杂色鲍紫色酸性磷酸酯酶基因克隆及应激下的表达

 利用本实验室获得的杂色鲍(Haliotis diversicolor)转录组测序数据库, 筛选出杂色鲍紫色酸性磷酸酯酶(Purple acid phosphatase, PAP)同源片段, 进而克隆获得PAP的cDNA全序列, 命名为HdPAP, 并进行了HdPAP蛋白的结构分析和功能预测, 同时利用实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析HdPAP基因的组织表达谱和应激条件下的HdPAP表达变化。HdPAP基因cDNA全长1 215 bp, 含有1个编码322 个氨基酸的969 bp的开放阅读框。经Blast比对, 与无脊椎动物半索动物门囊舌虫(Saccoglossus kowalevskii)的PAP氨基酸序列一致性最高, 达59%。通过实时定量PCR检测, HdPAP在检测的杂色鲍各组织中均有表达, 其中在血细胞和肝胰腺的表达量显著高于其他各组织(P<0.05)。高温应激下, 在检测的6个时相中, HdPAP在血细胞、肝胰腺和鳃中均出现不同程度的表达抑制。缺氧应激后, 4 h血细胞中HdPAP显著低于对照组, 24 h恢复到正常水平, 96 h显著高于对照组(P<0.05), 到192 h又恢复到正常水平。副溶血弧菌感染实验中检测到HdPAP在血细胞中同样出现表达抑制现象, 3 h和6 h均检测到感染组HdPAP表达量显著低于对照组(P<0.05)。PAP在高温、缺氧及弧菌感染下显著的表达抑制从转录水平揭示了其作为表达下调的酯酶可能参与胁迫下的生物代谢和免疫反应。

     

杂色鲍14-3-3ζ基因的克隆及其在应激下的表达

酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白ζ(14-3-3ζ蛋白)是14-3-3蛋白家族的亚型之一。14-3-3蛋白是一种高度保守的酸性可溶性蛋白,它可以与激酶、磷酸酶等多种信号蛋白结合,并在信号转导和细胞凋亡等过程中发挥相应的作用。本实验通过SMART-RACE技术首次获得了杂色鲍14-3-3ζ基因的全长,并命名为Hd14-3-3ζ,其cDNA全长为3 010 bp,ORF为819 bp,共编码272个氨基酸。实时荧光定量PCR结果显示,Hd14-3-3ζ基因在杂色鲍各组织中均有表达,其中在肝胰腺和血细胞中的表达量相对较高。当处于缺氧环境下时,鳃组织中Hd14-3-3ζ的表达在4 h时存在显著差异,血细胞中Hd14-3-3ζ在24 h和96 h时表达量显著上调。高温应激下,Hd14-3-3ζ在血细胞中的表达量无显著变化,而鳃组织中Hd14-3-3ζ在96 h的表达量却显著上调。高温缺氧联合应激实验表明,鳃组织中Hd14-3-3ζ在4 h、24 h和96 h均显著上调,而血细胞中的表达量没有显著性变化。经检测发现,副溶血弧菌注射后,鳃组织中Hd14-3-3ζ在3 h和24 h,血细胞中在6 h和24 h的表达量显著上调。以上温度、溶氧量等环境因素以及病原菌的刺激均会导致Hd14-3-3ζ在不同组织中表达量的显著变化,说明Hd14-3-3ζ在杂色鲍的免疫反应中可能扮演着重要的角色。     

杂色鲍DAD1的克隆及在发育、弧菌感染、高温和缺氧下的表达分析

抗细胞凋亡因子(DAD1)是细胞凋亡的负调控因子。在杂色鲍转录组测序的基础上,通过RACE的方法,获得了杂色鲍DAD1基因的全长c DNA,命名为HdDAD1。该序列全长553 bp,开放阅读框339 bp,编码112个氨基酸。编码蛋白具有保守的DAD功能域和3段跨膜区。实时定量PCR结果表明,HdDAD1在杂色鲍所检测组织中均有表达,消化道、鳃、血细胞、粘液腺和肾脏中表达量最高。同样,HdDAD1在发育各阶段均有表达,幼虫阶段表达量最高,原肠胚次之,其他胚胎发育阶段和稚鲍表达量最低。HdDAD1能够响应细菌感染、高温和缺氧应激。在弧菌注射12 h后,表达量显著上升。当水温由最适的25°C上升到28°C时,HdDAD1表达量升高;在31°C持续4和96 h时HdDAD1表达量显著上升。在低氧处理4和96 h时,HdDAD1的表达量也显著上升。     

杂色鲍AP-1的克隆及在发育和弧菌感染后的表达分析

激活蛋白1(AP-1)是具有亮氨酸拉链功能域的转录因子,参与了发育和免疫等多个生物学过程。为研究该基因在杂色鲍发育和免疫中的作用,本研究克隆了杂色鲍AP-1基因的全长cDNA(命名为HdAP-1),并分析了HdAP-1在各组织、各发育时期以及副溶血弧菌刺激后的表达特征。结果表明,HdAP-1cDNA全长为1482bp,5′非编码区域(5′UTR)为133bp,3′UTR为401bp,开放阅读框为948bp。该基因编码蛋白预测分子量为34.83ku,等电点为9.43,具有典型AP-1蛋白家族的Jun转录因子功能域和bZIP功能域。HdAP-1在所检测7个组织中均有表达,其中血淋巴表达量最高,鳃、肾、肠和黏液腺的表达量次之,肝胰腺和外套膜表达量最低。自受精卵至囊胚期HdAP-1的表达量显著低于原肠胚(P0.05),由原肠胚到担轮幼虫该基因表达量继续上升,担轮幼虫至匍匐幼虫期均维持较高的表达水平,变态后在稚鲍中的表达量下降。在副溶血弧菌感染24h后,HdAP-1表达量显著上升(P0.05)。其他时段该基因的表达量与对照组相比差异不显著(P0.05)。     

杂色鲍一种编码CRAD功能域基因的克隆及其在发育和应激中的表达

为探讨Caspase募集功能域(CRAD)在鲍发育和应激中的作用,实验通过比对杂色鲍转录组序列和RACE扩增的方法,获得了杂色鲍一条含CRAD的基因全长c DNA,命名为Hd CRAD;采用实时定量PCR的方法获得了该基因在发育和应激中的表达谱。结果显示,Hd CRAD的c DNA全长1 371 bp,开放阅读框735 bp,编码244个氨基酸。编码蛋白具有保守的CRAD功能域。该基因在各检测组织中均可表达,在黏液腺中表达量最高;在发育各阶段也均有表达,面盘幼虫晚期表达量最高。在细菌感染、高温或缺氧应激处理后,血细胞的Hd CRAD表达水平均有显著性变化。在担轮幼虫时期,RNA干扰该基因会显著提高幼虫畸形率;幼虫的caspase-8和DAD1的表达水平会显著上升,而caspase-3的表达水平会下降。研究表明,该基因参与了鲍幼虫发育过程;在成体免疫、耐高温和抗低氧中发挥了一定作用。     

理化因子对杂色鲍血蓝蛋白酚氧化酶活性影响的研究

以邻苯二酚为底物研究部分理化因子对杂色鲍（Haliotis diversicolor）血蓝蛋白酚氧化酶活性的影响。结果表明,血蓝蛋白酚氧化酶活性最适温度34℃、最适pH6．4;铜离子（Cu^2＋）能极其显著增强血蓝蛋白的酚氧化酶活性,增强率为264％,而乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、镁离子（Mg^2＋）和锌离子（Zn^2＋）则能极其显著地抑制其活性,EDTA的抑制效率最高,抑制率为52．8％,Mg^2＋和Zn^2＋的抑制率分别为27．8％和25％。钙离子（Ca^2＋）对血蓝蛋白酚氧化酶活性影响不显著。     

低氧胁迫对九孔鲍免疫防御因子的影响

为了解低氧胁迫条件下九孔鲍免疫防御因子的变化及机体抗病力变化, 将九孔鲍置于不同的溶解氧环境中, 观测相关免疫因子变化。结果显示, 在水温为(22.1?1.3) oC, 盐度为30.72?0.54, pH值为8.20?0.14的海水环境中, 溶解氧含量由(7.49?0.14) mg/L下调至(2.53?0.16) mg/L后120 h内, 平均体质量为(14.25±2.21) g的九孔鲍未见死亡, 而每只鲍注射5.0?10⁵ CFU 副溶血弧菌后120 h内实验鲍的累计死亡率高达91.11%?7.70%, 比对照组(11.11%?3.83%)累计死亡率高出80%, 血淋巴抑菌清除率下降至?(3 340.47%?298.57%), 显而易见, 低氧胁迫使得九孔鲍拮抗副溶血弧菌感染的抵抗力显著下降。低氧(2.53?0.16) mg/L胁迫下, 九孔鲍血淋巴细胞数量(THC)下降30.62%?4.87%、血淋巴细胞吞噬率下降62.77%?5.79%、呼吸爆发产生的超氧阴离子数量下降22.21%?5.89%。低氧胁迫下九孔鲍血淋巴细胞内MPO活性上升(9.63%?7.59%)~(22.90%?13.73%)、CAT活性提高(7.68%?6.83%)~(56.28%?13.96%), 反映出低氧胁迫下九孔鲍体内应激反应产生的物质氧化加剧, 血淋巴细胞内产生大量的活性氧自由基。溶解氧含量由(7.49?0.14) mg/L下调至(4.51?0.12) mg/L后九孔鲍已明显处于低氧胁迫和应激反应状态, 120 h内的累计死亡率达到37.78%?3.85%, 血淋巴抑菌率下降至883.56%?123.22%; THC、血淋巴细胞吞噬率、呼吸爆发产生的超氧阴离子O₂^- 数量等最大降幅分别达到12.51%?6.59%、21.90%?15.84%、12.93%?5.74%; MPO活性在原有水平的?(10.61%?4.20%)~(7.13%?6.45%)之间波动, CAT活性在?(5.17%?18.08%)~(16.26%?10.85%)之间变化。     

杂色鲍肌肉萎缩症病原菌的分离鉴定及系统发育分析

近几年中国南方杂色鲍（Haliotis diversicolorReeve）养殖场频繁爆发严重的肌肉萎缩症,该病能感染各种规格杂色鲍,死亡率很高。病鲍症状主要表现为外套膜和内脏团萎缩、无生气,附着力下降,最终死亡。该试验从病鲍组织分离到1株优势菌WS,人工感染试验证实其对健康杂色鲍有很强致病性,且与自然发病的杂色鲍症状相同。对菌株WS进行形态学观察和生理生化检测,结果显示与哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）最为接近。为了进一步确定其分类地位,采用1对通用引物扩增其16S rDNA序列片断进行序列分析和同源性对比,构建系统发育树,结果表明,菌株WS与弧菌属的V.harveyi[AY750577]聚为1个分支,且同源性达99.70%。综合上述3种鉴定结果,确定该菌为哈维氏弧菌。     

杂色鲍在高密度养殖条件下的生长速率

本文报道了在人工高密度养殖条件下,杂色鲍（Ｈａｌｉｏｔｉｓｄｉｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）的相对生长率、特定生长率及生长速度与饵料、水温等环境因子的关系。结果表明,杂色鲍的饵料系数为１３．６６,饵料转化率为０．０７３２,增重倍数为６．０３。体重与体长生长速率（７～１２月）关系式为Ｗ＝０．３０３９Ｌ－６．１８８７。     

杂色鲍血蓝蛋白的分离纯化及其酚氧化酶活性研究

利用超速离心和CsCl梯度离心的方法,从杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)血淋巴中分离纯化血蓝蛋白(Hcs),SDS-PAGE检测提取的血蓝蛋白由1种亚基构成,分子量为400kD;Native-PAGE电泳检测2个亚基(Isoform)分别为HdH1、HdH2;透射电镜下其四级结构为圆柱体,以多十聚体、二十聚体和少量的十聚体形式存在于血淋巴中。杂色鲍血蓝蛋白在以邻苯二酚为底物的条件下表现出微弱的酚氧化酶活性(Km=25.66mmol/L),胰蛋白酶和SDS能使其酚氧化酶活性增强;以左旋多巴(L-DOPA)为底物则不表现出酚氧化酶活性。     

引起南方九孔鲍苗大规模死亡的一株病原菌的分离鉴定及其致病性研究

从汕尾一鲍鱼场的变白掉板九孔鲍苗中分离到一批菌株,对其中的21号菌株进行了深入的研究。回归感染试验证明其为病原菌,API条带分析表明该菌为副溶血弧菌,药敏试验揭示该菌对诺氟沙星、阿米卡星、四环素、新生霉素、新霉素有抗药性,但对头孢唑啉、庆大霉素、氯霉素、多粘霉素敏感。     

杂色鲍血细胞中一氧化氮合酶活性的鉴别

一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)是催化L-精氨酸与O_2产生一氧化氮(Nitric ox- ide,NO)的一种合成酶,它广泛存在于生物体的各个器官和组织中,其活力大小可通过测定NO合成量的多少来决定。NO作为一种新型生物信使分子、效应分子和免疫调节分子,参与机体多种重要的生理病理活动,可以通过非特异性地杀伤细菌、真菌、寄生虫及病毒等。增强机体的非特异性免疫。本文采用生物化学法,以副溶血弧菌和脂多糖为刺激因子.并采用硝酸盐还原酶法测定了NO的水平,对杂色鲍血细胞中的NOS活性进行了初步鉴别。结果表明,加入副溶血弧菌组或LPS组NO水平显著高于对照组(P<0.05),孵育4h后分别为对照组的1.84和1.92倍,孵育8h后分别为对照组的2.38和3.05倍,而且这一反应能被NOS抑制剂L-NAME所阻断,说明杂色鲍血细胞中存在NOS活性。     

Isolation and characterization of pathogenic Vibrio alginolyticus from diseased postlarval abalone, Haliotis diversicolor supertexta (Lischke)

Outbreaks of serious mortality among cultured abalone postlarvae have occurred across Southern China since July 2002. Five motile bacterial strains were isolated from diseased abalone postlarvae on tryptic soy agar supplemented with 1% NaCl (TSA1) and/or thiosulphate citrate bile salt (TCBS) sucrose agar plates during an outbreak in August 2003 in Shanwei, Guangdong province. All isolates were characterized and identified as Vibrio alginolyticus on the basis of biochemical characteristics and comparisons with those of the reference strain V. alginolyticus ATCC 17749. Strain 19 (a representative of five similar isolates) was virulent to abalone postlarvae with an LD₅₀ value of1.00 × 10⁴ colony‐forming units mL^?1. All abalone postlarvae exhibited the same signs as in natural outbreaks. The same bacterium could be re‐isolated from abalone postlarvae after bacterial challenge using TSA1 and TCBS plates. The results reveal that V. alginolyticus is an infectious agent of abalone postlarvae.     

杂色鲍幼苗“急性死亡脱落症”病原菌分析

从“急性死亡脱落症”发病期的杂色鲍幼苗体内和病苗附着的薄膜上，共分离到4株优势菌，即NA0301、NA0302、NA0303和NA0304。经人工浸泡感染实验证明，从病幼苗体内和苗附着的薄膜上分离到的优势菌株NA0301和NA0302是杂色鲍幼苗的致病菌，它们均为革兰氏阴性、短杆状、极生鞭毛，能运动。常规生理生化和Biolog细菌鉴定系统测试结果表明，菌株NA0301与溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）的亲缘关系最近，而菌株NA0302与溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的亲缘关系最近。为了进一步确定它们的分类学地位，分别测定了溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌的16S rDNA序列，分析相关细菌相应序列的同源性，并构建系统进化树。结果表明，菌株NA0301与溶珊瑚弧菌的亲缘关系最近，菌株NA0302与溶藻弧菌的亲缘关系最近。因此，菌株NA0301和菌株NA0302分别鉴定为：溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌。[中国水产科学，2006，13（4）：655—661]     

不同技术措施控制杂色鲍暴发性流行病的效果比较

杂色鲍 (Haliotisdiversicolor)鲍苗体长 18.12～ 2 3.82mm ,体重 0 .98～ 2 .5 6g ,在 5种模式下进行养殖 ,即 :1)养殖用海水以不同方式进行前处理 ;2 )以 2 4h不同补水倍数 ;3)不同“倒池”次数 ;4 )不同投喂次数投喂细基江蓠 (Gracilariatenuistipitata) ;5 )不同产地、相同规格的鲍苗比较养殖。模式 1)～ 4 )养殖周期均为 6个月 ,鲍苗取自广东陆丰 ;模式 5 )养殖周期为 1个月 ,鲍苗分别取自福建东山、广东汕尾及广东陆丰的养鲍场。结果显示 ,直接抽取海水的养殖池 2 4h内有机沉积物含量分别为单过滤海水池和双重过滤海水池的 4 .9和 5 .1倍 ,而不同处理海水养殖池中有机沉积物与鲍苗的成活率呈密切相关 ;2 4h内的补水量对水体理化因子及杂色鲍成活率影响极显著 ,未换水组的氨氮含量、弧菌数分别为“5倍补水组”的 1.3和 6 .9倍 ,而死亡率则为后者的 2 1.7倍 ;未“倒池”组单位面积的有机沉积物分别为倒池 1、2、3次的 1.2、3.5和 3.6倍 ,氨氮含量分别为 1.73、2 .3和 3.5倍 ,弧菌数量比实验组要大 2～ 4个数量级 ;投喂方式、次数及停喂对水质影响十分明显 ,“3d投喂 1次 +停喂 1次”组的成活率高于其他组 (x2 >x20 .0 5,P <0 .0 5 ) ,水体中的氨氮比其他各组减少 14 9%～ 4 6 2 % ,而弧菌量减少 1     

鲍破腹病的防治技术研究

破腹病是鲍养殖生产中的常见病，每年的3-6月和8-10月为其高发期，外套膜破裂是其最主要症状，病鲍的死亡率可达50-90％。通过研究确认了副溶血弧菌（Vibrio parahaemo-lyticus）为鲍破腹病的致病菌。该菌对鲍具有较强的致病性，注射、创伤、浸泡等多种感染方式皆可引起鲍出现破腹和死亡现象，其对21种常用抗菌药物的敏感性都不太强，中度敏感药物只有庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、新霉素、红霉素、复方新诺明等。通过药敏性、经济性、便捷性比较，确定复方新诺明为鲍养殖生产中破腹病的主要防治药物，有效率达80％以上。     

九孔鲍MSTN基因cDNA克隆及表达

肌肉生长抑制素(MSTN)是转化生长因子β超家族(TGF-β)中参与动物肌肉生长的重要调控因子。为了解MSTN基因在九孔鲍中的功能,本研究采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术从九孔鲍右侧壳肌中获得了MSTN基因c DNA全长,并运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了MSTN在各组织和发育时期的表达水平。结果显示,九孔鲍c DNA全长3 755 bp,其中5′非编码区(5′UTR)324 bp,3′非编码区(3′UTR)1 985 bp,开放阅读框(ORF)1 446 bp,编码481个氨基酸,分子质量为54.96 ku,理论等电点p I为9.41;具有N端信号肽(1~17 aa)、TGF-β前肽区域(157~367 aa)和成熟肽区域(379~481 aa),以及蛋白酶水解位点RRPR(364~368 aa)和C端生物活性区9个保守的半胱氨酸残基,符合TGF-β超家族蛋白典型结构特征,且预测到2个新的蛋白酶水解位点RQRR(120~124 aa)、RYRR(235~239 aa)。系统进化树结果显示,九孔鲍MSTN基因和红鲍MSTN基因聚为一支。q RT-PCR结果表明,九孔鲍MSTN基因在检测的6个组织中均表达,且在足、右侧壳肌、外套膜中高表达,在鳃、性腺、肝脏中低表达;在检测的7个发育时期均表达且在受精卵、原肠胚、稚鲍时期高表达,在卵、4细胞期、8细胞期、幼鲍时期表达量较低。研究表明MSTN基因可能在九孔鲍肌肉生长中具有重要作用。