人工感染淋巴囊肿病毒牙鲆的免疫球蛋白水平变化

用患淋巴囊肿病牙鲆体表肿瘤纯化的淋巴囊肿病毒对健康牙鲆进行人工感染,应用抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体通过间接酶联免疫法（ELISA）检测感染之后的牙鲆血清总抗体水平和抗LCDV特异性抗体水平的变化规律。结果表明,感染7d后,牙鲆血清中特异性抗体和总抗体水平都显著升高。抗LCDV特异性抗体水平在405nm处的OD值从对照的0.129上升至0.238;随着感染时间延长抗体水平持续升高（第14天0.247,第21天0.410）,在第28天达到最高值0.436,然后开始缓慢降低（第35天0.385,第98天0.357）;总抗体水平在405nm处的OD值从对照的0.135上升至0.250;随着感染时间延长抗体水平持续升高（第14天0.266,第21天0.561）,在第28天达到最高值0.613,然后开始缓慢降低（第35天0.480,第98天0.475）。通过间接免疫荧光技术（IFAT）在感染第14天以后的牙鲆的肠、胃中检测到病毒。     

应用免疫技术检测牙鲆组织内的淋巴囊肿病毒

应用免疫荧光抗体技术(IFAT)和标记链亲和素-生物素(LSAB)免疫组化法对患淋巴囊肿病牙鲆(Paralichthys olivaceus的肝、脾、肾、胃、幽门、肠、心脏、性腺、鳃、表皮10种组织进行了检测，结果发现体表有囊肿症状病鱼的胃、肠、鳃和表皮组织内有淋巴囊肿病毒存在；体表未见囊肿症状病鱼的胃、肠和表皮组织内也检测到了病毒，说明这两种免疫技术可以应用于牙鲆淋巴囊肿病的检测与诊断。同时本文还对淋巴囊肿病毒通过消化道感染的可能进行了探讨。     

淋巴囊肿病毒27.8 ku受体蛋白在牙鲆组织中的分布

应用抗牙鲆淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus,LCDV)受体蛋白(27.8 ku)的单克隆抗体(2G11和3D9)定位LCDV受体蛋白在牙鲆组织中的分布。通过对牙鲆外周血、白细胞、鳃、胃、肠、表皮、肝脏、头肾、体肾、脾、性腺、脑、心脏等进行LCDV受体蛋白的间接免疫荧光与免疫组织化学定位观察,发现在牙鲆外周血白细胞的细胞膜、鳃上皮细胞、表皮、胃黏膜上皮细胞顶端、肠上皮细胞、肝细胞、脾表层结缔组织细胞及头肾后端的肾小管上皮细胞内均有较强的阳性信号,表明这些部位分布有LCDV的27.8 ku受体蛋白,但在体肾、性腺、脑、心脏及外周血红细胞中未观察到阳性信号。推测LCDV通过与鳃、表皮及消化道上皮的受体结合进入牙鲆体内,通过与外周血白细胞上的受体结合侵染白细胞而进入血液循环,进而感染肝脏、脾脏、头肾等器官。     

温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响

在9℃、15℃、21℃和26℃4种不同水温下,用淋巴囊肿病毒(LCDV)灭活疫苗腹腔注射牙鲆,应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)研究了其皮肤黏液中特异性抗体水平的变化,以分析温度对牙鲆皮肤黏液抗体产生的影响.ELISA结果表明,9℃和15℃水温下牙鲆黏液OD值分别在注射LCDV后第9周和第7周达到峰值(9℃:OD=0.179; 15℃:OD=0.233); 21℃水温下OD值上升最快,5周达到峰值(0.316); 26℃水温下OD值较21℃无显著差异,也于5周达到峰值(0.295).采用硫酸铵分步盐析等技术粗提不同温度下OD值最高时的牙鲆皮肤黏液中的免疫球蛋白(Ig),SDS-PAGE检测发现,各温度组黏液蛋白中均含有72 kD和26 kD蛋白条带.Western blotting结果显示,抗牙鲆血清Ig重链的单克隆抗体只与黏液蛋白中72 kD条带发生反应,确定为牙鲆皮肤黏液Ig重链.综上结果表明,牙鲆在最适生活温度(21℃)下,抗体应答强度最大.牙鲆粗提黏液蛋白中Ig的初步确定,为探索牙鲆黏液免疫机制提供了材料.     

鱼肠道弧菌单克隆抗体流式细胞术检测技术的研究

以抗鱼肠道弧菌单克隆抗体为基础,结合流式细胞术,根据荧光信号强弱比例确定检测鱼肠道弧菌时所需单克隆抗体的最优反应量为200μL,最佳反应时间为45min。在最优反应条件下,抗鱼肠道弧菌单克隆抗体可特异性识别鱼肠道弧菌,阳性荧光信号比例达12.9%;对不同密度的鱼肠道弧菌进行重复性试验,变异系数均在5%以内,说明流式细胞术具有较好的精密度;人工感染健康牙鲆试验表明,流式细胞术检测法能快速从发病鱼的鳃、肝、脾、肾、腹水等部位检测出病原菌,而对照组为阴性;本试验建立的鱼肠道弧菌单克隆抗体流式细胞术检测技术为鱼肠道弧菌的快速检测提供了新方法。     

牙鲆血清免疫球蛋白的分离纯化及部分特性分析

运用Sephacryl S-200凝胶层析和HiTrap rProtein ASepharose亲和层析2种方法对牙鲆(Paralichthys olivaceus)血清免疫球蛋白进行分离纯化,结果表明,牙鲆免疫球蛋白分布于33%~50%的硫酸铵饱和溶液中,其中45%的分离效果最好。凝胶层析和亲和层析样品均出现2个蛋白峰,用还原SDS-PAGE检测确定牙鲆免疫球蛋白存在于第2个蛋白峰中。牙鲆免疫球蛋白重链分子量约为75.4 kD,轻链分子量约为29.9 kD和28.2 kD,推测牙鲆血清免疫球蛋白的分子量为836 kD。制备了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体,免疫双扩散法检测多克隆抗体效价为1∶32,免疫斑点法检测多克隆抗体效价至少为1∶1 600。运用免疫印迹法(Western-bloting)检测了兔抗牙鲆免疫球蛋白多克隆抗体的特异性,实验证明该抗体与牙鲆全血清中免疫球蛋白重链、轻链反应均成阳性。     

IBR病毒抗体竞争ELISA检测方法的建立

试验建立了IBR病毒抗体竞争ELISA检测方法,并进行了验证。经试验研究,封闭液用1.5%Casein酪蛋白、包被液用0.02M的PB溶液、包被浓度为1/1 000,酶标单抗浓度为1/1 000,酶稀释液为小反刍酶稀时,该IBR病毒抗体竞争ELISA检测方法的灵敏度和稳定性最佳,此时的板内变异系数为7.7%,板间变异系数为9.41%,均低于10%,且热稳定性良好。试验建立的竞争ELISA抗体检测方法具有良好的稳定性、特异性和灵敏度,可用于IBR病毒抗体的检测。     

抗犬瘟热高免卵黄抗体IHA检测方法的建立

目前检测卵黄抗体的方法很多,但IHA方法具有简便快速的优点,本研究的目的是为了建立抗犬瘟热高免卵黄抗体检测方法。采用犬瘟热病毒和犬细小病毒二联疫苗处理作为疫苗抗原,用犬瘟热病死犬的肝脏部分处理后作为组织抗原,制备敏化绵羊红细胞,用IHA方法确定了犬二联疫苗抗原和犬瘟热病毒组织抗原的最适含量。二联疫苗提取抗原的含量为0.7 mg/mL致敏红细胞时,与犬瘟热单克隆抗体反应显著,抗体效价为1∶256;而患犬瘟热松狮犬的肝脏组织抗原蛋白浓度为0.5mg/mL,与犬瘟热单克隆抗体反应显著,抗体效价为1∶128。经过IHA验证,制备的松狮犬瘟热肝组织抗原,蛋白含量0.5 mg/mL 1%致敏红细胞,对应的单抗、鸡血清均出现了凝集,阳性对照也出现凝集,阴性对照未出现凝集。建立的IHA抗体检测方法,为准确检测制备抗犬瘟热高免卵黄抗体的效价奠定了基础。     

牙鲆淋巴囊肿病毒一抗原蛋白的确认及定位

以牙鲆淋巴囊肿病毒（LCDV）为抗原免疫Balb/c小鼠，而后将小鼠脾细胞与P3U1骨髓瘤细胞融合，以囊肿组织冰冻切片的免疫荧光染色筛选杂交瘤细胞，阳性结果显示特异性块状荧光信号集中在囊肿细胞的细胞质边缘部分，且多个荧光信号相连呈现链圈状，有限稀释 法克隆阳性杂交瘤细胞，三次克隆后获得4株稳定产生抗LCDV抗体的单克隆杂交瘤细胞株（1A8、1D7、2B6、2D11）。应用Western-blotting法分析单抗识别蛋白的分子量，结果显示，单抗1D7 和2B6均能特异性结合一条分子量116 kD病毒多肽；应用免疫电镜技术定位单抗识别的抗原决定簇，结果发现胶体金颗粒集中吸附在病毒粒子衣壳周围，且背景清洁，无散在的金颗粒或其他污染物。实验结果说明分子量约为116 kD的蛋白多肽为LCDV病毒衣壳蛋白，且具有线性抗原决定簇。     

指状拟舟虫诱导牙鲆抗血清免疫球蛋白分析

对引起牙鲆体表溃烂的原纤毛虫－指状舟虫诱导牙鲆免疫反应产生的免疫球蛋白ＩｇＭ进行分析，结果表明，病原纤毛虫免疫注射牙鲆 ，可诱导牙鲆发生特异性免疫反应，产生抗体型上鲆抗指状拟舟虫血清的凝集试验，发现纤毛虫停止游动并发虫体聚集；抗血清经与标准分子量和鼠ＩｇＭ单克隆抗体以及对照血清的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳比较分析证明，牙鲆抗指状拟舟虫血清免疫球蛋白ＩｇＭ重链分子量为７１０００，轻链分子量为２３０００；Ｉ