感染症及其病原生物学特性

对一起养殖鲤(Cyprinus carpio)发生的病害进行了发病情况、临床特征、病理变化等方面的检验.以3尾病(死)鲤进行病变组织中的细菌检查及细菌分离,对分离菌进行了形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定;同时选择代表菌株进行了16S rRNA基因的分子鉴定,测定了16S rRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树.结果表明,分离菌为气单胞菌属(Aeromonas Kluyver and Van Niel 1936)的嗜水气单胞菌[A.hydrophila(Chester 1901)stanier 1943],代表菌株(HC060718-1株)16S rRNA基因序列长度(不包括引物结合区)为1 454 bp(GenBank登录号:EF669478).择代表菌株做对健康鲤的人工感染试验,表明了分离鉴定的嗜水气单胞菌在被检鲤病例的相应原发病原学意义及较强的致病作用.药敏试验结果显示,对供试37种抗菌药物中的头孢噻肟等23种药物高度敏感,对氨苄青霉素等5种药物敏感,对青霉素G等9种药物耐药.     

红鳍东方皮肤溃烂病病原菌的分离与鉴定

从体表溃烂的养殖红鳍东方鲀(Fugu obscurus)病灶处分离到1株优势生长菌,编号为H-06091.分别通过创伤浸泡和注射方式感染健康红鳍东方鲀,发现这两种途径均可引发皮肤溃烂,两种途径的感染率均为100%,2×108 cell/mL.菌浓度注射组死亡率为100%,4×107 cell/mL菌浓度注射组死亡率为50%,创伤浸泡感染未见死亡.药敏实验表明,复方新诺明、呋喃妥因、链霉素、环丙沙星、利福平、红霉素、氟哌酸、氟嗪酸、庆大霉素、阿米卡星、四环素、青霉素G等抗菌素对H-06091有较强的抑制作用.按照<常见细菌系统鉴定手册>进行菌种鉴定并测定其16S rRNA基因序列,结果表明,该菌呈革兰氏染色阴性,氧化酶阳性,接触酶阳性,V-P试验阴性,硝酸盐还原反应阳性等特征,符合哈氏弧菌(Vibrio harveyi)特征,其16s rRNA基因序列与GenBank中哈氏弧菌同源性为99%,因此将H-06091鉴定为哈氏弧菌.     

鲤嗜水气单胞菌感染症及其病原生物学特性

对一起养殖鲤(Cypr inus carp io )发生的病害进行了发病情况、临床特征、病理变化等方面的检验。以3尾病(死)鲤进行病变组织中的细菌检查及细菌分离, 对分离菌进行了形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定; 同时选择代表菌株进行了16S rRNA 基因的分子鉴定, 测定了16S rRNA 基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树。结果表明, 分离菌为气单胞菌属(Aeromonas K luyv er and Van N iel 1936) 的嗜水气单[A.hydrophila (Chester 1901) Stan ier 1943] , 代表菌株( HC060718- 1株) 16S rRNA基因序列长度( 不包括引物结合区)为1 454 bp( GenBank登录号: EF669478)。择代表菌株做对健康鲤的人工感染试验, 表明了分离鉴定的嗜水气单胞菌在被检鲤病例的相应原发病原学意义及较强的致病作用。药敏试验结果显示, 对供试37种抗菌药物中的头孢噻肟等23种药物高度敏感, 对氨苄青霉素等5种药物敏感, 对青霉素G等9种药物耐药。     

中华鳖弗氏柠檬酸杆菌的分离、鉴定及药物敏感性试验

从患病中华鳖（Trionyx sinensis）内脏中分离到一株细菌（LCJY-002）。ATBExpression型微生物鉴定系统艋示：该菌为弗氏柠檬峻杆菌（Citrobcwter fundii）。16SrDNA分析得到1条长度为1456bp的核甘=酸序列（genBank登录号为KC691177）；Blast分析显示：该分离株与弗氏柠檬酸杆菌的同源性达99％，在系统发育树上与C．frgulldii聚为一支。鉴定结果确认：菌株LCJY-002为弗氏柠檬酸杆菌。人工回归感染试验证文：该菌具有敛病性，PCR检测表明：分离的弗氏柠檬酸杆菌具有c屈毒力因子。药敏试验结果显爪：该菌对16种抗菌药物中的庆大霉素等7种药物敏感。     

5株鲆鲽鱼类病原菌多克隆抗体的制备与应用

本研究制备了鳗弧菌Vibrio anguillarum、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida、副溶血弧菌V. parahaemolyticus、哈维氏弧菌V. harveyi和腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens 5株鲆鲽鱼类病原菌的兔抗血清，建立了5种菌的间接ELISA检测方法，并将该检测方法用于鱼类细菌分离物病原检测。人工感染结果显示，5株菌对大菱鲆的半数致死量(LD50)在102~107CFU/fish；制备的兔抗血清效价分别为1∶2 048 000、1∶16 000、1∶16 000、1∶1 024 000、1∶128 000；交叉反应结果显示，鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌3株弧菌与抗血清相互之间存在交叉反应；抗血清特异检测灵敏度分别为104、108、107、105、106cell/ml；对13株海水鱼类细菌分离物进行检测，有1株腐败希瓦氏菌阳性，两株哈维氏弧菌阳性；1株副溶血弧菌和哈维氏弧菌均为阳性，该结果与16S rDNA序列的分子分析方法一致。     

中国对虾糠虾幼体病原哈氏弧菌的鉴定及毒力基因检测

2011年春季对江苏连云港某对虾育苗场中国对虾Fenneropenaeus chinensis病死糠虾幼体分离到优势生长菌,对分离菌进行致病性、形态与生理生化特征及16S rRNA和gyrB基因同源性与系统发育分析。结果显示,引起糠虾幼体大量死亡的病原为哈氏弧菌Vibrio harveyi,菌株kx1对中国对虾仔虾和日本对虾仔虾的半数致死量LD50分别为2.0×106CFU/ml和7.0×105CFU/ml。为进一步明确分离菌株毒力基因的携带情况,进行了分离鉴定的4株病原菌对群体效应调节基因(luxR)、毒力调控基因(toxR)、溶血素基因(vhhA和vhhB)、金属蛋白酶基因(vhpA和vhpB)、毒力相关基因(toxS)、鞭毛结构基因(flaA)及锌金属蛋白酶基因(pap6)共9种毒力基因的检测,结果表明,4株病原菌均可检测到luxR、toxR、vhhA、vhhB和pap6毒力基因,扩增片段大小分别为679、390、1324、216和355 bp,其他4种毒力基因未检测到。分离鉴定的4株病原哈氏弧菌携带相同的毒力基因,这些毒力基因可作为检测致病性哈氏弧菌的生物学标记。     

一株病原发光杆菌的分离与鉴定

从三疣梭子蟹育苗场发病且大量死亡的大眼幼体中分离到优势生长的菌株SX1,人工感染试验证明,SX1对健康三疣梭子蟹大眼幼体及Ⅲ期幼蟹有较强的致病性;对菌株SX1进行了形态特征、理化特性等表型生物学特性检验,并进行了菌株SX1的16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因的同源性检索与系统发育学分析。结果显示,菌株SX1具有发光杆菌属的特征,且16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因序列均与发光杆菌具有较高的同源性,在系统发育树中与Photobacteriumganghwense聚为一个分支,自举数据值达100%。综合菌株SX1的形态特征、理化特性及3种基因的同源性检索与系统发育学分析,研究表明菌株SX1与P.ganghwense亲缘关系更近,鉴定SX1为P.ganghwense且为本次引起三疣梭子蟹大眼幼体大量死亡的病原菌。     

半滑舌鳎皮肤溃疡病病原研究

为了对半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原进行研究, 从患有严重皮肤溃疡病的半滑舌鳎病灶中分离病原菌, 并经人工感染确认病原。对引起此次疾病的病原菌的形态特征、理化特性、胞外产物酶活性与溶血活性及其对抗菌类药物的敏感性等生物学特性进行了研究和分析, 还测定了16 S rRNA、gyrB基因序列, 分析了相应序列的同源性并构建了系统发育树。结果从病灶中分离得到4株优势菌, 经人工注射感染证实菌株A3为引起养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原菌, 其半数致死量LD50为1.5×104.2 CFU/mL。其中, 16 S rRNA、gyrB在GenBank中的登录号分别是JN391271、JN168881。从基于16 S rRNA与gyrB基因序列构建的系统发育树看, 分离筛选出来的病原菌与哈维氏弧菌同源性最高, 结合生理生化特征和16 S rRNA、gyrB基因序列分析结果, 认为该病原菌为哈维氏弧菌。胞外产物酶活性及溶血活性检测结果表明，该病原菌具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶、蛋白酶和卵磷脂酶活性而不具有明胶酶活性, 在4%羊血TSA平板上呈β溶血活性。病原菌的药物敏感性试验结果显示, 该菌对四环素、强力霉素、诺氟沙星、磺胺异恶唑等敏感, 而对其他用于试验的抗生素敏感度低或具有一定的抗性。     

鲤病原鳗利斯顿氏菌的分离鉴定及生物学特性研究

从患病鲤(Cyprinus carpio L.)体内分离到一株优势生长菌,人工感染试验证明该菌对鲤有较强的致病性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等生物学性状检验;测定了分离菌的16S rRNA和gyrB基因的部分序列,并与相关细菌16S rRNA和gyrB基因序列进行比对后,构建了基于两种基因的系统发生树。结果显示:分离菌所扩增的16S rRNA和gyrB基因序列与GenBank数据库中鳗利斯顿氏菌的16S rRNA和gyrB基因序列相似性均在97%以上,其16S rRNA基因序列长度为1449 bp(GenBank登录号:FJ824662),gyrB基因序列长度为1202 bp(Gen-Bank登录号:GQ452957);胞外酶活性及溶血活性检测表明分离菌具有淀粉酶、蛋白酶、明胶酶、卵磷脂酶活性,但不具有脂酶活性;在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上,呈β型溶血,分离菌均具有金属蛋白酶基因及溶血素基因。根据分离菌的表型特征及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属(Listonella MacDonell and Colwell1986)的鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等12种药物耐药,对克林霉素等5种药物敏感,对恩诺沙星等32种药物高度敏感。     

条斑星鲽和圆斑星鲽线粒体12S rRNA与16S rRNA基因序列及其系统分析

采用PCR产物直接测序法分别测定了条斑星鲽和圆斑星鲽线粒体基因组序列,并对12SrRNA和16S rRNA基因核苷酸全序列进行分析,条斑星鲽和圆斑星鲽线粒体12S rRNA的核苷酸序列长度分别为948 bp和949 bp,16S rRNA均为1716 bp。试验结果表明,由12S rRNA和16S rRNA基因所构建的两个系统树的结构基本一致,21种鱼主要分为3个大的分支:鲤形目、鲶形目聚为1支,鲑形目独立聚为1支,鲈形目和鲽形目聚为1大支。鲆鲽类与鲈形目的鲹科、鲷科鱼类聚类在一支,且与鲹科的日本竹荚鱼、大西洋竹荚鱼构成姊妹群,支持鲆、鲽类是从鲈形目分化出来的观点,而同属于鲽形目的鳎科鱼类塞内加尔鳎在12S rRNA树中成为一个独立的分支,在16S rRNA树中聚到鲈形目和鲽形目的分支中,并且与鲈形目关系更近些,鳎类是1个特殊类群,其分类地位有待进一步探讨。线粒体基因组序列已提交到GenBank中,序列号为:DQ403797和EF025506。     

Molecular and phenotypic characterization of Vibrio aestuarianus, a pathogen of the cultured tongue sole, Cynoglossus semilaevis Günther

Studies were conducted to determine the cause of high mortalities of cultured half-smooth tongue sole Cynoglossus semilaevis. Gross signs of disease included loss of appetite, erratic swimming, and haemorrhages on the head, opercula and base of fins, dorsal fin rot, swollen abdomen filled with ascitic fluid and herniation of the intestine. Histological examination of the liver showed focal areas of necrosis and extensive haemorrhages. Virtually pure, dense bacterial cultures were obtained from liver, kidney and spleen tissues, and high pathogenicity of the isolates to tongue sole was confirmed. The phenotypic characteristics of the isolates including morphological, physiological and biochemical characteristics were determined. The 16S rRNA and gyrB genes of the isolates were sequenced, and the phylogenetic trees representing genetic relatedness between the isolate and publicly available 16S rRNA and gyrB gene sequences from GenBank were constructed. The results confirmed that the diseased tongue soles were infected with Vibrio aestuarianus. The sequenced 16S rRNA gene of strain TS1 (GenBank Accession No. GQ372983) was 1446bp, the gyrB gene of strain TS1 (GenBank Accession No. GQ372984) was 1200bp and the two genes exhibited high similarity (98~99%) to those of V. aestuarianus from GenBank. In addition, the activities of extracellular enzymes and haemolysin were also studied; the results showed that the isolates produced beta haemolysis on rabbit blood agar, lecithinase, proteinase, DNase and lipase, but gelatinase was not produced.     

三疣梭子蟹病原弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及定居因子抗原基因检测

2009年10月江苏赣榆地区某养殖场养殖的三疣梭子蟹出现大量死亡,症状主要表现为:病蟹行动缓慢、不摄食,蟹体消瘦,打开头胸甲可见肝胰腺、鳃、肌肉等内脏组织水肿,部分肝胰腺和肌肉组织呈腐烂状。从患病梭子蟹肌肉、肝胰脏、体内积液中分离到大量优势生长的细菌。人工感染试验,证明分离菌(JG091120-1)对健康三疣梭子蟹具有很强的致病性。对分离菌进行了形态特征、理化特性等常规表型生物学检验,同时利用分子生物学方法测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,其中分离菌16S rRNA基因序列长度为1 451 bp(登录号HQ170626),gyrB基因序列长度为1 186 bp(登录号HQ170627),分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性。根据分离菌的表型及分子生物学特性,判定该菌为肠杆菌科枸橼酸属的弗氏柠檬酸杆菌。定居因子抗原cfa是肠杆菌科产肠毒素细菌的一种重要致病因子,利用特异性引物进行cfa基因的PCR扩增,分离菌可以扩增出大小在100 bp的基因片段,表明本次分离的病原弗氏柠檬酸杆菌具有cfa毒力因子。     

红尾皇冠鱼(Aequidens rivulatus)病原无乳链球菌的分离、鉴定与特性分析

为查明天津地区养殖红尾皇冠鱼(Aequidens rivulatus)大量死亡的原因,取患病红尾皇冠鱼进行细菌分离,从病鱼肾脏中分离到优势菌株071901,人工感染试验证实其对红尾皇冠鱼有较强的致病性;采用形态学观察、生理生化特性、16S r RNA基因序列系统发育树分析及cfb(GBS-specific gene cfb,CAMP factor)基因检测对菌株071901进行鉴定。结果显示,菌株071901为革兰氏阳性球菌,生化特性与链球菌属的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)相近,基于16S r RNA基因序列的系统发育分析将菌株071901与无乳链球菌聚为一支,以071901为模板特异性扩增无乳链球菌的cfb基因,也得到了预期的900 bp的核酸片段,进一步证实菌株071901为无乳链球菌。对30种抗生素的药敏结果显示,菌株071901对红霉素、阿奇霉素等19种药物敏感,对多粘霉素、罗红霉素、呋喃唑酮等11种药物耐药。