条斑紫菜叶状体细胞的发育与分化

条斑紫菜壳孢子经室内10～80d培养后长成的叶状体分别被酶解成单个细胞，后者在液体培养基中发育成正常叶状体、畸形叶状体、细胞团、性细胞囊等10种不同类型的再生体，它们的形态与结构、细胞排列与大小，放散单孢子难易程度及最终发育结果等均不同。来自日龄不同的种藻的细胞，其再生体类型的数目和各类再生体的百分数不同。当种藻日龄为10～30d时，在它们的单离细胞再生体中出现了极少的细胞团，正常叶状体和具假根畸形叶状体的百分数随着种藻日龄的增加，急剧减少，但不具假根．的畸形叶状体百分数却随着种藻日龄的增加而增加。当种藻日龄大于40d以后，它们的单离细胞就几乎不能直接再生成正常叶状体。随着种藻日龄的增加，细胞再生体中不具假根的畸形叶状体百分数也显著减少，而细胞团的百分数急剧上升，精子囊和果胞子囊的数量也逐渐上升。来自同一藻体不同部位的细胞，在它们的再生体中，随着细胞所处藻体部位的上移，正常叶状体和畸形叶状体的百分数急剧减少，而细胞团百分数却不断增加。上述结果说明，在离体条件下，条斑紫菜叶状体的单离细胞发育成不同类型的再生体，是由于它们在种藻里处于不同分化阶段的缘故；同时，初步得出在条斑紫菜叶状体的发育过程中，从壳孢子细胞分化成性原细胞的过程可分为8个不同的分化阶段。     

坛紫菜体细胞单克隆叶状体途径及海上养殖

用海螺酶酶解坛紫菜叶状体制备游离的营养细胞,在显做镜下挑选出单个细胞放入96孔板,在20℃,1500～2000 lx,12D:12L条件下进行隔离培养。一部分细胞直接发育形成了叶状体:一种途径是单个细胞通过典型的两级分裂发育成叶状体,也有一些单细胞先形成叶片状的细胞团,然后在细胞团一端形成假根;另一种途径是部分单细胞先形成“愈伤组织”,经过一段时间培养后放散出类似“孢子”的细胞,其中部分“孢子”发育成叶状体。由单细胞克隆培养获得的叶状体经组织培养形成纯合丝状体,这种纯系丝状体扩大培养后转入传统的育苗途径下海养殖。纯系在苗网附着率、叶片质量和性成熟时间等经济性状方面比未经选育的普通种有优势。     

条斑紫菜营养细胞的分离培养试验

本文介绍了用条斑紫菜的单个营养细胞培养成叶状体的试验。试验表明，单个营养细胞，在适宜的培养液中有可能经过20天培养成小紫菜叶状体；其成活率为33％左右。此外，还介绍了冷冻度夏后的叶状体单个营养细胞的培养试验和不同含水量的叶状体营养细胞的培养试验。     

条斑紫菜叶状体细胞对3种抗性筛选剂敏感性的研究

为探讨条斑紫菜叶状体细胞对3种抗生素的敏感性,以确定条斑紫菜遗传转化后代适宜的抗性选择质量浓度,将叶状体用海螺酶解离获得原生质体,在培养皿中20℃培养3d后,在培养液中分别加入G418(0、10、50、100、200、300mg/L)、卡那霉素(0、50、100、300、500、800mg/L)或氯霉素(0、5、15、35、65、100mg/L),观察细胞分裂与死亡率、小紫菜比率,进行显著性检验。试验结果表明,条斑紫菜叶状体细胞对3种抗生素的敏感性存在显著差异,对抗生素的敏感性为氯霉素卡那霉素G418。在条斑紫菜叶状体遗传转化用G418、卡那霉素或氯霉素作抗性筛选时,筛选质量浓度分别为300、50mg/L及15~35mg/L。     

坛紫菜体细胞的连续克隆培养和悬滴培养

随着用于分离海藻体细胞和原生质体工具酶的增多,近几年来,海藻单离细胞和原生质体的培养取得了较大进展,特别是对一些经济海藻如海带、紫菜的原生质体培养,国内外均进行了大量研究。严兴洪等把坛紫菜叶状体体细胞的复杂发育分化趋势初步归结成八类,并且建立了坛紫菜叶状体体细胞的分化模型。阐明坛紫菜叶状体体细胞的发育分化规律,不仅能为利用坛紫菜体细胞直接快速采苗,改进传统采苗工艺的新技术提供科学的理论依据,而且对于开展坛紫菜体细胞与其它紫菜间的细胞融合的正确选材以及细胞融合以后的杂种筛选等研究均具较大意义。为此,我们对坛紫菜叶状体体细胞进行了连续数代克隆培养。单个细胞培养在高等植物中已获成功,但在海藻细胞培养中还未见报道,探讨单个细胞培养途径,对开展海藻细胞工程研究具重要价值。结果报告如下:     

条斑紫菜南移福建养殖的研究

条斑紫菜系我国长江以北的养殖品种,1986年和1987年南移福建连江进行了丝状体育苗和叶状体养殖,均获成功。叶状体产量折合亩产干品67.9公斤。条斑紫菜南移存在的主要问题是:丝状体育苗时间长,温度高;叶状体则是生长期短,产量低。实行坛紫菜和条斑紫菜轮养,可提高紫菜的产量和经济效益。     

尿囊素对印度产紫菜Pyropia chauhanii单孢子放散和体细胞分化的影响

为探讨尿囊素对印度产紫菜Pyropia chauhanii单孢子形成与放散的影响,选用能释放单孢子的野生型品系(PC-WT)与不能释放单孢子的诱变品系(PC-Y1)为实验材料,用含不同浓度尿囊素的培养液分别培养来自叶状体梢、中和基部的圆盘体。结果显示,处理后6 d,不同部位的叶状体圆盘体的单孢子放散量次序为中部梢部基部;随着尿囊素浓度的增加,PC-WT品系叶状体圆盘体的单孢子放散总量呈先升后降的趋势,其中10mmol/L是促进单孢子放散的最适浓度;但尿囊素并不能使原本不放散单孢子的PC-Y1品系释放单孢子。用含20 mmol/L尿囊素的培养液培养PC-Y1品系的叶状体圆盘体,8 d后再用酶解法将其体细胞单离出来经体外培养后发现,经尿囊素处理的单离细胞发育成丝状体的百分率为66.1%,而不含尿囊素的对照组仅为15.2%,说明尿囊素对紫菜叶状体的体细胞向生殖细胞分化具一定的促进作用。     

紫菜属海藻色素突变的研究

使用化学诱变剂MNNG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)对条斑紫菜、坛紫菜、少精紫菜和华北半叶紫菜的叶状体、丝状体和壳孢子进行诱变,研究与分析了紫菜属海藻色素突变的发生与表达。结果显示,在合适的诱变剂量范围内,紫菜各生长阶段藻体均发生较高的突变率,但突变的表达特征不同。叶状体以细胞为单位发生点状突变,突变细胞的生长形成了各种突变斑块的无序镶嵌,显示单倍体细胞的致变结果。经诱变的丝状体虽表现较低的突变率,然而诱变引发的突变却主要在后代叶状体中表达,显示为二倍体细胞的突变表达规律。壳孢子突变随萌发个体的细胞分裂被立即表达,显示细胞倍性发生变化的遗传特征。本文还讨论了色素突变表达规律显示的减数分裂过程及其对藻体形态建成的影响。     

主推品种紫菜

[品系来源]自然野生或养殖性状良好的紫菜.上海水产大学利用自然的野生坛紫菜叶状体,通过人工诱变、体细胞克隆和单陛生殖等技术,获得坛紫菜的变异细胞,将变异细胞单个分离并培养成完整叶状体,选育出性状稳定的优良坛紫菜新品系,如"申福1号"、"申福2号"等.     

紫菜

【品系来源】自然野生或养殖性状良好的紫菜。上海水产大学利用自然的野生坛紫菜叶状体，通过人工诱变、体细胞克隆和单l生生殖等技术，获得坛紫菜的变异细胞，将变异细胞单个分离并培养成完整叶状体，选育出性状稳定的优良坛紫菜新品系，如“申福1号”、“申福2号”等。江苏省海洋水产研究所院内的“国家级紫菜种质库”，率先开展紫菜遗传学与育种学研究，建立了完整的紫菜种质保存与应用技术体系，有效改善了紫菜栽培生产种源混乱、种系品质低下的状况。     

干燥和模拟酸雨胁迫对条斑紫菜光合作用的影响

探讨了条斑紫菜在干燥和酸雨胁迫时叶绿体光系统Ⅱ最大光化学量子产量的变化。试验结果表明,条斑紫菜在干燥3 h后脱水94.5%,光合作用停止,复水后迅速恢复其原有的光合能力。刚脱水的条斑紫菜在未干燥时如遭遇酸雨,其最大光化学量子产量随pH降低和时间延长而降低。试验中最低的pH 4.0酸雨处理6 h后,复水6 h仍能恢复光合能力。如干燥脱水后遭遇酸雨,除pH 5.6处理1h组经过24 h恢复,可基本达到原有的光合能力外,pH 4.5组24 h内不能恢复。而pH 4.0组藻体变红死亡。如干燥后酸雨处理3 h,pH 5.6和pH 4.5组均受到严重伤害,而在24 h内不能恢复正常光合能力,pH 4.0组趋于死亡。说明干燥脱水和酸雨的双重胁迫,严重危害条斑紫菜的生存,可能造成条斑紫菜养殖的严重减产。     

环境因子对海萝藻体生长及成活的影响

研究了温度、光照强度、盐度和营养盐对海萝（Gloiopeltis furcata）藻体生长的影响以及 pH、干露、淡水浸泡对藻体成活的影响。海萝藻体分别培养在不同温度（10℃、14℃、18℃、22℃和26℃）、不同光照强度（2500 lx、4500 lx、6500 lx、8500 lx 和10500 lx）、不同盐度（15.5、18.0、20.5、23.0、25.5、28.0、30.5、33.0、35.5和38.0）和添加不同质量浓度的营养盐[硝酸钠（NaNO3）10 mg·L -1、20 mg·L -1、40 mg·L -1、80 mg· L -1和相对应的磷酸氢二钾（K2 HPO4）1 mg·L -1、2 mg·L -1、4 mg·L -1、8 mg·L -1]21 d。结果表明,海萝藻体生长的最合适温度为10～14℃,光照强度为6500～10500 lx,盐度为18～38;不同营养盐质量浓度对藻体生长的影响不明显。海萝藻体在不同 pH（5.5～10.0）条件下培养10 d,结果显示藻体正常成活的 pH 范围为6.5～9.0。海萝藻体分别经不同时间的阴干、泡淡水、晒干,结果显示阴干24～48 h 或泡淡水24～48 h 以下藻体仍然能够正常成活;阴干3 h 后泡淡水3 h,藻体也能正常成活;在阳光下晒干超过2 h,藻体不能正常成活。     

6株水产动物源气单胞菌安徽分离株的毒力基因的克隆与序列分析

根据气单胞菌主要黏附素基因（ahal）、溶血素基因（hly）和细胞兴奋性肠毒素基因（alt）完整开放阅读框（0RF）设计3对特异性引物，对6株气单胞菌安徽分离株进行ahal、hly和alt基因的PCR扩增、克隆和测序。测序结果显示，安徽分离株aim、hly和alt基因的ORF大小分别为1056--1068bp、1482bp和1104N1107bp，各编码351-355、493和367-368个氨基酸。序列分析显示：（1）属于alt^＋aim^＋hly^＋毒力基因型的3个安徽分离株间aha1核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性均很高，分别为98.8％-99．3％和97％-97．6％，且与国内参考株mh／Trionyx sinensis／Guangzhou（Guangdong）／AF276639的同源性高达98．5％-99％和96.8％-97．6％。而alt^＋ahal^＋hly^-HA6安徽分离株与国外参考株Ah／Fish／Barcelona（Spain）／AF183931间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性较高，分别为95.8％和97．2％。（2）不同表型种气单胞菌安徽分离株之间及其与国内外其他分离株之间的hly核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性均较高，分别介于88．4％-100％之间和90.8％-98．7％之间。（3）5个安徽分离株（RA16、CA1、HA6、HA7和GA1）之间及其与惟一参考株之间的alt核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性分别高达93．5％-99．9％和80．2％-98．3％，但与BA17分离株间的核苷酸序列同源性（81．6％-81．7％）和推测的氨基酸序列同源性（77．5％-84．9％）均较低。这些结果表明，气单胞菌ahal和alt基因在不同毒力基因型间存在一定差异性，hly基因在不同表型种间存在较高保守性，该基因可作为研制气单胞菌基因工程亚单位疫苗的候选成分。     

鼠尾藻池塘栽培生态观察

2009年3月～2010年7月对鼠尾藻池塘栽培生长情况进行了研究分析。试验根据池塘水环境因子（水温、光照强度、盐度和pH）及鼠尾藻的生长特性,设置了自然苗、人工苗、帘子苗生长对比试验,不同水层、不同流速栽培试验及不同光照强度对鼠尾藻生长影响的试验。结果表明,1）相同试验条件下,自然苗生长最好,帘子苗其次,人工苗生长最慢;2）不同水层栽培结果显示,40～60cm水层鼠尾藻生长最好,其次是O～20cm水层,再次80～100cm水层,150～200cm水层生长最慢,并且于5月中旬即开始衰退脱落;3）流速1m/s条件下鼠尾藻生长最快,随着流速的逐渐降低,鼠尾藻生长也逐渐变慢;4）光照强度为4000～6000lX时鼠尾藻生长良好,高于10000lX或低于3000lX则鼠尾藻生长相对较缓慢。观察发现,池塘水温在12～18℃时鼠尾藻生长最快,在9～12℃和18～24℃时生长较缓慢,24℃以上停止生长并出现腐烂脱落现象。     

北方海区鼠尾藻大规格苗种提前育成技术

通过连续3年的鼠尾藻生产性育苗试验,证明在北方海区提前育苗技术可行。该技术克服了鼠尾藻种苗繁育过程中难以培育出大苗的难题,通过提前50d采苗,缩短室内培育周期,采用种菜人工促熟方法,结合室内及海上培育、管理的各种技术措施,得到的种苗健壮、均匀,整齐。共培育出鼠尾藻大规格苗种3373.7万株,经海上中间培育3个多月后,幼苗直立枝数量3～4根、长度可达4～6cm。     

Effects of formalin treatment on epithelial structure and mucous cell densities in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), skin

Formalin bath treatments of rainbow trout are widely used for control of ectoparasitic infections in fish farms and the effects of this chemical on parasite infections have been studied. In addition, tolerance of the host to various concentrations of formalin are also known. However, effects of formaldehyde on the skin epithelium integrity and mucous cell density still need elucidation. The present study revealed that exposure of rainbow trout fry 2 months post-hatching to various concentrations of formalin affected the mucous cell dynamics of the fish. Limited exposure (50 ppm, 1 h) stimulated mucous cell proliferation as indicated by the slight increase in densities of Alcian blue positive cells in tail fin epidermis. In contrast, high concentrations (200-300 ppm, 1 h) or lengthy exposure (24 h) at lower concentrations caused a decrease in mucous cell density. Scanning electron microscopy revealed effects on the epithelial structure of fish fins. Blebbing of epithelial cell membranes was the first sign of injury. The dilated openings of mucous cells indicated increased release of mucus. Highly irregular organization of the cells followed, with regional differences occurring in different parts of fins. The implications of formalin bathing for susceptibility or resistance of fish to subsequent pathogen exposure are discussed.     

海带“叶烂”病害的初步研究

海带(Laminaria japonica Aresch),自开展人工养殖以来就不断地发生各种病害。其中发生较普遍,危害较大的有“绿烂病”、“白烂病”和“点烂病”三种。“绿烂病”先发生于叶片尖梢并很快地向叶片中部漫延,发病部分由褐色变为绿色,而后腐烂脱落。“白烂病”通常是先发生于叶片尖梢的叶绿,然后向叶片中部发展,发病部分呈现白色。“点烂病”则先是从叶片中部叶绿上或同时于梢部叶绿上出现一些不规则的小白点,随着白点的增加和扩大,使该部叶片变白腐烂或形成一些不规则的孔洞。     

三十烷醇对海带生长和生理活性的影响

在海带夹苗放养前,用0.5～1.0ppm三十烷醇浸苗,能提高叶绿素和岩藻黄素含量,促进光合作用,并可在相当长时间内,提高海带对磷酸盐和硝酸离子的吸收,还可使海带体内核酸含量增加,进而促进海带迅速生长,缩短了放养后的缓苗时间,为产量的形成打下早期生长的基础。     

Disinfection of striped trumpeter (Latris lineata) eggs with glutaraldehyde

This study assessed the effect of immersing striped trumpeter eggs in 0 (control), 200, 400, 800, 1600 or 3200 ppm glutaraldehyde for 10 minutes, two days before hatching. High concentrations of glutaraldehyde (1600 and 3200 ppm) resulted in no eggs hatching and only 1% of eggs hatched after treatment with 800 ppm glutaraldehyde. Hatching success of eggs treated with 0, 200 or 400 ppm glutaraldehyde did not differ (77 ± 6%, n = 3). However, only 2% of larvae from the control treatment survived to day 5 post-hatching, compared to 45 and 69%, respectively of the larvae from the 200 and 400 ppm glutaraldehyde treatment. By day 9 post-hatching, larvae from the 400 ppm glutaraldehyde treatment had significantly higher survival (59%) than larvae from the 200 ppm glutaraldehyde treatment (28%). Thiosulphate citrate bile salt sucrose agar (TCBS) medium confirmed the presence of bacteria within the seawater medium, on all control eggs and on 83% of eggs disinfected with 200 ppm glutaraldehyde, but no bacterial colonies formed on eggs treated with 400, 800, 1600 or 3200 ppm glutaraldehyde. This study found highest survival of striped trumpeter larvae from eggs disinfected with 400 ppm glutaraldehyde and suggests that increased survival was a result of reduced bacterial loading.     

鳜下丘脑神经元细胞培养

通过建立可行,高效的下丘脑神经元细胞技术,为研究鳜鱼的摄食机理与能量代谢奠定基础。分离鳜鱼下丘脑组织,Ⅰ型胶原酶将组织消化成单细胞悬液,用完全培养液进行培养,在培养的第3d、4d、5d、6d观察细胞的形态,结果显示培养第3d时细胞贴壁量少,胞体小并且呈单个分布,在培养第4d细胞的数量显著增多,且具有典型的神经元的形态,胞体饱满,第5d形神经元胞体的融合度进一步增大,突起增长增粗,许多分支互相交错连接而形成密集的神经纤维网络,第6d细胞活性减弱,开始走向凋亡;CCK-8法检测细胞活性,结果显示在培养第5d细胞活性最高;并采用两种方法对神经元细胞进行鉴定,结果显示RT-PCR检测发现培养的下丘脑细胞可以表达神经元特异基因noggin,经免疫荧光鉴定下丘脑神经元细胞纯度为95.9%。这些结果表明通过此培养方法能够获得纯度较高的鳜鱼下丘脑神经元细胞,为进一步在细胞水平研究鳜鱼的摄食机理与能量代谢相关机理奠定基础。