养殖牙鲆弧菌病病因菌初步研究

１９９８年７月自荣成市寻山水产集团总公司养鱼场养殖牙鲆病死鲆体内分离到１株细菌，经人工感染试验证明是鲆菌病病原菌，该菌主要特征为：革兰氏阴性，弧状，以极生单鞭毛运动，氧化酶阳性，发酵葡萄产酸不产气，不产生Ｈ２Ｓ，不产生色素，生长温度范围１０－４２℃，pH范围６－１０，盐度范围０.5-6,经Ｂiolog Microstation System鉴定为河川弧菌－Ｉ，该菌株对环丙沙星，氟哌酸，利福平，呋喃唑酮，呋喃妥因，红霉素，链老素等药物敏感.     

鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗对牙鲆免疫效果的初步研究

为研究鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗对牙鲆的免疫效果,用该种疫苗对牙鲆进行了免疫试验.给牙鲆注射鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗,饲养25 d后分别用鱼肠道弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌进行攻毒,20 d后分别统计各组鱼的免疫保护率.结果表明,该疫苗对鱼肠道弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌的免疫保护率分别为84.6%、30.8%、33.3%.     

癸甲溴铵对褐牙鲆的急性毒性及抑菌试验

通过药浴方式,进行了癸甲溴铵对褐牙鲆的急性毒性试验;采用二倍稀释法,进行了癸甲溴铵对鳗弧菌、副溶血弧菌的体外抑菌试验;探讨了癸甲溴铵对鳗弧菌引起的褐牙鲆细菌性疾病的防治效果。结果表明,在19.0～21.0℃和24.5～25.5℃时,癸甲溴铵对褐牙鲆的24、48h半数致死浓度(LC50)和安全浓度(Sc)分别为6.35、4.84、0.84和2.43、2.14、0.5mg/L。通过对中毒死亡褐牙鲆的病理组织学观察表明,癸甲溴铵对褐牙鲆的鳃损害最严重,其次是肝脏,对肾脏的损害相对较轻,特别是对鳃的损害与鱼的死亡有很大的关系。在24和32℃,癸甲溴铵对鳗弧菌、副溶血弧菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为10、20和5、10mg/L。防治效果试验表明,癸甲溴铵0.3mg/L浓度药浴可有效防治鳗弧菌引起的褐牙鲆细菌性疾病。     

腹水病(Virulent ascitesosis disease)和溃烂病(Ulcer disease)致病病原四联疫苗制备及免疫牙鲆效果评价

腹水病和溃烂病是海水工厂化养殖牙鲆（Paralichthys olivaceus）危害严重的疾病。作者用本实验室分离鉴定的腹水病、溃烂病致病菌-迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda，Et）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus，Val）、杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida，As）和同行实验室赠予的鳗弧菌（Vibrio anguillarum，Van）制备灭活菌苗，设计四种不同配比四联疫苗，按正交试验要求，分别腹腔注射接种免疫牙鲆，检测单抗原抗体效价，统计分析筛选出组合合理的四联疫苗，配比为Et：Val：Van：As=2：1：1：2，并进行了疫苗安全性、稳定性评价及免疫牙鲆效果观察。发现该四联疫苗是安全的，稳定的，可在4℃下存放1年以上活性不降低，能有效刺激牙鲆特异性免疫系统产生免疫应答，免疫后7天血清抗体效价明显升高，免疫后14d血清抗体效价达到最高水平，为2^10；人工攻毒试验测定相对免疫保护率为60％。表明，筛选出的牙鲆腹水病和溃烂病四联疫苗安全有效，可同时预防腹水病、溃烂病的发生和流行。     

河流弧菌对牙鲆表皮粘液的趋化作用

病原菌对粘液的趋化作用在其对粘液层定植过程中起着重要作用，趋化作用是病原菌的毒力机制之一。为了解病原性河流弧菌对牙鲆表皮粘液的趋化作用，本文采用改良的毛细管法研究了细菌浓度、孵育时间、孵育温度、pH值、NaCl浓度、碳水化合物等对河流弧菌趋化作用的影响。试验结果表明：在较低浓度下，河流弧菌对牙鲆表皮粘液的趋化量随着菌浓度的升高而增大；在室温下河流弧菌的趋化量随着孵育时间的延长而增加，60 min趋于饱和；孵育温度在4～15 ℃范围内趋化作用随温度升高而增强，15 ℃时达最大值；pH值为8时细菌的趋化性最强；NaCl浓度超过0.8 %,河流弧菌的趋化性随着浓度升高而显著减弱（P<0.05）；7种碳水化合物中甘露醇、乳糖、甘露糖能够极显著地促进河流弧菌对牙鲆表皮粘液的趋化作用（P<0.01）。以上结果说明：牙鲆表皮粘液对河流弧菌有较强的趋化作用，该趋化作用受环境因子的影响较大；本文所揭示的河流弧菌趋化特性将对养殖牙鲆疾病防治提供有价值的参考。     

氟苯尼考对六种海洋致病弧菌的体外抗菌活性研究

测定了氟苯尼考等4种抗菌药对6种常见海洋致病弧菌的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。测试结果显示，氟苯尼考对6株弧菌的MIC值范围为2～4μg／mL，氯霉素为1～32μg／mL，土霉素为4～128μg／mL，恩诺沙星为0．125～1μg／mL；对多数弧菌氟苯尼考与氯霉素的抗菌活性相似。氟苯尼考对6株弧菌的MBC／MIC值范围为2-4，而氯霉素为2～16，表明氟苯尼考的杀菌效果优于氯霉素。对照药物恩诺沙星、土霉素的MBC／MIC值分别为1-2和2-8，恩诺沙星显示出优良的抗菌和杀菌活性。随着接种菌量增加，所测3种抗菌药的MIC随之升高；当接种量达到10^7ufu／mL时．药物对多数弧菌显示出微弱的作用。     

利用DD-PCR分离鳗弧菌刺激相关的牙鲆差异cDNA及表达

本研究采用mRNA差异显示技术(mRNA differentid display,DD-PCR)分离得到20个鳗弧菌(Vibrio anguillarum)诱导前后差异表达的牙鲆(Paralichthys olivaceus)cDNA片段。通过对差异片段进行回收、再扩增、克隆、测序、序列比对以及验证分析后,得到9个阳性片段,其中2个片段与已知基因高度同源,一个与牙鲆C3补体高度同源,同源性98%,另一个与牙鲆TEGT(睾丸增强基因转录子)基因高度同源,同源性98%;其余7个为新的cDNA片段。基因表达分析表明,这9个差异片段均在处理组、对照组的不同器官和时间段差异表达,而且多数片段经鳗弧菌诱导后都在肝脏、肾脏、脾脏等鱼类主要免疫器官中上调表达,初步推测它们都是和牙鲆免疫或鳗弧菌病相关的基因。对这些基因进一步的功能研究将对牙鲆的抗病育种及养殖业提供重要的参考。     

牙鲆抗病群体和家系的建立及其生长和抗病性能测定

通过自然选择和人工感染途径筛选出抗鳗弧菌病牙鲆鱼种,将其培育成亲鱼94尾,建立了牙鲆抗病群体;从日本引进了牙鲆日本群体;以上述2个群体以及黄海中捕捞的黄海群体为基础群体,通过不同组合的交配,建立了63个牙鲆家系,其中半同胞家系54个,全同胞家系9个.生长比较实验表明这63个家系的生长速度存在着明显差异,从中筛选出生长快速的家系4个(家系36,42,43和57),生长较快的家系9个(家系27、28、35、39、41、51、60、65和76),生长慢的家系1个(75号家系).通过对59个家系的抗病能力测定表明,不同家系在抗鳗弧菌感染的能力上存在着明显差别,从中鉴定出抗病力强的家系3个(家系50,61和68号),其在鳗弧菌感染后的成活率高达60%以上;抗病力比较强的家系17个,其成活率为39%～60%;抗病力一般的家系33个,其成活率为17%～39%之间;抗病力差的家系6个,其成活率在17%以下.这些牙鲆家系的建立为牙鲆抗病、高产新品种的培育奠定了重要基础.     

鳗弧菌感染牙鲆药物代谢动力学模型的初步建立

用鳗弧菌腹腔注射牙鲆进行人工感染实验,对感染牙鲆进行血液生理生化指标的测定,并观察描述患病牙鲆的外观症状及有关组织器官的病理变化,以高效液相色谱(HPLC)法为定量手段研究达氟沙星在健康和感染牙鲆体内的药动学特征。结果表明,(1)每公斤体重腹腔注射鳗弧菌2.0×107~3.0×107cells可复制出疾病模型;(2)与健康鱼相比,患病鱼的红细胞数、血红蛋白、血小板数、Cl-、Na 等显著下降,而白细胞数、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌苷(Cr)、K 极显著增加,说明经鳗弧菌感染后,牙鲆在药物吸收、代谢等方面的生理功能受到严重损害;(3)患病鱼的肝、肾、脾等组织细胞均发生实质性病变,而对照组外观正常,组织器官未见病理变化;(4)达氟沙星在感染牙鲆体内的吸收、分布和消除均减慢,生物利用度降低。鳗弧菌感染必将影响药物在体内的分布和血浆蛋白结合率,改变药物及其代谢物从体内消除的速度和程度,进而影响药物的疗效。该模型复制的方法可靠且具有可重复性,它对探讨药物在患病鱼体内的动力学规律,揭示疾病对药动学的影响机理和指导临床合理用药等具有理论和实践意义。     

盐度对漠斑牙鲆幼鱼生长与存活的影响

本文就盐度对漠斑牙鲆幼鱼的生长及存活的影响进行了探讨,结果表明:漠斑牙鲆幼鱼适宜盐度范围为0～36,最适盐度范围为6～18。在适宜盐度下,漠斑牙鲆幼鱼生长快,存活率高。过高或过低的盐度对幼鱼的生长发育均有一定的抑制作用。     

海洋细菌Phaeobacter DL2的鉴定及其对致病弧菌抑制作用

从海水养殖水体中防腐钢片的微生物黏膜上分离筛选到一株细菌,命名为DL2.采用琼脂扩散法进行体外抑菌实验,测定其抑菌谱,发现菌株DL2具有较广泛的抑菌谱,并且对致病性弧菌表现出较强的抑菌作用.通过常规生理生化研究和细菌鉴定系统测试,发现菌株DL2属于革兰氏阴性菌,短杆状,具极生单鞭毛,菌落呈褐色,能产生浅褐色扩散性色素,测试结果表明,菌株DL2与Phaeobacter属细菌的特征非常相似.为了进一步确定菌株DL2的分类学地位,测定了其16S rRNA基因序列,与相关细菌种属相应序列的同源性进行比较并构建了系统关系树,结果显示,菌株DL2与Phaeobacter inhibens的亲缘关系最近,相似性达99.8%,与Phaeobacter gallaeciensis相似性达99.1%.综合上述结果,菌株DL2可鉴定为Phaeobacter inhibens,同时可以将其作为潜在的海洋有益菌应用于水产养殖中.     

Pathogenicity of Edwardsiella tarda to olive flounder, Paralichthys olivaceus (Temminck & Schlegel)

The LD50 and cytotoxic and enzymatic activities of both cells and extracellular products (ECPs) of eight Edwardsiella tarda strains were determined and their bacterial superoxide dismutase gene (sodB) and catalase gene (katB) were sequenced. Strains were also examined for their ability to resist the immune responses of olive flounder, Paralichthys olivaceus. LD50 values of strains (FSW910410, KE1, 2, 3, 4, 5 and 6) in olive flounder ranged between 10(2.5) and 10(5.3) cfu (colony forming units) per fish. Unlike the avirulent strain SU100 (LD50>or=10(7)), all pathogenic strains were able to survive in flounder serum and head kidney leucocytes (except for KE2). The virulent strains possessed type I sodB and katB, whereas SU100 had type II sodB but not katB. However, there was no difference between avirulent and virulent strains in haemolytic and cytotoxic activities. The results of this study demonstrated that the ability of E. tarda to resist complement activity and phagocytosis is conferred by its superoxide dismutase and catalase, which thus play an essential role in the pathogenicity of this bacterium. In addition genotyping of sodB and kat B proved to be a very useful tool to distinguish virulent from avirulent strains.     

银鲫不动杆菌病原菌鉴定及药敏试验

从患病的异育银鲫体内分离到5株可疑菌株,经API 20NE细菌生化鉴定,YCS07-04株鉴定率为99.5%,T值符合率0.9,菌株鉴定为鲍曼不动杆菌。采用3种不同浓度进行感染试验,5.0×106cfu/ml浓度组注射感染14 d死亡率达100%,浸泡感染14 d死亡3尾;对照组未出现病症和死亡。菌株在营养琼脂菌落生长良好,在营养肉汤培养基中混浊,有菌膜及沉淀生长;血琼脂平皿菌落呈灰白色,直径2~3 mm,不溶血;麦康凯琼脂菌落半透明圆形;在SS琼脂培养基中不生长。经负染电镜观察,菌株末端圆形短杆状,偶尔可见不规则丝状体,大小为(1.0~1.5)μm×(1.5~2.5)μm,无芽孢、荚膜和鞭毛,表面凹凸不平,静止期呈球形。药敏试验表明,菌株对丁胺卡那霉素、链霉素、妥布霉素、庆大霉素、左氟沙星、复方新诺明和洛美沙星高度敏感;对四环素中度敏感;对羧苄青霉素、氧哌嗪青霉素、苯唑青霉素、头孢他啶、头孢噻肟、头孢哌酮、头孢三嗪和氨曲南等耐药。     

文蛤病原菌——需钠弧菌的鉴定和生物学特性分析

从患病文蛤Meretrix meretrix体内分离出一优势菌株WT01，回归感染试验证明是文蛤的致病菌。对该菌形态、生理生化特征、盐度、温度和PH值生长条件以及16S rRNA基因序列进行了研究。结果表明，该菌为革兰氏阴性菌，发酵葡萄糖产酸不产气，氧化酶阳性，生长需NaCl，无色素，不发光，在TCBS平板上形成圆形黄色菌落，对弧菌抑制剂O／129敏感，具有弧菌属的典型特征。16S rRNA基因序列分析表明，该菌与需钠弧菌Vibrio natriegen的亲缘关系最为接近，其同源性达999／6以上。因此，将该菌鉴定为需钠弧菌。实验显示其半数致死量为5．5×10^6CFU／g。19种抗菌药物药敏试验结果表明，该菌对氟哌酸、复方新诺明、菌必治、先锋必、链霉素、氯霉素和庆大霉素等抗生素较为敏感。并对其胞外产物的生物学特性进行了分析。     

海带表面降油细菌的分离鉴定及降油性能研究

用柴油为唯一碳源的培养基选择分离海带表面具有降解柴油性能的细菌;对分离菌株进行了形态学、生理生化特性以及16SrDNA序列分析并测定其生长特性;测定了接菌不同浓度(7×107 cfu/mL、7×108cfu/mL、7×109 cfu/mL)分离菌对柴油的降解率;另外,测定了加入不同浓度葡萄糖(0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L)作用7d后分离菌对柴油的降解率。结果显示:从海带表面分离到2株降油细菌,编号为:HD-4和HD-6。HD-4菌株菌落形态圆形、直径1.5mm、黄色、不透明、边缘整齐,HD-6菌株菌落圆形,直径1.0mm,浅黄色、透明、边缘整齐。两株菌均为革兰氏阴性短杆菌。生理生化特征和16SrDNA序列分析确定HD-4菌株为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.),其16SrDNA同源性为99%;HD-6菌株为交替单胞菌(Alteromonas_sp.),其16SrDNA同源性为98%。2株菌最适生长温度均为15℃。HD-4和HD-6最适生长pH分别为9和8。适宜NaCl浓度分别为2%和4%;在25℃振荡培养(150r/min)7d,接菌量为7×107 cfu/mL、7×108 cfu/mL、7×109 cfu/mL时,HD-4对柴油的初始降解率分别为8.0%,22.1%和27.6%;HD-6初始降解率分别为23.7%、38.8%和43.2%。加入葡萄糖后2株菌的降油率均有所增高,加入4g/L葡萄糖时达最高值,3个接种浓度下HD-4菌株分别为85.4%、82.3%和80.4%,HD-6菌株分别为86.8%、93.7%和89.3%。当接菌量为7×107 cfu/mL,HD-4在葡萄糖含量为4g/L时作用7d,降油率可达到最大值86.72%,HD-6菌株在葡萄糖浓度6g/L达到最大值67.64%。葡萄糖浓度超过4g/L和6g/L时HD-4和HD-6菌株的降油性能有所下降。     

山瑞鳖塞氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及药物敏感性研究

从患致死性传染病的山瑞鳖(Palea steindachneri)组织中分离到一株细菌(YL090422),对该菌形态、生理生化特征及致病性进行分析,并用BIOLOG自动微生物鉴定系统及16S rDNA序列分析对其进行了鉴定。结果显示:该菌具有较强的致病性,且为发酵型革兰氏阴性短杆菌,无芽胞及荚膜;具有对葡萄糖、精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、西蒙氏柠檬酸盐、丙二酸盐、卫茅醇、吲哚、动力等反应呈阳性,对氧化酶、赖氨酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氨酶、V-P反应等呈阴性的特点。BIOLOG自动微生物鉴定系统显示该菌为塞氏柠檬酸杆菌(Citrobacter sedlakii)。16S rDNA序列分析得到1条长度为1464bp的核苷酸序列(GenBank登录号为GU726186),并显示该分离株与塞氏柠檬酸杆菌(C.sedlakii)的同源性达99.9%,且在系统发育树上与C.sedlakii聚为一支。鉴定结果确认菌株YL090422为塞氏柠檬酸杆菌(Citrobacter sedlakii)。药敏试验结果显示:该菌对供试16种抗菌药物中的阿米卡星等3种药物敏感,对头孢哌酮等3种药物中度敏感,对氨苄青霉素等10种抗生素均存在不同程度的耐药。     

Annual dynamics of marine birnavirus (MABV) in cultured Japanese flounder <Emphasis Type="Italic">Paralichthys olivaceus</Emphasis> and sea water

ABSTRACT:   Seasonal changes in the infection state of marine birnavirus (MABV) in Japanese flounder Paralichthys olivaceus and in rearing sea water are described. Sea water and 10–11 healthy fish were sampled monthly from April 2002 to February 2003. The MABV genome was detected throughout the year in > 80% of the fish examined at each sampling. The virus was isolated from the liver, kidney, and spleen, but not from the brain. The detection rate in each organ increased from April to October, and then decreased. Detection of virus antigen by the indirect fluorescent antibody technique also showed that the virus was present from spring to autumn (June–September) in the liver, kidney, and spleen, but not the brain. Sequence analysis of the MABV genome at the VP2–NS region revealed two specific mutations compared to the standard yellowtail strain (Y-6). It is suggested that the infection state of MABV in Japanese flounder changes to a latent or persistent infection after autumn. MABV was detected in sea water between September and February, suggesting that virus particles in the environment are relatively higher during cool seasons.     

条斑紫菜耐高温杂交重组品系的筛选与特性分析

为改善条斑紫菜优良品系TM-18藻体颜色偏红的弱点,本研究以红色型突变品系(TM-18,特点:藻体偏红色;生长快,色素蛋白含量高,具有一定的耐高温性)为父本;绿色型突变品系(OMO-1,特点:藻体绿色,生长较慢,色素蛋白含量低,耐高温性差)为母本进行种内杂交,从杂合丝状体的F1叶状体中,分离出了优良品系TW-9。通过比较它与亲本品系的特性,获得以下结果:在常温(18°C)和高温(24和25°C)下培养13 d,TW-9品系的壳孢子存活率分别为TM-18品系的1.0、1.1和1.1倍,以及OMO-1品系的1.1、4.7和7.2倍。在18°C组,3个品系的壳孢子苗畸形率无显著性差异,但在24和25°C组,TW-9品系的畸形苗率比TM-18品系分别降低了20.3%和29.5%,比OMO-1品系分别降低了74.8%和69.5%。将在18°C下培养40 d的叶状体分别置于18、24和25°C再培养10 d,TW-9品系的绝对生长率分别为TM-18品系的0.9、1.5和0.8倍,以及OMO-1品系的1.4、1.5和28倍。此外,在24°C下培养25 d或在25°C下培养10 d,OMO-1品系的藻体腐烂严重,最后完全解体;TM-18和TW-9品系藻体在24°C下培养25 d只出现轻微卷曲,但在25°C下,TM-18品系培养15 d就腐烂至完全解体,而TW-9品系培养30 d也只是轻微腐烂。在18°C下培养40 d的TW-9品系叶状体分别再在18和24°C下培养15 d,总藻胆蛋白含量分别为61.5和77.8 mg/g,分别为OMO-1品系的1.4和1.4倍,但与TM-18品系的含量相比无明显差异。在18°C下培养55 d的叶状体平均厚度,TW-9品系为25.6μm,分别比TM-18和OMO-1品系降低了13.5%和17.7%。另外,3个品系的壳孢子放散量无显著性差异。研究表明,TW-9品系不仅具有与TM-18品系相似的特性,如叶状体生长快、色素蛋白含量高、壳孢子放散量大等特性,并且它的藻体更薄、更耐高温,其颜色与野生色相近,符合生产栽培的要求,有望被培育成适宜栽培的新品种。     

盐碱地低盐水池塘网箱套养漠斑牙鲆技术研究

根据漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)适广温、广盐和较强的抗逆性等优良生态习性,采用地下卤水、盐碱地渗水,通过合理淡水配兑使其适合漠斑牙鲆生理生长需求,在我国中纬度地区利用盐碱地低盐水养殖过洋、暖温性漠斑牙鲆。2004-2005年,利用盐碱地低盐水池塘虾池设置网箱套养漠斑牙鲆349.5m2,产鱼3.749t,产虾55.065t,其中2005年虾池设置网箱套养漠斑牙鲆306m2,产鱼3.245t,平均10.6kg/m2,平均全长34.0cm,体重527.4g,养殖成活率为90.5%,产虾49.003t,平均408.4kg/亩,平均规格11.9cm,养殖成活率为71.23%。虾池设置网箱套养漠斑牙鲆,可充分利用水体空间,促使池塘高产高效,提高养殖经济效益。     

一株凡纳滨对虾病原菌的分离、鉴定及其致病力分析

从患病凡纳滨对虾肝胰腺中分离出菌株20100612001,经人工感染实验证实,该分离菌株对凡纳滨对虾的半数致死量为1.44×106CFU/ml。形态学观察和革兰氏染色表明,该菌株为革兰氏阴性,无芽孢,有一根端极鞭毛;呈球杆状、球状、棒状或梨状且有两极浓染现象;在2216E培养基上为透明或半透明的圆形菌落,而在TCBS选择性培养基上为绿色或蓝绿色菌落。经Biolog碳源利用反应、脂肪酸气相色谱分析得出,该菌株与副溶血弧菌、需钠弧菌等的生理生化特性最相似;16SrD-NA序列测定表明,该菌株与弧菌属中几株病原菌的同源性均达到98.9%以上。在分子进化树中该菌株与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的进化地位最接近。综合上述实验结果分析得出,该细菌分离物为副溶血弧菌。