鳜胃蛋白酶原基因cDNA全长的克隆与序列分析

利用RT–PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆鳜(Siniperca chuatsi)胃蛋白酶原基因cDNA全长序列，并对该基因的结构特征和系统进化关系进行了分析。鳜胃蛋白酶原基因cDNA序列全长1367 bp，5′端非翻译区43 bp，3′端非翻译区187 bp，开放阅读框(ORF)1137 bp，共编码378个氨基酸。鳜胃蛋白酶原氨基末端存在信号肽和激活肽序列，序列中含有催化活性必需的2个天冬氨酸残基和构成二硫键的6个半胱氨酸残基。鳜胃蛋白酶原氨基酸序列与其他脊椎动物胃蛋白酶原氨基酸序列的同源性为59.9%～91.2%，表明胃蛋白酶原基因在脊椎动物的长期进化中比较保守。鳜胃蛋白酶原基因的成功克隆不仅为进一步研究该基因的时空表达奠定基础，而且为鱼类胃蛋白酶原的分子特征和进化提供了新的资料。     

鳜三种生长抑素cDNA全长克隆、组织表达及其在脑中定位分析

利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了鳜脑中3种生长抑素前体(preprosomatostatin,PSSⅠ、PSSⅡ和PSSⅢ)cDNA全长序列。结果显示,鳜PSSⅠcDNA全长647 bp,含开放阅读框369 bp,共编码122个氨基酸,前26个氨基酸为信号肽,C端SS-14在脊椎动物中非常保守;PSSⅡcDNA全长655 bp,开放阅读框387 bp,编码128个氨基酸,前25个氨基酸为信号肽,C端带有[Tyr7,Gly10]SS-14;PSSⅢcDNA全长823 bp,开放阅读框333 bp,共编码110个氨基酸,前21个氨基酸为信号肽,C端带有[Pro2]SS-14。利用RT-PCR检测了鳜PSS mRNA的组织表达特征,3种PSS mRNA均在脑中表达,PSSⅠmRNA在其他组织中未检测到表达,PSSⅡmRNA在食道和胃中大量表达,PSSⅢmRNA在肾和性腺中大量表达。推测3种PSS除一致参与神经调控外,PSSⅡ还可参与消化作用调控,PSSⅢ参与调控生殖作用。脑组织原位杂交分析表明,PSSⅠmRNA在下丘脑和延脑中表达,PSSⅡmRNA在下丘脑中表达,PSSⅢmRNA在下丘脑、视觉盖、延脑和脊髓中表达。3种PSS均在下丘脑中表达,表明它们可能参与腺垂体激素分泌的调节;在其他脑区存在表达差异,推测它们还可作为神经递质或调节因子,发挥不同的生物学效应。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成纤维细胞生长因子8的cDNA克隆及特征分析

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为实验对象,利用RACE技术克隆了草鱼成纤维细胞成长因子8(Fibro-blast Growth Factor8,FGF8)cDNA序列。实验结果显示,草鱼FGF8 cDNA序列长度为887 bp,其中5′-非翻译区长100 bp,3′-非翻译区长157 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,编码210个氨基酸的前体蛋白,包含22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。利用已知的FGF8序列绘制系统发育树,发现草鱼与两种鲤科鱼(班马鱼、墨西哥脂鲤)聚为一簇,显示亲缘关系很近,而与其它脊椎动物如两栖类、鸟类、哺乳类的亲缘关系则相对较远,这与形态分类学的结果一致。此外,还通过生物信息学分析,揭示了草鱼FGF8的分子结构特征。     

草鱼ghrelin基因的分子克隆与组织分布及其摄食调控作用分析

ghrelin是一种在脊椎动物摄食调节过程中起重要作用的脑肠肽,具有明显的摄食促进作用。实验利用同源克隆技术获得了草鱼ghrelin基因的cDNA序列和DNA序列,其中cDNA序列全长506 bp,包括90 bp的5′端非编码区(5′-untranslated region,5′UTR),312 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),以及104 bp的3′端非编码区(3′-untranslated region,3′UTR)。开放阅读框编码的103个氨基酸的ghrelin前体肽,经剪切加工后形成含有19个氨基酸的成熟肽。氨基酸序列分析结果显示,草鱼ghrelin与硬骨鱼类ghrelin相似度最高,而与其他脊椎动物相似度较低,同时草鱼ghrelin成熟肽N端的"活性中心"(active core)为鲤科鱼类中常见的GTSF形式。与大多数硬骨鱼类的ghrelin基因结构相同,草鱼ghrelin基因也包括4个外显子和3个内含子。荧光定量PCR检测到ghrelin mRNA大量分布于草鱼的前肠和脾,脑、肾、肝、肌肉、皮和鳔等组织也有ghrelin mRNA分布。草鱼脑和肠中的ghrelin表达水平在摄食后下降,随着饥饿时间的延长表达水平逐步升高,最后维持在较高水平,表明ghrelin作为摄食启动信号对草鱼的摄食活动起到了促进作用。     

鲈3种视黄醇类X受体基因cDNA的克隆和组织表达

视黄醇类X受体(retinoid X receptor,RXR)属于配体激活的核受体家族,在调节细胞内各种信号途径中起重要作用.采用RT-PCR和RACE技术,分离到鲈RXR基因3种亚型RXRα、RXRβ和RXRγ的cDNA序列.结果表明,得到的RXRα是长度为1 686 bp 3′末端不完整的cDNA序列,其中包括364 bp的5′非翻译区和1 322 bp的编码序列,可编码440个氨基酸.RXRβ cDNA全长为1 741 bp,其中包括150 bp的5′非翻译区,256 bp的3 ′非翻译区和1 335 bp的开放阅读框,共编码444个氨基酸,理论分子量为49.5 ku.RXRγ cDNA全长为1 847 bp,其中5′非翻译区为88 bp,3 ′非翻译区为397 bp,开放阅读框为1 362 bp,共编码453个氨基酸,分子量约为49.9 ku.氨基酸序列分析显示,鲈RXRα、RXRβ和RXRγ和其它物种的RXRs结构类似,在DNA结合区有P box和D box结构,配体结合区包括12个α螺旋和2个β折叠结构,H12的C端含有AF-2的激活区.系统进化树分析表明,鲈RXRα、RXRβ和RXRγ分别与其他动物的相应亚型聚类.组织分布特异性研究表明,鲈RXRα在肌肉、心脏、眼、大脑、肠、肾脏、脂肪、脾脏、鳃和肝脏10种组织中均有表达,但表达量较低；RXRβ在这10组织中都有较高表达,但心脏中表达量较低；在所检测的10种组织中,RXRγ都有表达,在肌肉、肠、肾脏、脂肪和脾脏表达量较高.     

鳜免疫球蛋白 D 重链基因的克隆与表达分析

用RACE-PCR和RT-PCR方法获得鳜(Siniperca chuatsi)膜结合型免疫球蛋白D(Membrane-bounded IgD,mIgD)重链基因的全长cDNA序列。鳜mIgD的cDNA全长为3358bp,其5l非编码区包含30bp,3l非编码区包含337bp;开放阅读框包含2991bp,编码996个氨基酸,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。鱼类IgD恒定区氨基酸序列比对结果显示,鳜mIgD存在半胱氨酸和色氨酸保守位点,与其他鱼类IgD的相似性在37%～72%之间。用邻接法(Neighbor Joining)构建的鱼类免疫球蛋白基因的系统发育树表明,鱼类IgD形成独立的一支,鳜mIgD与牙鲆和庸鲽IgD聚为一支。荧光定量PCR结果显示,鳜mIgD的mRNA主要分布于外周血白细胞、胸腺、头肾、中肾和脾脏中。     

军曹鱼dnd基因cDNA克隆及其在性腺周年发育过程中的表达

本研究通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了军曹鱼(Rachycentron canadum)dnd基因(Rcdnd)的cDNA序列,全长1339bp,其中,5'非编码区59bp,3'非编码区173bp,开放阅读框(ORF)1107 bp,共编码368个氨基酸.Rcdnd氨基酸序列含有1段RNA识别保守基序(R...     

虾夷扇贝肌动蛋白基因cDNA序列克隆与分析

采用RT-PCR和RACE法从虾夷扇贝闭壳肌中分离和克隆了肌动蛋白基因cDNA全长序列.肌动蛋白基因cDNA全长1775 bp(不包括poly A),5′端非编码区94 bp,3′端非翻译区551 bp,阅读框1131 bp,编码376个氨基酸.在基因组DNA中,该基因被一个内含子分为两段,内含子位于第42和第43个氨基酸之间,长度为2041 bp.系统发育分析显示该肌动蛋白属于α类型.     

鳜胃蛋白酶原A、胃质子泵基因cDNA全长的克隆与细胞表达定位

利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了鳜全长1 322 bp的胃蛋白酶原(pepsinogen,PG)A2 cDNA序列,含1 131 bp的开放阅读框(ORF),共编码376个氨基酸,氨基酸序列包含信号肽、激活肽和胃蛋白酶3部分,胃蛋白酶部分含有2个天冬氨酸活性位点和3个二硫键。鳜胃蛋白酶 A2与A1在序列组成、理化性质、功能位点、空间结构上存在明显差异,表明它们可能具有不同的催化功能。胃质子泵(gastric H⁺/K⁺-ATPase)是胃酸分泌的关键性酶,研究克隆获得了鳜全长3 581 bp和1 669 bp的胃质子泵α、β亚基cDNA序列。序列相似性分析显示,胃质子泵α亚基具有高度保守性,含多个功能位点,而β亚基具有相对可变性。原位杂交(in situ hybridization,ISH)结果显示,鳜PG A1、PG A2和胃质子泵α亚基mRNA均在胃腺的同一类型细胞中表达,该细胞兼有分泌PG和胃酸的功能,鳜胃腺分泌细胞属于泌酸胃酶细胞。     

日本沼虾细胞自噬基因ATG13和ATG101的克隆及其低氧胁迫下表达分析

为研究自噬相关基因(autophagy-related genes, ATG) ATG13和ATG101在甲壳动物应答低氧胁迫过程中的调节作用,实验采用RACE PCR技术通过克隆测序和基因序列拼接,首次克隆了日本沼虾的细胞自噬基因ATG13和ATG101的全长cDNA序列,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13 cDNA全长2 043 bp (NCBI登录号为MT084347),包括211 bp的5′末端非翻译区(untranslated region,UTR),449 bp的3′UTR和1 383 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),开放阅读框编码460个氨基酸;ATG101 cDNA全长1 051 bp(NCBI登录号为MT084348),包括18 bp的5′末端非翻译区,373 bp的3′UTR和660 bp的开放阅读框,开放阅读框编码219个氨基酸。通过软件和生物信息网站对其序列进行分析,氨基酸相似度比对显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13富含高度保守的LC3作用结构域(LIR);系统进化树分析显示,日本沼虾的细胞自噬基因ATG13与凡纳滨对虾ATG13具有最近的亲缘关系;通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)实验分析发现,日本沼虾ATG13和ATG101在其肝胰腺和脑组织表达量较高,而在肌肉中表达量较低;利用qRT-PCR追踪其在肝胰腺组织低氧胁迫过程中出现的表达差异情况,结果显示,实验组日本沼虾在低氧胁迫6和24 h时,其细胞自噬基因ATG13和ATG101表达量显著高于对照组,而在复氧12 h后,实验组与对照组的ATG13和ATG101表达量差异不显著;Western blot分析结果显示,日本沼虾ATG13和ATG101表达丰度基本与基因表达模式相似。透射电镜分析结果显示,在低氧胁迫6和24 h后,肝胰腺组织中的溶酶体开始出现自噬空泡,表明急性低氧胁迫会诱导自噬体的形成,本研究结果可为了解日本沼虾应对低氧胁迫下的调控机制提供理论参考。     

缢蛏IGFBP基因结构及生长性状相关SNP筛选

类胰岛素生长因子结合蛋白(IGFBP)是IGF系统的一部分,主要参与IGF的运输、定位和生物活性调节。本研究采用RACE技术和长PCR技术,克隆了缢蛏IGFBP基因的cDNA和DNA全长序列,应用荧光定量PCR技术分析了缢蛏不同发育时期和不同组织中IGFBP mRNA的表达特征,并进一步筛选了IGFBP基因与生长性状相关的SNP位点。序列分析表明,缢蛏IGFBP cDNA序列全长631 bp,包括5'端非编码区60 bp,3'端非编码区136 bp和开放阅读框435 bp,编码144个氨基酸。该基因含有保守的IGFBP-N端,包含12个半胱氨酸残基,其中1～18个氨基酸为信号肽,属于分泌型蛋白。IGFBP DNA全长3 122 bp,其中包含1个内含子(2 687 bp)和2个外显子(200和235 bp)。荧光定量PCR结果显示,IGFBP mRNA在消化腺组织中表达量最高;在缢蛏的稚贝期,IGFBP mRNA呈现高表达,而在其他发育时期表达量低。在IGFBP基因中筛选到4个SNP位点,其中1个SNP位点与缢蛏的壳长和体质量呈显著相关。     

文蛤C1q基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究

利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤C1q基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸。在文蛤C1q(MmC1q)蛋白中,C1q结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的C1q结构域均具有较高的同源性。通过荧光实时定量PCR,MmC1q mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高。在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,C1q相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmC1qmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍。包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmC1q重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性。     

斑节对虾天门冬氨酸转氨酶基因的克隆及氨氮胁迫条件下的表达分析

为了探索天门冬氨酸转氨酶(AST)在斑节对虾(Penaeus monodon)氨氮(NH3-N)解毒代谢中的作用,该研究利用RACE技术获得了斑节对虾AST基因(PmAST)的cDNA全长序列,进行了相关生物信息学分析,在此基础上采用荧光定量与氨氮胁迫实验的方法研究了PmAST基因在斑节对虾的不同组织以及不同浓度氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 957 bp,开放阅读框(ORF)为1 242 bp,3'非编码区(UTR)为584 bp,包括含有30个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为131 bp。ORF可编码413个氨基酸,预测分子量为45.852 kD,理论等电点为8.85。序列含有1个AAT-like超家族结构域、15个磷酸化位点和2个糖基化位点。PmAST的mRNA在斑节对虾各组织中都有表达,在肝胰腺中表达量最高,其次为鳃组织,在胃和脑组织中的表达量最低。96 h氨氮胁迫后荧光定量PCR分析结果表明,PmAST在肝胰腺和鳃组织中都具有不同程度的表达上调,显著高于对照组(P0.05)。研究结果表明斑节对虾的PmAST基因在氨氮胁迫条件下会出现表达上调,并且氨氮浓度越高其上调幅度也越大,所以PmAST参与了斑节对虾的急性氨氮胁迫应答。     

军曹鱼MHC-Ⅰα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法，得到1330bp的军曹鱼（Rachycentroncanadum）MHC-Ⅰα全长cDNA片段。该序列包括76bp的5’末端非编码区（UTR），189bp的3’UTR及1065bp的开放阅读框（ORF），编码354个氨基酸，预测其蛋白质分子量约40．10kDa，等电点5．70。构建MHC-Ⅰα氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸相似性比对，结果表明，军曹鱼和已知鱼类及人类（Homosapiens）MHC-Ⅰα氨基酸的同源性在27．9％～67．1％之间。所推测的蛋白序列具有一些重要特征，包括前导肽、α1、α2、α3区、CP／TM／CYT区和保守的半胱氨酸等。Real—timePCR检测结果显示，MHC-Ⅰα基因在各个正常军曹鱼组织中均表达，但表达量各有不同，其中较强的表达于头肾；中等程度表达于鳃、脾和肠；在心、脑和肌肉中表达较弱。     

建鲤MHC class Ⅰ基因全长cDNA的克隆与序列分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法克隆了建鲤(Cyprinus carpio var.jian)MHC class Ⅰ基因全长cD-NA并进行了序列分析.结果显示:实验得到了1914 bp的建鲤的MHC class Ⅰ全长cDNA序列;建鲤MHC class Ⅰ基因包括1044 bp的开放阅读框(ORF),11...     

卵形鲳鲶消化酶活性的研究I．成鱼和幼鱼消化酶活性在不同消化器官中的分布及其比较

比较研究了卯形鲳够（Trachinotus ovatus）成鱼和幼鱼阶段消化酶（蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶）在不同消化器官中的活性。结果表明：1）成鱼蛋白酶在不同消化器官中的活性大小依次为胃〉前肠〉中肠〉幽门盲囊〉后肠〉肝；淀粉酶活性为前肠〉后肠〉幽门盲囊〉中肠〉肝〉胃；脂肪酶活性为前肠〉中肠〉后肠〉幽门盲囊〉肝〉胃。2）幼鱼蛋白酶在不同消化器官中的活性大小依次为胃〉肠〉幽门盲囊〉肝；淀粉酶活性为肠〉幽门盲囊〉肝〉胃；脂肪酶活性为肠〉幽门盲囊〉肝〉胃。3）成鱼不同消化器官中蛋白酶和淀粉酶的活性均小于幼鱼，成鱼胃和幽门盲囊的淀粉酶活性与幼鱼的差异显著；幼鱼胃脂肪酶活性大于成鱼，但其他器官的活性均小于成鱼。卵形鲳鳕幼鱼不同消化器官中的3种消化酶活性大小顺序与成鱼基本相似。     

瘤背石磺肌肉生长抑制素基因的克隆及组织表达分析

为探究石磺由海洋向陆地进化过程中肌肉生长和发育的分子机制,实验以石磺科贝类转录组数据为基础,采用RACE方法从瘤背石磺肌肉中首次克隆到MSTN cDNA的全长并做了相应的组织表达分析。结果显示,瘤背石磺MSTN基因cDNA全长2667 bp,包括1650 bp的开放阅读框,374 bp的5′端非翻译区,643 bp的3'端非翻译区,共编码549个氨基酸。预测该基因编码的蛋白质原子总量为8776,分子式为C2774H4331N783O862S26,分子质量约为63.27 ku,理论等电点为6.02,信号肽预测结果显示,N端具有21个氨基酸长度的信号肽。瘤背石磺MSTN具有MSTN的共同特征,包括蛋白酶水解位点RSRR和C端多肽生物活性区以及9个保守的半胱氨酸残基。通过进化树分析,瘤背石磺MSTN与加州海兔MSTN的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,MSTN基因在各个组织中均有表达;含肌纤维组织中的表达量低于内脏器官的表达量,在肝胰腺中的表达量最高,腹足表达量最低。MSTN基因一级结构具有很高的保守性,说明该基因在进化上的限制性和功能的重要性;同时该基因在石磺非肌肉组织中表达,表明该基因不仅有抑制肌肉生长的作用,还参与其他生命活动的调节。     

兰州鲇MyoD基因的克隆与生物信息学分析

为研究兰州鲇(Silurus lanzhouensis)生长性状相关基因,运用RT-PCR、TA克隆和核酸测序等技术对兰州鲇MyoD基因的CDS区及全基因进行克隆和生物信息学分析。获得兰州鲇MyoD基因的完整CDS区序列810 bp(Gen Bank登录号:KT277551)及MyoD基因全序列1 210 bp(Gen Bank登录号:KT339175),包括部分5'端63 bp和3'端58 bp;ORF区含有3个外显子和2个内含子,外显子长度分别为510 bp、80 bp和220 bp,内含子长度分别为156 bp和123 bp,编码269个氨基酸残基组成的可溶酸性蛋白质;预测亚细胞定位MyoD主要分布于细胞核(56.5%),MyoD二聚体结构是一个螺旋-环-螺旋(b HLH)。基于12种鱼类MyoD基因CDS序列构建系统发育树及编码区同源性比较,分析结果表明,MyoD基因编码区在进化过程中比较保守,且兰州鲇MyoD与斑点叉尾、白鲶鱼、蓝鲶鱼之间存在较高的同源性。     

仿刺参纤维胶凝蛋白基因的分子特征及表达分析

纤维胶凝蛋白是非特异性免疫系统中的重要分子。通过转录组测序及cDNA末端快速克隆技术得到一条仿刺参纤维胶凝蛋白基因的全长cDNA序列,并将其编码的蛋白命名为仿刺参纤维胶凝蛋白-1。获得的基因cDNA全长为1951bp,其中5′-末端非翻译区为397bp,3′-末端非翻译区为666bp,开放阅读框为888bp,编码295个氨基酸,N端16个氨基酸为信号肽,信号肽后面有两个G-X-Y重复序列,C端为纤维蛋白素原结构域。采用实时荧光定量PCR方法分析了仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参幼参不同组织及细菌脂多糖刺激后的时序表达规律,结果显示仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参的肠道、呼吸树、体腔细胞和体壁均有表达,且肠道的表达量最高;脂多糖刺激后,4种组织的仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因表达量均有变化,且以肠道和体壁表达量的变化最为显著;此外,仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参4种组织中的表达量变化具有不同的时序性,表明仿刺参纤维胶凝蛋白-1可能在仿刺参免疫应答中起重要作用。